養(yǎng)陰寧神方對去勢小鼠海馬神經(jīng)元突觸的可塑性調(diào)節(jié)

雷華娟 田豐銘 易健 鄧涓 李梓歐 戴金城 郭芬樂 李樂 劉柏炎

〔摘要〕 目的 觀察養(yǎng)陰寧神方對雌性小鼠去勢后認(rèn)知功能的影響。方法 將60只C57BL/6J雌性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，雌激素組，低、中、高劑量組，每組10只。假手術(shù)組僅切開皮膚和腹膜，不摘除小鼠的卵巢；其余各組均進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。假手術(shù)組、模型組均給予等容量的生理鹽水（0.1 mL/10 g），雌激素[雌二醇（estradiol， E2），0.09 mg/kg]組及低劑量組（9.459 g/kg）、中劑量組（18.459 g/kg）、高劑量組（36.99 g/kg）灌胃藥液，均灌胃3周。記錄小鼠術(shù)后傷口愈合時(shí)間，去勢前、去勢1周、去勢4周進(jìn)行水迷宮潛伏實(shí)驗(yàn)和穿梭實(shí)驗(yàn)測試小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。采用ELISA法測定血清E2含量；HE染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)；尼氏染色觀察海馬神經(jīng)尼氏染色陽性細(xì)胞的數(shù)量；共聚焦顯微鏡下觀察小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)情況。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組傷口愈合時(shí)間延長（P<0.05）；與模型組、雌激素組及低、高劑量組比較，中劑量組傷口愈合時(shí)間縮短（P<0.05）。去勢1周，與假手術(shù)組比較，模型組、雌激素組及低、中、高劑量組逃避潛伏期延長、穿梭次數(shù)減少（P<0.05）。去勢4周，與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期延長、穿梭次數(shù)減少（P<0.05）；與模型組相比，雌激素組及低、中、高劑量組逃避潛伏期縮短、穿梭次數(shù)增加（P<0.05）。去勢4周，與假手術(shù)組比較，模型組E2濃度明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組E2濃度明顯增高（P<0.01）。尼氏染色顯示，與假手術(shù)組比較，模型組尼氏陽性細(xì)胞數(shù)減少（P<0.01）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組尼氏陽性細(xì)胞數(shù)增加（P<0.01）。HE染色顯示，假手術(shù)組，雌激素組，低、中、高劑量組錐體神經(jīng)元增多，且突起明顯；模型組錐體神經(jīng)元較少、顆粒細(xì)胞較多。共聚焦顯微鏡下見，假手術(shù)組，雌激素組，低、中、高劑量組海馬神經(jīng)元囊泡和突觸粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)增多；模型組海馬神經(jīng)元囊泡和突觸減少。結(jié)論 養(yǎng)陰寧神方可能通過提高血漿E2水平、改善海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)和功能可塑性、增加去勢小鼠的認(rèn)知功能，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕 養(yǎng)陰寧神方；去勢；雌激素；海馬；神經(jīng)元；突觸可塑性

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.005

Modulation of synaptic plasticity of the hippocampus in ovariectomized mice by Yangyin Ningshen Formula

LEI Huajuan1，2， TIAN Fengming1， YI Jian1， DENG Juan1，3， LI Zi'ou1，3， DAI Jincheng4，

