CFH蛋白在家系早發(fā)冠心病血瘀證中的表達及意義

張書萌 李杰 于子璇 陳宇霞 陳杏 陳伶利

〔摘要〕 目的 篩選家系早發(fā)冠心病血瘀證的特異性蛋白，為今后臨床早期診斷和預防疾病提供潛在生物標志物。方法 通過同位素相對標記與絕對定量技術（isobaric tags for relative and absolute quantification， iTRAQ）分析家系早發(fā)冠心病血瘀證患者、家系早發(fā)冠心病非血瘀證患者及健康人的血漿蛋白表達，數(shù)據(jù)分析后得到各組間的差異蛋白表達情況，再經(jīng)差異蛋白篩選標準初步得到疾病的預測蛋白，并使用Western blot驗證預測蛋白。結(jié)果 通過iTRAQ技術共得到差異蛋白75個，其中家系早發(fā)冠心病血瘀證組與健康對照組之間共得到32個差異蛋白，包括22個上調(diào)蛋白與10個下調(diào)蛋白，共涉及429個生物學過程，其與角質(zhì)化、皮膚發(fā)展、蛋白質(zhì)激活級聯(lián)反應等關系最為密切；在代謝途徑金黃色葡萄球菌感染、補體和凝血級聯(lián)、血小板激活等KEGG通路上富集。與健康對照組相比，家系早發(fā)冠心病血瘀證組差異蛋白補體因子H（complement factor H， CFH）表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論 經(jīng)差異蛋白篩選標準得到的CFH蛋白，可作為家系早發(fā)冠心病血瘀證早期診斷的潛在生物標志物。

〔關鍵詞〕 早發(fā)冠心病；血瘀證；同位素相對標記與絕對定量技術；補體因子H

〔中圖分類號〕R256.2? ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.016

Expression and significance of CFH protein in familial premature

coronary heart disease with blood stasis pattern

ZHANG Shumeng1，2， LI Jie1，2， YU Zixuan1， CHEN Yuxia1，2， CHEN Xing1，2， CHEN Lingli1，3*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Key Laboratory of TCM Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Key Laboratory of Pathogeny Biology of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To screen the specific proteins of familial premature coronary heart disease （PCHD） with blood stasis pattern， and to provide potential biomarkers for early clinical diagnosis and prevention of the disease in the future. Methods The plasma protein expressions of familial PCHD patients with blood stasis pattern， familial PCHD patients without blood stasis pattern， and healthy control groups were analyzed by isobaric tags for relative and absolute quantification （iTRAQ）. After data analysis， the differential protein expressions among the groups were obtained to preliminarily get the predicted protein of the disease by the differential protein screening criteria. The predicted protein was verified by Western blot. Results A total of 75 differential proteins were obtained by iTRAQ， of which 32 differential proteins were obtained between the familial PCHD with blood stasis pattern group and the healthy control group， including 22 up-regulated proteins and 10 down-regulated proteins， involving 429 biological processes， which were most closely related to keratinization， skin development， and protein activation cascade reaction; they were enriched in KEGG pathways such as Staphylococcus aureus infection， complement and coagulation cascades， and platelet activation. Compared with the healthy control group， the difference of the expression level of complement factor H （CFH） protein in the familial PCHD with blood stasis pattern group had statistical significance （P<0.01）. Conclusion The CFH protein obtained by the differential protein screening criteria can be used as a potential biomarker for the early diagnosis of familial PCHD with blood stasis pattern.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 premature coronary heart disease; blood stasis pattern; isobaric tags for relative and absolute quantification; complement factor H

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）簡稱冠心病，指冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變，導致血管腔阻塞或狹窄，造成心肌缺血、缺氧或壞死而引起的心臟病。冠心病屬中醫(yī)學“胸痹”“心痛”范疇，其病位在心，病機關鍵為血脈瘀阻，血瘀證為冠心病中最常見的證型之一[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，到2030年，全球?qū)⒂? 300萬人死于心血管疾病[2]。我國心血管病現(xiàn)患病人數(shù)達2.9億，其中冠心病患者1 100萬[3]。而且在未來30年中，冠心病的發(fā)病率與死亡率還將繼續(xù)上升。現(xiàn)階段的人群由于不健康的生活方式、日益增加的社會壓力等，使得冠心病患者的發(fā)病年齡更加年輕，若冠心病患者的首次發(fā)病年齡男性＜55歲、女性＜65歲，又稱為早發(fā)冠心?。╬remature coronary heart disease，PCHD）[4-5]。研究表明，PCHD對比非早發(fā)冠心病而言，其遺傳基礎更突出，遺傳因素占PCHD發(fā)病的一半以上[6]。且患PCHD的概率會隨家族患病成員數(shù)量的增加而成倍增加[7]，家族遺傳型的PCHD在臨床上更加常見。

