連續(xù)堆肥施用對(duì)土壤反硝化及固氮微生物的影響

摘 要：為揭示連續(xù)堆肥施用對(duì)土壤反硝化及固氮微生物群落的影響機(jī)制，以寧夏平羅縣小麥地為試驗(yàn)對(duì)象，采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置T0（有機(jī)堆肥0 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料）、T1（有機(jī)堆肥1 000 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料）、T2（有機(jī)堆肥2 000 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料）、T3（有機(jī)堆肥3 000 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料）、T4（有機(jī)堆肥4 000 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料）5個(gè)處理開展定位研究，比較了不同堆肥用量下土壤反硝化及固氮微生物的差異，分析了土壤理化性狀與反硝化及固氮微生物群落組成及多樣性間的相互關(guān)系。結(jié)果表明，連續(xù)3年堆肥施用后，除小麥全麥面筋含量有逐漸升高趨勢(shì)外，小麥產(chǎn)量和品質(zhì)未受到顯著影響;不同處理下nirK、nirS、nosZ功能基因拷貝數(shù)間無(wú)顯著差異。不同堆肥用量影響nifH固氮細(xì)菌群落組成，土壤變形菌門和擬硫弧菌屬分別為各處理下的優(yōu)勢(shì)門、屬，不同處理下固氮弧菌屬（Azoarcus）的固氮細(xì)菌相對(duì)豐度間有極顯著差異。綜上所述，連續(xù)3年堆肥施用對(duì)小麥土壤反硝化微生物的影響作用有限，但影響了nifH固氮微生物的組成結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：堆肥; 產(chǎn)量與品質(zhì); 反硝化基因; 微生物多樣性

中圖分類號(hào)：S147.3""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1002-204X（2024）12-0061-05

doi：10.3969/j.issn.1002-204x.2024.12.013

作者簡(jiǎn)介：張薇（1973—），女，寧夏平羅人，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。

收稿日期：2024-08-30

Effects of Continuous Compost Application on Soil Denitrifying and Nitrogen-Fixing Microorganisms

Zhang Wei1， Ma Jinguo1， Wang Mingguo2

（1.Pingluo Agricultural Technology Extension and Service Center， Pingluo， Ningxia 753400; 2.Ningxia Agricultural Technology Extension Station， Yinchuan， Ningxia 750001）

Abstract To investigate the mechanism by which continuous compost application affects soil denitrification and nitrogen-fixing microbial communities， a field experiment was conducted in wheat fields located in Pingluo County， Ningxia. A randomized block design with five treatments was employed： T0 （0 t·hm-2 organic compost + chemical fertilizer）， T1 （15 t·hm-2 organic compost + chemical fertilizer）， T2 （30 t·hm-2 organic compost + chemical fertilizer）， T3 （45 t·hm-2 organic compost + chemical fertilizer）， and T4 （60 t·hm-2 organic compost + chemical fertilizer）. The study focused on the differences in soil denitrification and nitrogen-fixing microorganisms under varying compost application rates and analyzed the relationships between soil physicochemical properties and microbial community composition and diversity. The results showed that after three years of continuous compost application， wheat yield and quality were not significantly affected， although the gluten content in wheat showed a gradual increase. There were no significant differences in the copy numbers of functional genes （nirK， nirS， nosZ） related to denitrification among the treatments. However， different compost application rates significantly influenced the composition of the nifH nitrogen-fixing bacterial community. The Bacteroidetes was the dominant phylum， and the genus Desulfobulbus was the dominant genus across all treatments. There were highly significant differences in the relative abundance of Azoarcus， a nitrogen-fixing genus， between different treatments. Overall， while continuous compost application for three years had limited effects on soil denitrifying microorganisms， it notably influenced the composition and structure of nifH nitrogen-fixing microbial communities.