GUO Fengle1， LI Le2， LIU Baiyan3*

1. Department of Anesthesiology， The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Changsha Medical University， Changsha， Hunan 410219， China; 3. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410013， China; 4. Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830054， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Yangyin Ningshen Formula （YYNSF） on cognitive function in ovariectomized female mice. Methods Sixty C57BL/6J female mice were randomly divided into sham-operated group， model group， estrogen group， and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups， with 10 mice in each group. Sham-operated group underwent skin and peritoneal incision without removing the ovaries， while the rest groups were subject to bilateral ovariectomy. Sham-operated and model groups were given equal volume of saline （0.1 ml/10 g）， while estrogen group [estradiol （E2）， 0.09 mg/kg]， and low- （9.459 g/kg）， medium- （18.459 g/kg）， and high-dose （36.99 g/kg） YYNSF groups were given corresponding medications. All groups were treated by gavage for three weeks. The wound healing time after surgery was recorded. Morris water maze with recording latency and cross times were carried out before ovariectomy， one week and four weeks after ovariectomy respectively， in order to assess the learning and memory function of the mice. ELISA was used to measure the level of serum E2; HE staining was performed to observe morphology of the hippocampal neurons; Nissl staining was used to observe the number of Nissl-positive cells in the hippocampus; confocal microscopy was used to observe the ultrastructures in the hippocampal neurons. Results The wound healing time of model group was longer than that of sham-operated group （P<0.05）. Compared with model， estrogen， and low- and high-dose YYNSF groups， the wound healing time of medium-dose YYNSF group was shortened （P<0.05）. The Morris water maze test revealed that compared with sham-operated group， all other groups showed prolonged escape latency and reduced cross times at one week after ovariectomy （P<0.05）. At four weeks after ovariectomy， model group showed prolonged escape latency and reduced cross times compared with sham-operated group （P<0.05）. Compared with model group， estrogen and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups showed shorter escape latency and more cross times （P<0.05）. Compared with sham-operated group， E2 level in model group decreased significantly at four weeks after ovariectomy （P<0.01）; while compared with model group， E2 level in estrogen and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups increased significantly （P<0.01）. Compared with sham-operated group， Nissl staining demonstrated a decrease in the number of Nissl-positive cells in the hippocampus of model group （P<0.01）; while compared with model group， the number of Nissl-positive cells in the hippocampus of estrogen and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups showed an increase （P<0.01）. HE staining showed increased pyramidal neurons and their dendritic synapses in sham-operated， estrogen， and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups， and fewer pyramidal neurons and more granule cells in model group. Confocal microscopy showed increased synaptic vesicles and rough endoplasmic reticula in the hippocampal neurons of sham-operated， estrogen， and low-， medium-， and high-dose YYNSF groups， and decreased synapses and their vesicles in the hippocampal neurons of model group. Conclusion YYNSF may exert protective effects on the brain by increasing plasma E2 level， improving synaptic morphology and plasticity of the hippocampal neurons， and enhancing cognitive function of the ovariectomized mice.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Yangyin Ningshen Formula; ovariectomy; estrogen; hippocampus; neuron; synaptic plasticity

隨著全球老齡人口逐漸上升，2025年全球圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女人口預(yù)計(jì)增長至11億[1]。圍絕經(jīng)期指生殖能力衰退至完全喪失的階段，臨床上指最后一次月經(jīng)至最后一次月經(jīng)結(jié)束后的一年[2]。大多數(shù)圍絕經(jīng)期跨度為1～2年，長者可達(dá)10年[3]，圍絕經(jīng)期綜合征主要以潮熱、盜汗、心煩、圍絕經(jīng)期健忘等為臨床表現(xiàn)[4]，其中，圍絕經(jīng)期健忘主要以學(xué)習(xí)及記憶能力下降、注意力變差為主要表現(xiàn)，可伴有焦慮、抑郁或者其他異常情緒[5]。然而，圍絕經(jīng)期健忘由于無特征性的臨床表現(xiàn)，易被個人、家庭和臨床忽視?；颊吆苌僖驀^經(jīng)期認(rèn)知功能減退單獨(dú)就診，常出現(xiàn)漏診、誤診[6]，不僅影響女性的生活質(zhì)量，還會增加阿爾茨海默病的患病風(fēng)險(xiǎn)[7]。