隨著蛋白質(zhì)組學技術的飛速發(fā)展，這項新技術也逐漸應用到各個領域當中，特別是醫(yī)學研究中，其具備的高精度、高靈敏度及整體性特點不但可以快速發(fā)現(xiàn)與疾病相關的生物標志物，還可深層次研究疾病發(fā)病機制，對中醫(yī)證候的探索也有巨大的參考價值[8]。為此本實驗以家系PCHD血瘀證為研究對象，采用同位素相對標記與絕對定量技術（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）定量分析得到家系PCHD血瘀證的差異蛋白譜，并對差異蛋白進行GO功能與KEGG分析，對篩選出的差異蛋白采用Western blot驗證前期iTRAQ技術結(jié)果，以期為臨床早期診斷家系PCHD血瘀證提供潛在生物標志物。

1 資料與方法

1.1? 一般資料

2019年8至12月在湖南省長沙市湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院、金潤中醫(yī)院的流調(diào)工作中共收集到101例冠心病患者。其中包括男性57例，年齡（68.53±11.20）歲；女性44例，年齡（66.23±10.60）歲。實驗組與對照組樣本篩選流程如圖1所示，8例樣本信息編號如表1。本次研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準（2017.1—2020.12）。

1.2? 診斷標準

1.2.1? PCHD診斷標準? 冠心病診斷標準參考2007年中華醫(yī)學會心血管病學分會公布的“慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南”[9]和“不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南”[10]，診斷PCHD需首次發(fā)病年齡男性＜55歲、女性＜65歲[5]，且冠脈造影提示不少于1支冠狀動脈直徑狹窄≥50%。

1.2.2? 中醫(yī)證候標準? 冠心病血瘀證的辨證標準參照國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標準——《中醫(yī)病癥診斷療效標準》[11]。心血瘀阻證辨證標準：主癥（主要臨床表現(xiàn)）為胸悶心痛，痛如針刺；次癥（次要臨床表現(xiàn)）為面色晦暗/口唇、青紫/爪甲發(fā)青；主要舌象為舌質(zhì)紫暗/舌有瘀斑；主要脈象為細澀/結(jié)代；主癥1項加次癥2項加主要舌脈1項即為心血瘀阻證。其中，血瘀證評分準則依照中國中西醫(yī)結(jié)合學會活血化瘀專業(yè)委員會制定的《冠心病血瘀證診斷標準》[12]，診斷冠心病血瘀證需總評分不低于19分，且血瘀證嚴重程度與評分呈正相關關系。

1.3? 納入標準

（1）符合“1.1”“1.2”中的診斷標準。（2）家系納入標準：“PCHD血瘀證家系”標準為先證者的一級親屬中不少于1人為PCHD血瘀證患者；“PCHD非血瘀證家系”標準為先證者的一級親屬中不少于1人為PCHD非血瘀證患者。根據(jù)PCHD血瘀證先證者狀況，納入符合家系定義標準的一級親屬（包括父母、子女及親兄弟姐妹）的所有人員，不限年齡與性別。并設置相應的健康對照組（即經(jīng)病史調(diào)查、臨床體格檢查和相關生化檢查證明無疾病的生理、心理健康者）。（3）知情自愿參與研究者。

1.4? 排除標準

（1）早發(fā)冠心病首次發(fā)病男性年齡≥55歲或女性年齡≥65歲。（2）冠心病患者兼有以下各種疾病者：①甲狀腺功能亢進性心肌病、糖尿病性心肌病、肺源性心肌病、高血壓性心肌病、風濕性心肌病、貧血性心肌病；②惡性腫瘤、甲狀腺疾病、嚴重肝腎疾病、結(jié)核等傳染病、血液系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病；③精神系統(tǒng)疾病。（3）受檢者依從性差，不能完成全部臨床檢測，資料不全者。

1.5? 樣本采集

每位受試者空腹8 h后，留取肘靜脈血10 mL。其中2 mL血樣用普通采血管收集后于金潤中醫(yī)院檢查血脂指標；2 mL血樣用普通采血管收集后2 h內(nèi)送湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗與病理中心檢查凝血常規(guī)；另外6 mL血樣用EDTAK2抗凝采血管收集，室溫靜置2 min后于2 h內(nèi)送湖南中醫(yī)藥大學科研樓中醫(yī)診斷學實驗室經(jīng)4 ℃ 4 000 r/min半徑10 cm離心12 min后取上清液，用離心管分裝，放-80 ℃儲存?zhèn)溆?。血樣運送時均放于有冰袋的保溫箱中。

