楓楊葉多糖增強免疫功能及抗疲勞作用的研究

劉靜，蔡延渠，李夢陽，謝朋飛*，王俊杰，張遠芳，劉思妤

（1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學部，湖南 郴州 423000；2.廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006；3.湘南學院，湖南 郴州 423000）

楓楊（Pterocarya stenopteraC.DC）為胡桃科楓楊屬植物，在我國各地均有分布。其皮、葉、果實、根等均可入藥，文獻報道，楓楊中含有萘醌類、甾醇類、多糖類、萜類、鞣質(zhì)類等化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒、殺滅釘螺等作用[1?4]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，天然植物多糖具有多種良好的生物活性，如抗肝損傷、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等[5?6]，尤其是在增強免疫、抗疲勞方面，如已報道的黃芪多糖[7?8]、石斛多糖[9?10]等，更是越來越多地開發(fā)應用于藥品、保健品、食品等產(chǎn)業(yè)，然而楓楊葉多糖在這方面的活性研究尚未有相關(guān)研究報道。課題組前期已篩選出楓楊葉多糖最優(yōu)提取工藝，同時展開抗氧化活性等研究［11］；本實驗在此基礎(chǔ)上進一步純化楓楊葉多糖，擬通過小鼠增強免疫力和抗疲勞的藥理模型，對楓楊葉多糖的增強免疫功能及抗疲勞作用進行研究與評價，以期為楓楊葉多糖的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

UV-1700 雙光束紫外分光光度計（日本島津公司）；KDC-140HR 高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；LB940 多功能酶標儀（美國BioTek 公司）；CP-225D 電子天平（0.01 mg，德國賽多利斯公司）；JJ1000Y 電子天平（美國雙杰集團有限公司）。

1.2 試藥

楓楊葉樣品采自湖南郴州，經(jīng)湘南學院王俊杰教授鑒定為胡桃科楓楊屬植物楓楊（Pterocarya stenopteraC. DC）的葉。D-無水葡萄糖對照品（99.9%，中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201707）；2，4-二硝基氟苯（DNFB，上海西亞試劑有限公司產(chǎn)品，批號C10362633）；環(huán)磷酰胺（上海源葉生物科技有限公司，批號X16M10Y83260）；印度墨水（上海源葉生物科技有限公司，批號L15M10G830 70）；超氧化物歧化酶（SOD，批號：20190602）、丙二醛（MDA，批號：20190503）試劑盒：（南京建成生物工程研究所）；其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半；由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002。實驗環(huán)境條件：室溫20～25 ℃，日溫差≤3 ℃，濕度40%～70%。本研究經(jīng)湘南學院實驗動物學部倫理委員會批準（2022 DWLL066）。

2 方法

2.1 楓楊葉多糖的制備

將楓楊葉干燥、粉碎，稱取一定量粗粉，加入40倍量60%（φ）乙醇加熱提取2 次、3.5 h/次[11]，藥液75 ℃減壓濃縮至適宜濃度，再加入無水乙醇至含醇體積分數(shù)為85%，冰箱4 ℃靜置12 h，棄去上清液，取沉淀物進行冷凍干燥，所得物質(zhì)為楓楊葉多糖；采用苯酚-硫酸法[12]測得多糖得率為（3.93±0.74）%，多糖含量為（74.86±3.78）%（n=3）。

2.2 楓楊葉多糖調(diào)節(jié)免疫功能的研究

參考文獻［13-14］中所用實驗技術(shù)方法等進行方案設計及操作。

2.2.1 楓楊葉多糖對小鼠免疫器官的影響 將小鼠隨機分成空白對照組、模型組、楓楊葉多糖高劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（50 mg/kg）、低劑量組（25 mg/kg），每組10 只?？瞻讓φ战M、模型組按20 mL/kg 灌胃給予生理鹽水，楓楊葉多糖組分別灌胃給予不同劑量藥物，1 次/d，連續(xù)30 d。從第31 天開始，除空白對照組外，其余各組小鼠每天按0.2 mL/10 g腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)5 d。末次給藥1 h 后，脫頸處死小鼠，精密稱定胸腺和脾臟質(zhì)量（mg），根據(jù)公式計算臟器系數(shù)。

2.2.2 楓楊葉多糖對小鼠碳廓清能力的影響 分組及給藥同“2.2.1”項下操作。從第31天開始，除空白對照組外，其余各組小鼠按0.2 mL/10 g 進行腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)5 d。在第35 天給藥1 h 后，尾部靜脈注射稀釋的印度墨水（5 mL/kg），于注射后2 min 和8 min 進行眼眶取血20 μL，加入裝有2 mL的0.1%碳酸氫鈉溶液中，混勻；在酶標儀600 nm 波長處測定吸光度值A(chǔ)1（2 min 樣品）和A2（8 min 樣品），以0.1%碳酸氫鈉溶液作為空白對照。同時脫頸處死小鼠，精密稱定胸腺和脾臟質(zhì)量，根據(jù)公式計算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α值。