圍絕經(jīng)期健忘是圍絕經(jīng)期腦功能衰老最主要的表現(xiàn)之一，與雌激素水平降低有關(guān)[8]。雌激素不僅參與維持正常生殖功能，在大腦神經(jīng)元能量代謝、氧化應(yīng)激、神經(jīng)營養(yǎng)及再生維持和炎癥抑制等方面也發(fā)揮重要生理作用[9]。研究表明，圍絕經(jīng)期雌激素水平變化，通過電生理、代謝、神經(jīng)化學(xué)、微觀結(jié)構(gòu)和行為學(xué)等對腦產(chǎn)生影響，特別是海馬雌激素可通過對雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）的調(diào)節(jié)，發(fā)揮對記憶功能的調(diào)控[10]：一方面，雌二醇（estradiol， E2）通過海馬神經(jīng)元能量代謝調(diào)節(jié)影響ERα的功能；另一方面，ERα調(diào)節(jié)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)興奮性，通過對海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性調(diào)節(jié)而調(diào)控認(rèn)知功能，從而影響預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[11]。

中醫(yī)學(xué)將圍絕經(jīng)期健忘歸屬于“呆癥”范疇。圍絕經(jīng)期健忘病位在腦，與肝、腎關(guān)系最密切，主要臨床表現(xiàn)為腦對記憶力的存儲、處理和輸出功能下降。劉柏炎教授在多年的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，肝腎陰虛、肝郁氣滯是圍絕經(jīng)期健忘的主要病因、病機(jī)。圍絕經(jīng)期健忘與腎虛肝郁關(guān)系密切?；诟文I同源理論，腎精不足，肝氣郁結(jié)，神失所養(yǎng)導(dǎo)致“腦”核心的記憶功能失調(diào)[12]。因此，劉柏炎教授提出，“腎-肝-腦”軸理論在圍絕經(jīng)期健忘中有重要意義[13]。養(yǎng)陰寧神方為劉柏炎教授自創(chuàng)的經(jīng)驗(yàn)方，由清代著名醫(yī)書《傅青主女科》中所記載的益經(jīng)湯化裁而來。益經(jīng)湯是治療圍絕經(jīng)期綜合征的經(jīng)典名方，主要用于治療圍絕經(jīng)期綜合征之煩躁、盜汗、失眠、眩暈、焦慮和抑郁癥狀[14]。目前，養(yǎng)陰寧神方對圍絕經(jīng)期健忘的影響鮮有研究，養(yǎng)陰寧神方化裁后通過大補(bǔ)腎水、疏肝解郁、養(yǎng)血柔肝，共奏補(bǔ)精生髓益智、養(yǎng)陰寧神之效，進(jìn)而改善圍絕經(jīng)期雌激素下降所致健忘。

本研究通過雌性小鼠雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立去勢模型，模擬圍絕經(jīng)期雌激素急劇變化，觀察去勢后小鼠認(rèn)知功能的變化[14]。通過養(yǎng)陰寧神方干預(yù)，判斷其對去勢小鼠海馬神經(jīng)元可塑性的影響，以期為圍絕經(jīng)期健忘的防治提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動物

健康C57BL/6J雌性小鼠60只，鼠齡6個月，體質(zhì)量20～25 g，飼養(yǎng)溫度22～26 ℃，濕度50%～70%。所有動物均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號： SCXK（湘）2019-0004。動物自購入之日起，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，光暗周期12 h/12 h，自由攝取食物與水，按實(shí)驗(yàn)動物3R原則給予人道關(guān)懷。本動物實(shí)驗(yàn)通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理審查（編號：ZYFY20190418）。

1.2? 試驗(yàn)藥物及制備

養(yǎng)陰寧神方：熟地黃30 g，炒酸棗仁15 g，山茱萸12 g，柴胡、白芍、沙參、牡丹皮各10 g，當(dāng)歸8 g。藥材購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，由湖南省超微中藥工程技術(shù)中心制備藥液，濃縮至含生藥1.5 g/mL，分裝入200 mL廣口無菌試劑瓶中，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。戊酸雌二醇? mg/片，國藥準(zhǔn)字：J20171038，德國拜耳公司）。

