綿羊源溶血性曼氏桿菌A2型的分離鑒定及耐藥性分析

梁纖纖，鄭啟銘，李曉卓，馮繼紅，李 月，劉文鍇，韓翔舒，阿卜杜熱合曼·努爾麥麥提，蘇戰(zhàn)強(qiáng)*，夏 俊*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830000；2.新疆昌吉呼圖壁縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，新疆 昌吉 831100；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊 830000；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食動物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（省部共建），烏魯木齊 830000；5.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832061）

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，MH）是巴氏桿菌科曼氏桿菌屬的革蘭氏陰性菌，寄生在反芻動物的上呼吸道中，能夠?qū)е聞游锓窝啄酥了劳觯瑢儆跅l件性致病菌，宿主常常在斷奶、惡劣天氣、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激情況下發(fā)病[1]。MH共分12個(gè)血清型，臨床分離株主要以A1、A2、A6為主[2]，A1通常在牛呼吸道檢出，而A2、A6為感染羊的主要血清型[3]。由MH引起的牛、羊等反芻動物的呼吸道疾病具有較高發(fā)病率和死亡率，給我國乃至全世界的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響[4]。國內(nèi)外關(guān)于溶血性曼氏桿菌病的報(bào)道較多，也有學(xué)者進(jìn)行關(guān)于MH 的滅活疫苗的研究，但由于各血清型之間交叉免疫保護(hù)性較低，疫苗的免疫譜窄，疫苗保護(hù)效果不理想，目前該病仍缺乏有效的防治手段[5，6]。本研究采集病死綿羊肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、病原學(xué)研究、小鼠致病性分析和藥敏試驗(yàn)，為后續(xù)MH的實(shí)驗(yàn)室診斷及疫苗的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

阿勒泰地區(qū)某羊場部分羊只出現(xiàn)咳嗽氣喘、精神萎靡、體溫升高等臨床癥狀，病死羊只剖檢可見肺臟嚴(yán)重充血。送檢病死綿羊肺臟組織4份。

1.1.2 主要材料

馬丁肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自索萊寶科技有限公司；DL2000核酸Marker購自賽國生物科技有限公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物

18～22 g健康雌性BALB/c小鼠12只，購自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防與控制中心實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化

在超凈工作臺中嚴(yán)格無菌操作，將肺臟組織接種于馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)后挑取半透明狀單菌落再次接種于馬丁肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，觀察生長情況，并將純化培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察其形態(tài)。

1.2.2 PCR鑒定及血清型鑒定

使用文獻(xiàn)建立的MH特異性[7]PCR 方法進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定后采用KLIMA等[8]建立的MH A1、A2和A6 血清型特異PCR 方法，對MH 血清型進(jìn)行鑒定，引物序列如表1。反應(yīng)體系為常規(guī)50 μL，瞬離后混合均勻置于PCR 擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃循環(huán)變性30 s，退火溫度為58 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，最后于4 ℃保存。配制1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，參照DNA 2000 Marker，判斷產(chǎn)物的序列大小是否與目標(biāo)值一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果于NCBI進(jìn)行BLAST。

表1 引物序列

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

采用K-B 紙片法檢測MH 分離株對20 種抗菌藥物包括青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、阿奇霉素、林可霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、多黏菌素B、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明進(jìn)行敏感性測定。吸取200 μL細(xì)菌純培養(yǎng)物，均勻涂布于馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，吸收5 min 后，將藥敏片等距貼于培養(yǎng)基上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后判定結(jié)果，藥敏結(jié)果判定按CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 小鼠致病性試驗(yàn)

使用活菌計(jì)數(shù)法測得該分離株的含菌量為1.664×109CFU，將12只小鼠隨機(jī)分為兩組，A組每只腹腔注射0.2 mL 分離株純培養(yǎng)物，B 組每只腹腔注射相同劑量的無菌PBS。觀察小鼠精神狀態(tài)，如出現(xiàn)死亡，立即剖檢觀察肺臟病理變化，并采集死亡小鼠心血及肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化