2.2.3 楓楊葉多糖對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響分組及給藥同“2.2.1”項下操作。第31天，在小鼠腹部剃毛約3 cm×3 cm，并涂上1% 二硝基氟苯50 μL；第35 天于小鼠右耳涂上1%二硝基氟苯10 μL，24 h 后脫頸處死小鼠，于兩耳相同部位以打孔器各打取一片直徑6 mm 的耳片，精密稱定質(zhì)量，根據(jù)公式計算腫脹度。

2.3 楓楊葉多糖抗疲勞的研究

參考文獻[13，15-16]中所用實驗技術(shù)方法等進行方案設計及操作。

2.3.1 小鼠負重游泳試驗 將小鼠隨機分為空白組、楓楊葉多糖高、中、低劑量組，每組10只，空白對照組按20 mL/kg 灌胃給予生理鹽水，各藥物組灌胃給予相應劑量藥物，1次/d，連續(xù)灌胃30 d；末次給藥1 h 后稱量體質(zhì)量，在小鼠尾部負重其體質(zhì)量5%的鉛絲，放入水溫（25±1）℃自制水槽中進行游泳，記錄小鼠自游泳開始至死亡（以小鼠沉入水中后未有張口呼吸為判斷標準）的時間（min）。

2.3.2 小鼠耐缺氧試驗 分組及給藥同“2.3.1”項下操作；末次給藥1 h 后將小鼠放入內(nèi)置已點燃蠟燭的廣口瓶中，蓋緊后以凡士林封口，記錄從蠟燭熄滅至小鼠停止呼吸的時間（min）。

2.3.3 小鼠血清SOD、MDA 含量的測定 分組及給藥同“2.3.1”項下操作；末次給藥1 h 后讓小鼠自由游泳30 min，摘眼球取血，血樣于冷凍離心機3 500 r/min 離心10 min，取上清液，分別按照試劑盒說明書方法測定血清中SOD和MDA含量。

2.4 統(tǒng)計方法

采用軟件GraphPad Prism 5 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 楓楊葉多糖調(diào)節(jié)免疫功能評價

3.1.1 楓楊葉多糖對小鼠免疫器官的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠的胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），表明通過注射環(huán)磷酰胺能夠引起小鼠胸腺、脾臟的顯著萎縮，降低免疫功能。與模型組相比，楓楊葉多糖中、高劑量組均可顯著提高小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)（P＜0.05 或P＜0.01），明顯拮抗環(huán)磷酰胺所致免疫器官萎縮，有效提高小鼠自身免疫功能。見表1。

表1 楓楊葉多糖對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Table 1 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on thymus index and spleen index in mice(，n=10)

表1 楓楊葉多糖對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Table 1 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on thymus index and spleen index in mice(，n=10)

與空白對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.1.2 楓楊葉多糖對小鼠碳廓清能力的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠的廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α顯著降低（P＜0.01），表明注射環(huán)磷酰胺能夠弱化小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能。與模型組相比，中、高劑量組能夠明顯提高小鼠廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α（P＜0.05），表明楓楊葉多糖能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力。見表2。

表2 楓楊葉多糖對小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響Table 2 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on carbon clearance index and phagocytosis index in mice(，n=10)

表2 楓楊葉多糖對小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響Table 2 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on carbon clearance index and phagocytosis index in mice(，n=10)

與空白對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05。

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3.1.3 楓楊葉多糖對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠的耳腫脹度明顯降低（P＜0.01），表明注射環(huán)磷酰胺能夠顯著抑制小鼠淋巴細胞增殖功能。與模型組比較，楓楊葉多糖中、高劑量均能顯著提高小鼠耳腫脹度（P＜0.05或P＜0.01），表明楓楊葉多糖能夠提高小鼠淋巴細胞增殖能力。見表3。

表3 楓楊葉多糖對小鼠耳腫脹度的影響Table 3 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on ear swelling in mice(，n=10)

表3 楓楊葉多糖對小鼠耳腫脹度的影響Table 3 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on ear swelling in mice(，n=10)