1.3? 主要試劑

小鼠E2、睪酮ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：JL11790、JL12550）；尼氏抗體（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：G1430）；蘇木素、伊紅、結(jié)晶紫染色液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR1180-1、AR1180-2、C8470）；2.5%戊二醛（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：P1126）；Epon-812包埋劑（美國SPI公司，批號：SPI-02660）；戊巴比妥鈉（德國Merck KGaA公司，批號：P3761）。

1.4? 主要儀器

光學(xué)顯微鏡、圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司，型號：BX51、Image-Pro Express 4）；水迷宮軟件（西班牙Panlab公司，型號：Smart3.0）；動物質(zhì)量天平（上海精密儀器儀表有限公司，型號：YB102）；透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司，型號：HT7700）；攤片機(jī)、超薄切片機(jī)（德國LEICA公司，型號：UC-7）；恒溫干燥箱（上海福碼實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號：DGX-9073B-1）。

2 方法

2.1? 動物分組及給藥

60只6月齡雌性小鼠自購入之日起，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、雌激素組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。所有動物均喂養(yǎng)普通飼料，并用耳標(biāo)鉗打好記號。

2.2? 模型制備與鑒定

2.2.1? 雌性小鼠的去勢模型制備? 雌性小鼠用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）行腹腔注射，等待到達(dá)足夠的麻醉深度[15]，運(yùn)用聚維酮碘常規(guī)消毒側(cè)腹部皮膚，剪除約1.5 cm毛發(fā)，于髂前上棘上1 cm切開皮膚及腹部肌肉，切開腹膜，分離結(jié)扎雙側(cè)卵巢動脈后，切除雙側(cè)卵巢，止血后縫合腹膜、肌肉和皮膚。假手術(shù)組僅切開皮膚和腹膜，不摘除小鼠的卵巢。每天給予傷口換藥一次。

2.2.2? 去勢模型鑒定? 將小鼠放在鼠籠蓋上，用一個單獨(dú)尖端含有無菌蒸餾水（25～50 μL）的負(fù)壓吸引管沖洗陰道口。然后將沖洗液滴在玻片涂片上，干燥、結(jié)晶紫染色1 min、無菌蒸餾水沖洗2次后進(jìn)行觀察。去勢后3、7、10 d，共檢測3次小鼠陰道脫落細(xì)胞，去勢成功的標(biāo)準(zhǔn)為：小鼠陰道涂片細(xì)胞多為白細(xì)胞，而未去勢小鼠為多形上皮細(xì)胞[16]。

2.3? 動物給藥

取熟地黃30 g，炒酸棗仁15 g，山茱萸12 g，柴胡、白芍、沙參、牡丹皮各10 g，當(dāng)歸8 g，總共105 g生藥，以60 kg的成人用量，按體表面積計(jì)算為1.75 g/kg，假設(shè)人的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量為60 kg，人的標(biāo)準(zhǔn)體表面積為1.62 m2；假設(shè)小鼠的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量為0.02 kg，小鼠的標(biāo)準(zhǔn)體表面積為0.007 m2，設(shè)定K=標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量/標(biāo)準(zhǔn)體表面積，則Rab=K人/K小鼠=12.33，根據(jù)人與小鼠的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量換算公式：Db=Da·Rab，成人即1.75 g/kg，Rab取12.33，養(yǎng)陰寧神方小鼠中劑量則為21.577 5 g/kg，低劑量為10.788 7 g/kg，高劑量為43.155 0 g/kg[17]。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮養(yǎng)陰寧神方藥液至含生藥劑量為1.5 g/mL。根據(jù)小鼠體積（10 mL/kg）計(jì)算灌胃劑量，灌胃2次/d，連續(xù)21 d。戊酸雌二醇灌胃劑量為0.09 mg/kg[18]。

2.4? 小鼠傷口愈合時(shí)間觀察

給予聚維酮碘消毒傷口，每天1次，并記錄去勢后每只小鼠的傷口愈合時(shí)間。

2.5? 水迷宮實(shí)驗(yàn)