Key words Compost; Yield and quality; Denitrification genes; Microbial diversity

65卷12期

張 薇，等 連續(xù)堆肥施用對(duì)土壤反硝化及固氮微生物的影響

有機(jī)肥在農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用已成為保持土壤養(yǎng)分的有效管理策略，而過(guò)量、不合理的化肥施用會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)的過(guò)度消耗。鄧米林等[1]認(rèn)為，合理的土地利用方式變化可以通過(guò)調(diào)控土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而影響反硝化過(guò)程及微生物群落。研究表明，土壤反硝化作用是導(dǎo)致土壤氮素?fù)p失的重要途徑[2]。在東北黑土區(qū)、華南紅土區(qū)或設(shè)施農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，利用有機(jī)肥替代部分氮肥后土壤反硝化過(guò)程中產(chǎn)生的N2O氣體排放減少[3]，與單獨(dú)施用無(wú)機(jī)肥相比，用有機(jī)肥替代50%的無(wú)機(jī)肥可顯著影響土壤的反硝化作用[4]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，玉米種植季節(jié)中添加小麥秸稈會(huì)增加N2O排放[5]，這是因?yàn)榻斩挼扔袡C(jī)物料為微生物群落提供了額外的基質(zhì)，在過(guò)量土壤氮存在的情況下，微生物群落刺激硝化和反硝化作用[6]。但LIU B[7]認(rèn)為，在秸稈還田和氮肥同時(shí)施用的條件下，秸稈對(duì)土壤性質(zhì)和微生物群落多樣性的影響更大。實(shí)際上，作為參與土壤反硝化作用的nirK、nirS、nosZ等功能微生物的作用機(jī)制并不明確。

雖然有機(jī)肥對(duì)土壤反硝化微生物影響的研究已取得一些進(jìn)展，但仍需深入探討，特別是長(zhǎng)期堆肥施用對(duì)土壤反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和功能基因的影響尚不明確。因此，本研究旨在通過(guò)連續(xù)堆肥施用試驗(yàn)，系統(tǒng)揭示不同施肥管理對(duì)土壤反硝化及固氮微生物群落的長(zhǎng)期影響，以期為優(yōu)化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮素管理策略提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2021年在寧夏石嘴山市平羅縣頭閘鎮(zhèn)西永惠村田家營(yíng)（106°9'40\" E，36°10'48\" N）進(jìn)行。供試土壤為灌淤土。試驗(yàn)前土壤基本理化性狀：全氮含量為1.06 g·kg-1，速效磷含量為42 mg·kg-1，速效鉀含量為230 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量為18.6 g·kg-1，pH值為8.43，全鹽含量2.3 g·kg-1，耕地土壤質(zhì)量屬中等偏上水平。有機(jī)肥中有機(jī)質(zhì)含量為31%，總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）含量為2.8%，其中N、P2O5、K2O分別占0.6%、0.5%、1.7%，全鹽含量為12 g·kg-1。

1.2 供試材料

供試小麥品種為寧春60號(hào)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)5個(gè)處理，3次重復(fù)。T0（CK）處理為有機(jī)堆肥0 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料，T1處理為有機(jī)堆肥1 000 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料，T2處理為有機(jī)堆肥2 000 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料，T3處理為有機(jī)堆肥3 000 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料，T4處理為有機(jī)堆肥4 000 kg·667-1·m-2+化學(xué)肥料。2021—2023年試驗(yàn)期間，按照農(nóng)民習(xí)慣方式施用化肥。小麥播種前基施磷肥（過(guò)磷酸鈣）25 kg·667-1·m-2，復(fù)合肥料（N∶P2O5∶K2O=18-18-18）25 kg·667-1·m-2，結(jié)合春季整地施入土壤;小麥拔節(jié)期追施尿素5" kg·667-1·m-2。小區(qū)面積為（5.6 m×10 m）=56 m2，田間各小區(qū)呈隨機(jī)區(qū)組排列。2023年，小麥?zhǔn)斋@期，采用多點(diǎn)采樣的方法，采集各試驗(yàn)小區(qū)耕地0～20 cm土層土壤樣本，將每個(gè)小區(qū)內(nèi)多點(diǎn)采集的土壤樣本均勻混合，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，分別用于土壤理化性狀及與土壤氮轉(zhuǎn)化有關(guān)微生物功能基因及微生物群落多樣性的測(cè)定。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 小麥品質(zhì)測(cè)定

小麥全麥蛋白、面筋、容重和沉降指數(shù)分別采用氮分析法、面筋測(cè)定儀、標(biāo)準(zhǔn)容重測(cè)量法和沉降值測(cè)定儀測(cè)定[8]，委托內(nèi)蒙古普尼測(cè)試技術(shù)有限公司測(cè)試。