1.6? 研究方法

1.6.1? 質(zhì)譜分析? 對選取的家系PCHD血瘀證、非血瘀證患者及健康對照組血樣進行蛋白質(zhì)提取，采用測序級胰蛋白酶進行蛋白質(zhì)的酶解，冷凍并干燥肽段溶液后，以iTRAQ標記試劑盒標記酶切樣品，用113～115標記為M1-1、M1-2、M1-3，116～118標記為M2-1、M2-2、M2-3，119～120標記為Control-1、Control-2，詳見表2。經(jīng)標記肽段除鹽和標記肽段的高pH反相液相色譜分離后，選擇液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph MS/MS，LC-MS/MS）進行蛋白質(zhì)分析。

1.6.2? 數(shù)據(jù)庫處理? 使用Proteome Discoverer（PD）軟件對質(zhì)譜圖進行篩選，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入（version 2.2， thermo Fisher Scientific）后得到符合要求的質(zhì)譜圖。再采用PD內(nèi)嵌的sequest進行搜索，搜庫結(jié)果和上一步篩選的譜圖通過PD軟件進行定性分析；蛋白定量值通過提取iTRAQ報告離子的信號值進行重新計算，其中肽段定量值取中位數(shù)值表示，蛋白定量值為肽段定量值的累加和，選擇差異倍數(shù)＞1.2或＜0.83且P＜0.05表示蛋白表達量的顯著升高或降低進行報告，最后對得到的蛋白數(shù)據(jù)進行GO功能注釋和KEGG分析。

1.6.3? Western blot驗證? 采用Western blot對iTRAQ技術得出的差異蛋白結(jié)果進行驗證，差異蛋白篩選標準：（1）檢索蛋白功能提示該蛋白的生理功能受損可能導致疾病的發(fā)生發(fā)展；（2）該蛋白與冠心病相關研究的文獻報道不多，深入挖掘該蛋白與冠心病的關系仍具有臨床意義；（3）該蛋白在家系PCHD血瘀證與健康對照組之間的差異顯著，但不屬于家系PCHD非血瘀證與健康對照組之的差異蛋白；（4）質(zhì)譜信號掃描檢測中信號強，信噪比S/N高。

重新選取典型的家系PCHD血瘀證組及健康對照組受試者血樣各6例進行Western blot實驗研究。以BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)制膠、樣品準備、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育[內(nèi)參稀釋比例：Transferrin（1∶20 000）]、二抗孵育、顯色/曝光后，最后對實驗結(jié)果進行分析。

1.7? 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用“ｘ±s”表示，經(jīng)正態(tài)性、方差齊性檢驗：方差齊者，兩組比較采用t檢驗，多組比較用方差分析；方差不齊者，使用秩和檢驗。計數(shù)資料采用構(gòu)成比表示，采用？字2檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1? 差異蛋白篩選結(jié)果

iTRAQ技術定量分析后各組間共得到75個差異蛋白，詳見圖2。其中家系PCHD血瘀證組相比健康對照組共得到差異蛋白32個，包括22個上調(diào)蛋白與10個下調(diào)蛋白，兩組間的差異蛋白表達熱圖詳見圖3；家系PCHD非血瘀證組與健康對照組的差異蛋白表達熱圖詳見圖4。

2.2? 差異蛋白GO功能注釋及Pathway功能分析

在家系PCHD血瘀證組與健康對照組的比較中，差異蛋白共涉及429個生物學過程，其與角質(zhì)化、皮膚發(fā)展、蛋白質(zhì)激活級聯(lián)反應等關系最為密切；在代謝途徑金黃色葡萄球菌感染、補體和凝血級聯(lián)、血小板激活等KEGG通路上富集。詳見圖5—6。

2.3? Western blot驗證結(jié)果

再次收集并篩選的6例家系PCHD血瘀證組與6例健康對照組的一般資料比較如表3所示，結(jié)果提示BMI與HDL-C的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），家系PCHD血瘀證組的BMI高于健康對照組，而HDL-C相反，說明HDL-C對人體有保護作用，而家系PCHD血瘀證患者一般體重偏胖；其他一般資料的結(jié)果對比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

根據(jù)上述差異蛋白篩選標準得到差異蛋白CFH（P-value=0.003），其蛋白表達較健康對照組低且P值顯著。在Western blot實驗結(jié)果中顯示（見圖7—8）：家系PCHD血瘀證組CFH的蛋白表達水平較健康對照組相比亦降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與前期iTRAQ結(jié)果相一致。