采用Morris水迷宮系統(tǒng)評估小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力[19]，選取潛伏期和穿梭次數(shù)進(jìn)行分析，水迷宮被分為1、2、3、4象限，第4象限設(shè)置平臺，水位淹沒平臺1 cm，并被牛奶顏色所覆蓋。

2.5.1? 定位巡航實(shí)驗(yàn)? 實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)5 d，每天固定時(shí)間段，每個時(shí)間段訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練90 s，間隔20 s，訓(xùn)練4次后進(jìn)行測試，記錄第5天小鼠找到平臺的時(shí)間（逃避潛伏期），作為小鼠定位巡航的成績。

2.5.2? 空間探索實(shí)驗(yàn) 在訓(xùn)練的第6天撤除平臺，小鼠從第1象限入水，記錄小鼠在60 s內(nèi)跨越原平臺的穿梭次數(shù)，作為空間探索實(shí)驗(yàn)的成績。整個實(shí)驗(yàn)過程中水溫控制在25 ℃。

2.6? ELISA檢測

采用ELISA法測定小鼠血漿E2 7個濃度梯度點(diǎn)，通過鏈酶素-HRP反應(yīng)，封板、溫育、洗滌，吸水拍干，顯色、加樣、加酶，最后在空白孔調(diào)零，450 nm波長處測量OD值。

2.7? HE染色

海馬組織依次通過不同濃度乙醇脫水，依次浸泡于2個二甲苯中透明；再將海馬組織浸泡于2個石蠟缸包埋制成蠟塊。將海馬蠟塊預(yù)冷后固定、切片，然后烤片。石蠟切片脫蠟，最終染色并使用中性樹膠封片。

2.8? 尼氏染色

石蠟切片用4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水洗滌2 min，換用新鮮蒸餾水再洗滌2 min，尼氏染色液染色10 min。蒸餾水洗滌，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察尼氏陽性細(xì)胞數(shù)量，并用Image J軟件進(jìn)行處理。

2.9? 電鏡觀察海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

在冰上解剖海馬組織，并放入2.5%戊二醛中固定，然后用0.01 mmol/L PBS（pH 7.3）漂洗，1%鋨酸室溫固定后脫水，脫水后用Epon-812包埋劑包埋海馬，再用超薄切片機(jī)，將小鼠海馬組織切成60～80 nm超薄切片，最后用電子顯微鏡觀察。

2.10? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布、方差齊者采用LSD法，符合正態(tài)分布、方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組小鼠傷口愈合時(shí)間比較

與假手術(shù)組相比，其余各組小鼠傷口愈合時(shí)間延長（P<0.05）；與模型組、雌激素組、低劑量組、高劑量組相比，中劑量組小鼠傷口愈合時(shí)間縮短（P<0.05）。詳見表1。

3.2? 各組小鼠水迷宮測試結(jié)果比較

3.2.1? 定位巡航實(shí)驗(yàn)? 去勢前，各組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。去勢1周，與假手術(shù)組比較，其余各組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時(shí)間延長（P<0.05）。去勢4周，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時(shí)間延長（P<0.05）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時(shí)間縮短（P<0.05）。與去勢前比較，去勢1周，模型組、雌激素組及低、中、高劑量組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時(shí)間延長（P<0.05）。與去勢1周比較，去勢4周，雌激素組及低、中、高劑量組小鼠尋找平臺的逃避潛伏期時(shí)間延長（P<0.05）。詳見圖1、表2。

3.2.2? 空間探索實(shí)驗(yàn)? 去勢前，各組小鼠穿梭次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。去勢1周，與假手術(shù)組相比，其余各組小鼠穿梭次數(shù)減少（P<0.05）。去勢4周，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠穿梭次數(shù)減少（P<0.05）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組小鼠穿梭次數(shù)增加（P<0.05）。與去勢前比較，去勢1周，模型組、雌激素組及低、中、高劑量組小鼠穿梭次數(shù)減少（P<0.05）。與去勢1周比較，去勢4周，雌激素組及低、中、高劑量組小鼠穿梭次數(shù)增加（P<0.05）。詳見圖1、表3。