將肺臟組織接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)后，可見露滴狀、表面光滑、邊緣整齊、呈正圓形的半透明菌落，挑取單菌落接種馬丁肉湯液體培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭染色，鏡檢可見短桿狀、粉紅色兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌。見圖1，圖2。

圖1 馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

圖2 革蘭氏染色鏡檢（物鏡100×）

2.2 PCR鑒定及血清型鑒定

細(xì)菌純培養(yǎng)物經(jīng)MH 特異性PCR 擴(kuò)增后獲得約206 bp 大小目的條帶，見圖3，再進(jìn)行血清型鑒定，得到約106 bp大小目的條帶，見圖4，與血清A2型目的條帶大小相符，因此判定該分離株為A2型菌株。

圖3 分離株特異性PCR鑒定結(jié)果

圖4 分離株血清型PCR鑒定結(jié)果

2.3 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組6 只小鼠注射菌液6 h 后開始出現(xiàn)精神萎靡，眼部分泌紅黃色炎性物質(zhì)，排黃色混濁尿液，隨后幾小時(shí)內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)死亡，15 h內(nèi)全部死亡。對照組小鼠24 h內(nèi)全部存活，無異常表現(xiàn)。將死亡小鼠剖檢，采集心血和肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，與MH相符。

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏結(jié)果如圖5、圖6所示，該分離株對青霉素、頭孢唑林、氨芐西林敏感；對包括頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、阿奇霉素、多黏菌素B、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、克林霉素、林可霉素、阿米卡星、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素在內(nèi)的17種抗菌藥物耐藥。

圖5 藥敏試驗(yàn)1

圖6 藥敏試驗(yàn)2

3 討論與結(jié)論

隨著新疆養(yǎng)羊業(yè)的蓬勃發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，羊患病的風(fēng)險(xiǎn)也日益突出，尤其是羊呼吸系統(tǒng)疾病，主要由支原體、巴氏桿菌和曼氏桿菌引起。曼氏桿菌不僅能使羔羊發(fā)病，也能感染成年羊，一旦發(fā)病，病羊則會消瘦、咳嗽氣喘，嚴(yán)重者還會死亡，制約了新疆養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。國內(nèi)外關(guān)于牛曼氏桿菌的報(bào)道很多，關(guān)于羊的研究卻不夠全面。目前有學(xué)者研究關(guān)于羊曼氏桿菌的滅活疫苗，臨床使用效果卻不佳，可能是由于血清型不同，難以達(dá)到交叉保護(hù)的效果，要制備具有交叉保護(hù)效果的疫苗，關(guān)于曼氏桿菌血清型的研究必不可少。聶荷蓮[9]等的研究中說明溶血性曼氏桿菌A2型的主要來源是羊，江蘇地區(qū)的溶血性曼氏桿菌A2 型也是來源于羊。本研究從新疆地區(qū)的綿羊中也分離到了溶血性曼氏桿菌A2型，為后續(xù)曼氏桿菌的研究和疫苗制備提供參考。

本研究中的分離株僅對青霉素、頭孢唑林、氨芐西林敏感，對其他頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類、喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類、林可酰胺類、四環(huán)素類等多種抗菌藥耐藥，可能是由于新疆地區(qū)治療溶血性曼氏桿菌病僅依靠抗菌藥物，導(dǎo)致多重耐藥性的產(chǎn)生。郜敏[10]等的研究顯示四川MH分離株鏈霉素、阿奇霉素、頭孢氨芐、恩諾沙星和頭孢噻吩耐藥，其中復(fù)方新諾明耐藥性最強(qiáng)。本研究耐藥性的結(jié)果與該研究基本一致，但與馮旭飛[4]等報(bào)道中MH 分離株對四環(huán)素、氟苯尼考、氧氟沙星、恩諾沙星等大部分藥物敏感的結(jié)果存在很大差異，可能由于養(yǎng)殖過程中大量使用相關(guān)抗菌藥物有關(guān)。本研究中的MH存在多重耐藥性，可為后續(xù)MH耐藥基因的研究提供參考，本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果也說明該養(yǎng)殖場對于溶血性曼氏桿菌病的治療用藥情況需要改進(jìn)。