1.4.2 土壤理化性狀測(cè)定

土壤全氮、全碳含量采用元素分析儀（vario MACRO cube 1301816s，Elementar），高溫燃燒法測(cè)定;土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮用KCl溶液浸提后，采用連續(xù)流動(dòng)分析儀（Futura V3，USA）測(cè)定;土壤全磷含量采用硫酸-高氯酸消煮鉬銻抗比色法測(cè)定;土壤速效磷含量采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定;土壤速效鉀含量采用NH4OAC浸提-火焰光度法測(cè)定;土壤堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定;土壤pH值采用水土比5∶1測(cè)定[9]。

1.4.3 土壤DNA提取與16S rRNA測(cè)序

土壤樣品的DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序均由上海派森諾生物股份有限公司完成，具體流程如下：nirK、nirS、nosZ、nifH基因拷貝數(shù)在MA-6000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測(cè)。反硝化細(xì)菌nirS基因上下游引物序列分別為cd3aF-GTSAACGTSAAGGARACSGG/R3cdR-GASTTCGGRTGSGTCTTGA;亞硝酸鹽還原酶nirK基因上下游引物序列分別為nirK-F1aCuF：ATCATGGTSCTGCCGCG/nirK-R3CuR：GCCTCGATCA

GRTTGTGGTT;氧化亞氮還原酶nosZ基因上下游引物序列分別為nosZ-1126F：GGGCTBGGGCCRTTGCA/

nosZ-1381R：GAAGCGRTCCTTSGARAACTTG;固氮酶鐵蛋白nifH基因上下游引物序列分別為ACCCGCC

TGATCCTGCACGCCAAGG/ACGATGTAGATTTCCTGG

GCTTGTT。PCR反應(yīng)體系均為20 μL。測(cè)定樣品時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣品同時(shí)進(jìn)行PCR循環(huán)，根據(jù)未知樣品的Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線求得未知樣品cDNA的起始拷貝數(shù)[10]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2010對(duì)論文數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用LSD法進(jìn)行組間差異比較（Plt;0.05）。統(tǒng)計(jì)分析前對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，采用Origin 24.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐熟堆肥連續(xù)施用對(duì)作物產(chǎn)量及品質(zhì)的影響

由表1可見(jiàn)，連續(xù)3年腐熟堆肥施用后，不同處理間的小麥產(chǎn)量、全麥蛋白、全麥面筋含量及全麥容重均無(wú)顯著性差異;但與對(duì)照處理T0相比，T1、T3和T4處理小麥籽粒中全麥面筋含量分別增加10.72%、7.58%和6.99%，不同處理下小麥籽粒中全麥面筋含量呈增加趨勢(shì)。

2.2 腐熟堆肥連續(xù)施用對(duì)土壤nirK、nirS、nosZ基因的影響

nirS、nirK和nosZ等反硝化細(xì)菌廣泛分布于土壤環(huán)境中，對(duì)有機(jī)肥施用具有較高敏感性。通常會(huì)通過(guò)土壤硝化和反硝化作用調(diào)節(jié)土壤的碳氮平衡，影響溫室氣體排放。與T0處理相比，T2和T4處理下土壤nirK、nirS和nosZ的基因拷貝數(shù)均低于T0處理。但整體上，不同處理間3種功能基因的拷貝數(shù)無(wú)顯著性差異，這說(shuō)明不同用量腐熟堆肥連續(xù)施用未改變土壤反硝化過(guò)程（表2）。

2.3 腐熟堆肥連續(xù)施用對(duì)土壤nifH基因群落組成多樣性的影響

nifH基因存在于多種固氮細(xì)菌中，是一種編碼鐵蛋白亞基的基因，可以作為環(huán)境中固氮細(xì)菌的指示基因。由表3可見(jiàn)，與T0處理相比，不同處理下土壤中具備nifH基因的功能微生物群落Chao1和Observed指數(shù)在T1、T2、T3和T4處理下均較對(duì)照有所增加，平均增加幅度分別為2.00%～12.19%和2.50%～21.08%;而不同處理下土壤中nifH基因群落的Simpson、Shannon、Pielou和Coverage指數(shù)間無(wú)顯著性差別（表3）。

2.4 腐熟堆肥連續(xù)施用對(duì)土壤nifH基因群落組成的影響

不同處理下，在門水平上，土壤nifH基因群落中變形菌門（Proteobacteria）細(xì)菌都為優(yōu)勢(shì)菌門，厚壁菌門（Firmicutes）等細(xì)菌為稀有菌門，其相對(duì)豐度極低（圖1）。在屬水平上，nirH基因群落中優(yōu)勢(shì)屬為擬硫弧菌屬（Pseudosulfovibrio），稀有屬為斯克氏菌屬（Methylosin）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、甲基蜂房菌屬（Methylocella）和根瘤菌屬（Rhizobium）。與T0相比，T1、T2、T3、T4各處理下對(duì)應(yīng)土壤nirH基因功能微生物群落的相對(duì)豐度均無(wú)顯著差異，但T3處理下固氮弧菌屬（Azoarcus）相對(duì)豐度顯著提高54.17%，與各處理間存在顯著差異（圖2）。