3.3? 各組小鼠E2濃度的比較

去勢4周，與假手術(shù)組比較，模型組E2濃度降低（P<0.01）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組E2濃度增高（P<0.01）。詳見表4。

3.4? 各組小鼠HE染色比較

假手術(shù)組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密、整齊，錐體神經(jīng)元數(shù)量較多，核濃染，神經(jīng)元突觸細(xì)長且明顯。模型組海馬區(qū)表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞多、錐體神經(jīng)元稀少。雌激素組及低、中、高劑量組錐體神經(jīng)元數(shù)量增多，樹突突起增加。詳見圖2。

3.5? 各組小鼠海馬神經(jīng)元尼氏染色比較

去勢4周，與假手術(shù)組比較，模型組尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)減少（P<0.01）；與模型組比較，雌激素組及低、中、高劑量組尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.01）。詳見圖3、表5。

3.6? 各組小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性比較

假手術(shù)組神經(jīng)元突觸量多，突觸內(nèi)囊泡清晰可見。去勢4周，模型組可見囊泡、突觸減少，海馬神經(jīng)元出現(xiàn)核糖體稀疏、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少。與模型組相比，雌激素組及低、中、高劑量組突觸和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)增多。詳見圖4。

4 討論

圍絕經(jīng)期綜合征除生殖系統(tǒng)改變明顯外，還出現(xiàn)潮熱、心慌、出汗、記憶力下降等一系列臨床表現(xiàn)[4]。目前，圍絕經(jīng)期大腦記憶功能減退備受關(guān)注，圍絕經(jīng)期女性健忘的發(fā)生率是絕經(jīng)前的1.4倍，其獨(dú)立于潮紅、焦慮、抑郁之外，需要引起臨床醫(yī)師的重視[18]。圍絕經(jīng)期綜合征與卵巢功能密切相關(guān)，生物學(xué)特征為血液中雌激素劇烈波動，特別是血漿E2水平。近幾十年來，E2已成為治療雌激素缺乏（雙側(cè)卵巢切除致絕經(jīng)）和雌激素減少（自然絕經(jīng)）的一線用藥。除對生殖功能的影響，雌激素還能改善大腦功能，在研究中得到越來越多的重視[20]。E2片劑臨床用量是1 mg/d，為0.02～0.33 mg/kg[21]。早期補(bǔ)充雌激素的效果更佳，特別是對記憶功能的改善作用。但是長期雌激素治療可能增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等腫瘤和血栓發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[22]，如何利用雌激素改善記憶功能，同時(shí)又不增加腫瘤和血栓發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)是目前臨床上的難點(diǎn)之一。

養(yǎng)陰寧神方是劉柏炎教授的經(jīng)驗(yàn)方，劉柏炎教授從中醫(yī)腎、肝、腦的關(guān)系出發(fā)，指出圍絕經(jīng)期易出現(xiàn)腎虛肝郁，而導(dǎo)致精虛髓虧，從而發(fā)生健忘，以“腎-肝-腦”軸立論闡述圍絕經(jīng)期健忘的病因病機(jī)，基于“養(yǎng)陰寧神定智”創(chuàng)立了“養(yǎng)陰寧神方”治療圍絕經(jīng)期健忘。本研究用雌性小鼠去勢模擬圍絕經(jīng)期，通過養(yǎng)陰寧神方干預(yù)觀察其對去勢小鼠認(rèn)知功能的影響。