3 討論

現(xiàn)如今我國CHD患者人數(shù)眾多，且CHD的發(fā)病年齡愈加呈現(xiàn)低齡化趨勢（早發(fā)冠心病）。有研究表明，心血管疾病家族史是PCHD的獨立危險因子之一[7]。在CHD的發(fā)生發(fā)展過程中，家族和遺傳因素起著關鍵作用[13]。血瘀證作為CHD最常見的證型之一，但目前對CHD血瘀證的發(fā)病機制尚未明確，還需繼續(xù)探究。而蛋白質(zhì)組學技術是現(xiàn)階段發(fā)展迅速的新興技術，通過篩選出差異表達的蛋白質(zhì)，得到具有特異性的潛在生物標志物，能為疾病的早期診斷提供有力的輔助證據(jù)。為此本研究采用iTRAQ技術定量檢測家系PCHD血瘀證、非血瘀證患者及正常人間的差異蛋白情況，共得到75種蛋白質(zhì)，其中家系PCHD血瘀證患者與正常人之間共發(fā)現(xiàn)了32種差異蛋白，包括22個上調(diào)蛋白與10個下調(diào)蛋白。經(jīng)差異蛋白篩選后發(fā)現(xiàn)，CFH與本次研究的疾病關系最為密切，Western blot結(jié)果也驗證了前期iTRAQ技術定量檢測結(jié)果的可靠性與真實性，認為篩選出的CFH可作為家系PCHD血瘀證患者的潛在生物標志物。

CFH是存在于血漿中的一種補體調(diào)節(jié)蛋白，為補體激活抑制劑[14]。有報道顯示，補體系統(tǒng)會在人類動脈粥樣硬化病變中被激活，并受到補體成分和補體調(diào)節(jié)蛋白局部合成的積極調(diào)控[15]。在早期動脈粥樣硬化病變處，特別是易損斑塊和破裂斑塊處發(fā)現(xiàn)多個補體途徑來激活補體[16]，CFH作為負調(diào)節(jié)因子在補體旁路途徑發(fā)揮著重要作用，其通過與血清中C3b結(jié)合促進旁路途徑中C3轉(zhuǎn)化酶的滅活，達到抑制冠脈內(nèi)膜表層補體激活，降低了血管炎癥反應，抑制了動脈粥樣硬化的形成[17]。孫彩琴等[18]在研究PCHD患者中血漿CFH濃度檢測及臨床意義時，發(fā)現(xiàn)較正常對照組而言PCHD組的CFH濃度明顯降低，且與CHD的嚴重程度呈負相關關系，其認為是由于血漿中CFH的減少導致調(diào)節(jié)補體的能力下降，使旁路途徑持續(xù)激活而致血管內(nèi)皮損傷，促進了動脈粥樣硬化及CHD的發(fā)展。由此可見，CFH可防止補體系統(tǒng)激活亢進而產(chǎn)生免疫病理反應，具有抗動脈粥樣硬化的作用[19]。

CFH除了通過自身的負調(diào)節(jié)作用來抑制補體系統(tǒng)激活外，還可以通過與C反應蛋白（C-reative protein，CPR）相結(jié)合，下調(diào)促炎活性，在補體C3水平上調(diào)節(jié)補體數(shù)量，干擾LDL-C在粥樣病變斑塊處的新陳代謝，增強對動脈粥樣硬化的抑制作用[20-21]。而且研究發(fā)現(xiàn)，CFH水平在冠狀動脈病變的淺層比深層更大[17]，說明在冠脈病變早期，動脈血管內(nèi)皮表層CFH的水平會增加，拮抗補體的過度激活來抑制炎癥反應的發(fā)生，對抗動脈粥樣硬化的發(fā)生，這也進一步說明了CFH與PCHD血瘀證關系密切。此外，有學者發(fā)現(xiàn)，CFH能與垂體同源盒家族因子3（paired like homeodomain 3，PITX3）產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)，間接抑制纖維蛋白原和膠原蛋白的促血栓作用，在動脈血栓形成過程中發(fā)揮保護作用[22-24]。上述這些研究成果同樣印證了本次實驗結(jié)果，也更加說明CFH的低表達可能是造成家系PCHD血瘀證發(fā)生發(fā)展的因素之一。

當然，本次研究也存在需要改進的地方，雖然通過iTRAQ技術的廣譜篩選和Western lot的二次驗證能夠證明差異蛋白的存在，但人的個體差異較大，加之iTRAQ實驗中樣本量不充足，可能會出現(xiàn)個別差異蛋白因為某個樣本的個體差異導致出現(xiàn)誤差，從而在廣譜篩選中被剔除，故在未來的研究中，對于樣本量的選擇還應有更嚴謹?shù)乃伎己陀嬎?，降低誤差出現(xiàn)的概率。

總之，本次研究通過iTRAQ技術篩選到了家系PCHD血瘀證的差異蛋白譜，獲得了與疾病發(fā)生發(fā)展關的生物學功系緊密能及相關通路，為進一步找到疾病的關鍵病因病機提供了有力參考，并初步篩選出差異蛋白CFH作為家系PCHD血瘀證早期診斷的潛在生物標志物，在蛋白層面為預防本病提供了參考依據(jù)，對未來進一步研究基于中藥干預調(diào)控家系PCHD血瘀證的差異蛋白表達具有重要研究意義與臨床價值。

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