2.5 腐熟堆肥連續(xù)施用下土壤性狀與反硝化微生物的相互關(guān)系

由圖3可見(jiàn)，nifH基因群落中的Proteobacteria（變形菌門）細(xì)菌相對(duì)豐度與土壤TN和TC含量呈顯著正相關(guān)，與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān);Cyanobacteria（藍(lán)藻門）細(xì)菌的相對(duì)豐度與土壤總氮含量呈顯著負(fù)相關(guān);Actinobacteria（放線菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）細(xì)菌的相對(duì)豐度與TN和TC含量呈負(fù)相關(guān)，但與pH值呈正相關(guān);而Verrucomicrobia（疣微菌門）細(xì)菌的相對(duì)豐度與TN和TC含量呈顯著負(fù)相關(guān)（圖3）。

3 討論

葛春輝等[11]研究證實(shí)，當(dāng)施入的垃圾堆肥用量達(dá)到2 000 kg·667-1·m-2時(shí)，不同用量處理下玉米籽粒粗蛋白含量呈增加趨勢(shì)，但各處理間未達(dá)到顯著差異水平（Pgt;0.05）。本研究中，連續(xù)堆肥施用下，除小麥?zhǔn)斋@期全麥面筋含量與對(duì)照相比有增加的趨勢(shì)外，不同處理下小麥產(chǎn)量、全麥蛋白、全麥容重均無(wú)顯著性差異，這與葛春輝等的研究結(jié)果基本一致。因此，對(duì)比分析認(rèn)為，連續(xù)堆肥施用中，由于堆肥的肥效釋放比較緩慢，雖然累計(jì)施用3年，但仍不能使土壤養(yǎng)分得到全方位的活化，從而大幅度提高土壤養(yǎng)分含量，這可能是導(dǎo)致本試驗(yàn)條件下作物品質(zhì)等指標(biāo)沒(méi)有得到明顯提升的主要原因。

本試驗(yàn)表明，連續(xù)3年施用不同用量的腐熟堆肥后，參與土壤反硝化過(guò)程的nirK、nirS和nosZ功能基因拷貝數(shù)在不同處理間均無(wú)顯著性差異，但參與固氮作用的nifH基因?qū)?yīng)功能微生物群落中，不同處理下土壤變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，擬硫弧菌屬為優(yōu)勢(shì)屬，連續(xù)施加1 000 kg·667-1·m-2堆肥的處理顯著增加了土壤固氮弧菌屬的相對(duì)豐度。我們分析認(rèn)為，大量有機(jī)堆肥施用可以為土壤提供豐富的有機(jī)碳源，從而為土壤微生物生長(zhǎng)提供足夠的碳源;相較于其他類群的nifH功能微生物，固氮弧菌屬可能對(duì)土壤有機(jī)碳的累積變化更敏感，進(jìn)而促進(jìn)了固氮弧菌屬的繁殖，提高了其微生物的相對(duì)豐度[12]。但YANG Y[13]分析秸稈等含碳資源利用時(shí)指出，盡管秸稈施用增加了土壤有機(jī)碳含量，但大量秸稈降解會(huì)導(dǎo)致土壤中氧氣耗竭，形成缺氧、厭氧環(huán)境，從而影響反硝化過(guò)程，刺激固氮的發(fā)生。因此，在大量堆肥施用下，土壤有機(jī)碳的累積及土壤碳氮關(guān)系的變化，可能是影響參與固氮作用的nifH基因?qū)?yīng)功能微生物群落中部分微生物相對(duì)豐度顯著增加的原因。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，連續(xù)堆肥施用具有提高小麥全麥面筋含量的趨勢(shì)。連續(xù)堆肥施用對(duì)參與土壤反硝化過(guò)程中nirK、nirS、nosZ功能基因拷貝數(shù)的影響程度極其有限，但能夠改變nifH功能微生物的群落組成進(jìn)而影響土壤固氮過(guò)程。

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責(zé)任編輯：周慧