各組小鼠去勢后傷口愈合時(shí)間比較發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組，雌激素組，低、高劑量組小鼠傷口愈合時(shí)間延長；與模型組、雌激素組、低劑量組、高劑量組相比，中劑量組小鼠傷口愈合時(shí)間縮短。去勢1周，水迷宮測試發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，其余各組去勢后學(xué)習(xí)、記憶功能下降；去勢4周，除模型組外，其余各組逃避潛伏期縮短、穿梭次數(shù)增加。說明雌激素、養(yǎng)陰寧神方可增強(qiáng)小鼠海馬神經(jīng)元的學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能。模型小鼠去勢后，血漿E2水平顯著下降。去勢4周，在外源性的E2和養(yǎng)陰寧神方干預(yù)后，各組血漿E2水平明顯高于模型組。說明養(yǎng)陰寧神方可增加血漿E2水平，與口服E2片劑效果一致。結(jié)合行為學(xué)的結(jié)果和血漿E2水平的變化，說明去勢后E2水平急劇下降是學(xué)習(xí)認(rèn)知功能減退的主要原因之一，養(yǎng)陰寧神方通過升高血漿E2的水平而改善學(xué)習(xí)記憶能力。HE染色發(fā)現(xiàn)，雌激素組和養(yǎng)陰寧神方各組海馬錐體神經(jīng)元粗大、核濃染，突起明顯，養(yǎng)陰寧神方各組錐體神經(jīng)元的數(shù)量增加，相反，模型組海馬錐體神經(jīng)元稀少而顆粒細(xì)胞居多，突起不明顯。尼氏染色發(fā)現(xiàn)，模型組尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)量明顯低于其他組，提示雌激素組及養(yǎng)陰寧神方各組均可增強(qiáng)去勢后海馬神經(jīng)元蛋白合成功能。電鏡結(jié)果提示，模型組小鼠海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和突觸數(shù)量減少，而雌激素組及養(yǎng)陰寧神方各組均能增加去勢后神經(jīng)元突觸數(shù)量，從而改善海馬神經(jīng)元突觸可塑性。

E2是腦強(qiáng)力調(diào)節(jié)劑，是調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活、可塑性、神經(jīng)保護(hù)的重要激素之一[23]。該激素對學(xué)習(xí)和記憶調(diào)節(jié)具有不可替代的作用[24]。前額皮質(zhì)、海馬等區(qū)域都含有大量的雌激素受體[24]。E2能通過海馬組織ERα等，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元發(fā)生和樹突形成[25]。E2可通過調(diào)節(jié)ERα神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)而改善認(rèn)知功能。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠去勢后認(rèn)知功能下降與E2的水平密切相關(guān)。養(yǎng)陰寧神方可模擬E2的作用，通過雌激素-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，改善去勢神經(jīng)元突觸可塑性，從而發(fā)揮對去勢小鼠海馬神經(jīng)功能的保護(hù)作用，其中，養(yǎng)陰寧神方中劑量組效果最好。

參考文獻(xiàn)

[1] CARPENTER J S， SHENG Y， PIKE C， et al. Correlates of palpitations during menopause： A scoping review[J]. Women's Health， 2022， 18： 1-14.

[2] GTROIA L， MARTONE S， MORGANTE G， et al. Management of perimenopause disorders： Hormonal treatment[J]. Gynecological Endocrinology， 2021， 37（3）： 195-200.

[3] LEGA I C， FINE A， ANTONIADES M L， et al. A pragmatic approach to the management of menopause[J]. Canadian Medical Association Journal， 2023， 195（19）： E677-E672.

[4] 初怡靜， 王福玲， 婁艷輝， 等. 青島地區(qū)女性圍絕經(jīng)期癥狀流行病學(xué)調(diào)查分析[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展， 2012， 21（7）： 553-556.

[5] SOARES C N， SHEA A K. The midlife transition， depression， and its clinical management[J]. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America， 2021， 48（1）： 215-229.

[6] SANTORO N， ROECA C， PETERS B A， et al. The menopause transition： Signs， symptoms， and management options[J]. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism， 2021， 106（1）： 1-15.

[7] MCCARTHY M， RAVAL A P. The peri-menopause in a woman's life： A systemic inflammatory phase that enables later neurodegenerative disease[J]. Journal of Neuroinflammation， 2020， 17（1）： 317.

[8] KOYSOMBAT K， MCGOWN P， NYUNT S， et al. New advances in menopause symptom management[J]. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism， 2023， 11： 101774.