與空白對照組比較：##P ＜0.01；與模型組比較：*P ＜0.05，**P ＜0.01。

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3.2 楓楊葉多糖抗疲勞作用評價

3.2.1 楓楊葉多糖對小鼠負重游泳時間、耐缺氧時間的影響 與空白對照組比較，楓楊葉多糖低劑量組對小鼠耐缺氧時間及負重游泳時間無顯著性影響（P＞0.05），中、高劑量組均能顯著性地延長小鼠負重游泳時間和耐缺氧時間（P＜0.05 或P＜0.01），表明楓楊葉多糖能夠增強機體代謝功能，改善體內(nèi)微循環(huán)。結(jié)果見表4。

表4 楓楊葉多糖對小鼠負重游泳時間和耐缺氧時間的影響Table 4 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on weight-bearing swimming time and hypoxia tolerance time in mice(，n=10)

與空白對照組比較：#P ＜0.05，##P ＜0.01。

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3.2.2 楓楊葉多糖對小鼠血清SOD、MDA含量的影響 與空白對照組比較，楓楊葉多糖低、中劑量組對小鼠血清中SOD 與MDA 含量均無顯著性影響（P＞0.05）；高劑量組能夠顯著提高小鼠血清中的SOD含量，降低MDA 含量（P＜0.05）。表明楓楊葉多糖在高劑量下能夠增強小鼠組織的抗氧化能力，減少細胞膜脂過氧化損傷。見表5。

表5 楓楊葉多糖對小鼠血清SOD、MDA含量的影響Table 5 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on serum SOD and MDA content in mice(，n=10)

與空白對照組比較：#P ＜0.05。

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4 討論

目前天然植物多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞功能方面的研究較多，課題組前期亦系統(tǒng)性地綜述了中藥多糖增強免疫、抗疲勞作用[17]。本實驗基于文獻所報道的實驗方法對楓楊葉多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞功能方面進行系統(tǒng)性研究。

免疫功能對于人體健康十分重要，脾臟和胸腺是重要的中樞和外周免疫器官，可起到清除病原和防止病原入侵的重要作用。本文通過環(huán)磷酰胺所致急性免疫力低下小鼠模型、碳粒廓清實驗與二硝基氟苯誘導小鼠耳腫脹實驗，系統(tǒng)性評價楓楊葉多糖對小鼠免疫器官、單核-巨噬細胞吞噬功能和遲發(fā)型變態(tài)反應的影響。結(jié)果表明，楓楊葉多糖能夠促進小鼠胸腺及脾臟的生長，提高肝臟與脾臟巨噬細胞功能，增強淋巴細胞增殖能力，從而拮抗環(huán)磷酰胺所致的器官萎縮等癥狀，促進免疫力低下小鼠各臟器組織的修復與健康。楓楊葉多糖具有良好的增強免疫功能作用，且呈劑量依賴性。在同等作用效果下，楓楊葉多糖的劑量高于黃芪多糖[7]，等同于枸杞多糖[18]，低于靈芝多糖[19]、西洋參多糖[20]等。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基可引發(fā)細胞膜損傷、核酸與DNA損傷、蛋白變性、酶失去活性等，導致多種疾病的發(fā)生與惡化[21]。SOD 是體內(nèi)最主要的自由基清除劑，MDA 為脂質(zhì)過氧化反應終產(chǎn)物，二者可用于評價運動疲勞程度[22]。本實驗結(jié)果表明，楓楊葉多糖能夠延長小鼠負重游泳時間和耐缺氧時間，提高血清中SOD 含量，降低MDA 含量，有效起到抗疲勞作用，且其起效劑量（100 mg/mg）與龍眼多糖[23]、五味子多糖[24]、紅棗多糖[25]、黨參多糖[26]、石斛多糖[10]等傳統(tǒng)補益藥相當。

基于以上實驗結(jié)果，小鼠服用楓楊葉多糖后明顯改善免疫功能，促使機體內(nèi)的肝糖原等能量儲備增加、利用率提高，從而在體外表現(xiàn)為明顯延長負重游泳、耐缺氧的時間；在體內(nèi)表現(xiàn)為提高血清中SOD 含量、降低MDA 含量。增強免疫力、抗疲勞相輔相成，一方面，增強免疫力有助于提高免疫系統(tǒng)識別和清除異常細胞的能力，降低機體慢性疾病發(fā)生的概率；另一方面，免疫力低下與機體過度勞累緊密相關(guān)，特別是現(xiàn)代生活中，長期熬夜所導致的睡眠不足，極易引發(fā)機體疲勞，導致機體免疫系統(tǒng)破壞、免疫力降低，誘發(fā)心梗、心肌炎等各種急慢性疾病，所以，抗疲勞也是增強免疫力的一種方式。

綜上，楓楊葉多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力及抗疲勞作用，提示可作為新型免疫佐劑和抗疲勞制劑應用于藥品、保健品、食品等工業(yè)中，其具體的抗疲勞、免疫機制有待于進一步研究。