[9] ECHEVERRIA V， ECHEVERRIA F， BARRETO G E， et al. Estrogenic plants： To prevent neurodegeneration and memory loss and other symptoms in women after menopause[J]. Frontiers in Pharmacology， 2021， 12： 644103.

[10] FESTER L， RUNE G M. Sex neurosteroids： Hormones made by the brain for the brain[J]. Neuroscience Letters， 2021， 753： 135849.

[11] BAUMGARTNER N E， DANIEL J M. Estrogen receptor α： A critical role in successful female cognitive aging[J]. Climacteric： the Journal of the International Menopause Society， 2021， 24（4）： 333-339.

[12] 寧? 港， 吳? 悔， 李波男， 等. 肝細(xì)胞生長因子是“乙癸同源”可能的物質(zhì)基礎(chǔ)探討[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 42（10）： 1720-1724.

[13] 雷華娟， 劉柏炎. 基于“腎-肝-腦”軸探討圍絕經(jīng)期健忘的中醫(yī)防治[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2023， 43（12）： 2300-2304.

[14] 金凡惠， 劉雁峰， 鄭涵予， 等. 《傅青主女科》肝脾同治法在婦科病中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代中醫(yī)臨床， 2023， 30（2）： 74-77.

[15] WANG Y， PAN Q， TIAN R， et al. Repeated oxytocin prevents central sensitization by regulating synaptic plasticity via oxytocin receptor in a chronic migraine mouse modelJ]. The Journal of Headache and Pain， 2021， 22（1）： 84.

[16] EKAMBARAM G， SAMPATH-KUMAR S K， JOSEPH L D. Comparative study on the estimation of estrous cycle in mice by visual and vaginal lavage method[J]. Journal of Clinical and Diagnostic Research， 2017， 11（1）： AC05-AC07.

[17] 鄭旭霞， 柴? 爽， 魏立偉， 等. 基于PI3K/Akt信號通路的骨松益骨方對去勢大鼠的骨保護(hù)作用[J]. 中藥新藥與臨床藥理， 2023， 34（12）： 1691-1699.

[18] 顧仁艷， 何? 麗， 張秋梅， 等. 滋陰溫陽序貫方對卵巢功能減退動物模型的調(diào)節(jié)作用[J]. 吉林中醫(yī)藥， 2022， 42（10）： 1189-1194.

[19] 雷華娟， 滕永杰， 稅林輝， 等. 七氟烷對老年大鼠認(rèn)知功能和海馬突觸可塑性的影響[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 41（6）： 842-846.

[20] BAUMGARTNER N E， MCQUILLEN S M， PERRY S F， et al. History of previous midlife estradiol treatment permanently alters interactions of brain insulin-like growth factor-1 signaling and hippocampal estrogen synthesis to enhance cognitive aging in a rat model of menopause[J]. The Journal of Neuroscience， 2022， 42（42）： 7969-7983.

[21] 劉? 燕， 張? 靜. 戊酸雌二醇片對圍絕經(jīng)期綜合征患者更年期綜合征評分、雌激素水平與不良反應(yīng)的影響[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志， 2020， 24（1）： 109-111.

[22] MARJORIBANKS J， FARQUHAR C， ROBERTS H， et al. Long-term hormone therapy for perimenopausal and postmenopausal women[J]. The Cochrane Database of Systematic Reviews， 2017， 1（1）： CD004143.

[23] PEROVI?M， HEFFERNAN E M， EINSTEIN G， et al. Learning exceptions to category rules varies across the menstrual cycle[J]. Scientific Reports， 2023， 13（1）： 21999.

[24] BRANN D W， LU Y J， WANG J， et al. Brain-derived estrogen and neural function[J]. Neuroscience and Biobehavioral Reviews， 2022， 132： 793-817.

[25] KRAUSE W C， RODRIGUEZ R， GEGENHUBER B， et al. Oestrogen engages brain MC4R signalling to drive physical activity in female mice[J]. Nature， 2021， 599（7883）： 131-135.