基于四甲基聯(lián)苯胺和吖啶橙間熒光共振能量轉(zhuǎn)移的比率型熒光測定左氧氟沙星

翟好英, 趙文林, 周文俊

內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院, 沱江流域特色農(nóng)業(yè)資源四川省科技資源共享服務(wù)平臺(tái),果類廢棄物資源化四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 內(nèi)江 641100

引 言

左氧氟沙星(LVF, 結(jié)構(gòu)式如示意圖1)是一種第三代氟喹諾酮類藥物, 通過抑制細(xì)菌DNA復(fù)制、 轉(zhuǎn)錄、 修復(fù)和重組所需的拓?fù)洚悩?gòu)酶IV和DNA旋回酶發(fā)揮作用, 對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有廣譜殺菌活性, 廣泛應(yīng)用于治療人類和動(dòng)物體內(nèi)各種細(xì)菌感染、 細(xì)菌性肺炎和免疫缺陷病毒[1-3]。 用藥過量會(huì)產(chǎn)生頭暈、 嗜睡、 說話含糊不清、 惡心、 嘔吐、 肌腱問題、 嚴(yán)重的情緒或行為改變或低血糖等副作用。 在極少數(shù)情況下, LVF甚至可引起主動(dòng)脈損傷, 引發(fā)出血或死亡的風(fēng)險(xiǎn)[4]。 因此, 開發(fā)一種靈敏可靠的LVF檢測方法對于確保用藥量合理、 維護(hù)人體健康具有重要意義。

圖1 (a) TMB的熒光光譜(λex =310 nm) (a), AO的吸收光譜(b), 發(fā)射光譜(λex=405 nm) (c)和(λex=505 nm)(d), LVF的吸收光譜(e)和發(fā)射光譜(λex =390 nm)(f); AO濃度(b)和TMB濃度(c)對FRET體系的影響

目前, 已報(bào)道的檢測LVF的方法主要有: 高效液相色譜法[1, 5]、 電化學(xué)法[4, 6]、 熒光法[7-9]、 高效液相色譜-熒光法[10-11]、 分光光度法[12]、 化學(xué)發(fā)光法[13]等。 這些方法中, 多數(shù)存在儀器昂貴、 分析時(shí)間長、 靈敏度低、 樣品預(yù)處理復(fù)雜等缺點(diǎn)。 熒光法具有成本低、 操作簡單、 靈敏度高、 選擇性好等特點(diǎn)[14], 但其發(fā)射強(qiáng)度可能受到許多因素的影響, 如光電系統(tǒng)(燈和探測器)的漂移、 探針濃度、 自身熒光等, 在定量檢測中容易受到干擾。 比率型熒光傳感器通過測量不同波長的兩種發(fā)射強(qiáng)度之比值, 可以避免上述問題, 得到更高的準(zhǔn)確度和靈敏度。 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是熒光比率探針設(shè)計(jì)中常用的一種傳感機(jī)制, 其中有兩個(gè)熒光團(tuán), 一個(gè)充當(dāng)供體, 另一個(gè)充當(dāng)受體, 激發(fā)態(tài)的供體可通過光子的非輻射躍遷將能量轉(zhuǎn)移到受體而不發(fā)生任何光子發(fā)射, 能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致供體熒光強(qiáng)度降低而受體熒光強(qiáng)度增加, 通過計(jì)算受、 供體兩個(gè)發(fā)射波長的強(qiáng)度比來檢測待測物, 不僅為環(huán)境影響提供內(nèi)置校正, 還可以增加熒光測量的動(dòng)態(tài)范圍[14-15]。 尤其是FRET具有在固定激發(fā)波長下顯著的發(fā)射位移優(yōu)點(diǎn), 可以降低背景干擾, 提高生物分析的靈敏度。

FRET能量傳遞的效率取決于供體發(fā)射光譜和受體吸收光譜重疊的程度、 供體的量子產(chǎn)率、 供體和受體之間的距離(一般小于7 nm[16])等[17-18]。 選擇合適的供體和受體對于FRET體系的構(gòu)建極為重要。 3,3’,5,5’(四甲基聯(lián)苯胺(TMB)是一種常見的芳香胺(結(jié)構(gòu)式如示意圖1), 由于其檢測靈敏度和準(zhǔn)確度高、 穩(wěn)定性好, 且相對于其他底物(如聯(lián)苯胺和鄰苯二胺)無致癌性和誘變性等弊端, 被廣泛應(yīng)用于分析檢測領(lǐng)域[19-21]。 吖啶橙(AO, 結(jié)構(gòu)式如示意圖1)是一種應(yīng)用廣泛的芳香熒光染料[22-23], 其吸收光譜與TMB在310 nm波長激發(fā)下的發(fā)射光譜有明顯重疊, 其在545 nm處的熒光峰可以和400 nm處TMB的熒光峰完全分開, 在理論上為FRET體系的構(gòu)建提供了可能。 隨著TMB濃度的增大, TMB和AO的熒光強(qiáng)度均依次增強(qiáng); 隨著AO濃度的增大, AO熒光強(qiáng)度依次增強(qiáng), 而TMB熒光強(qiáng)度依次減弱, 證明確實(shí)可用TMB和AO分別作為能量供體和能量受體建立FRET體系。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)體系中存在LVF時(shí), TMB熒光強(qiáng)度減弱, AO熒光強(qiáng)度增強(qiáng), FRET能量轉(zhuǎn)移效率明顯增強(qiáng), 并且在一定范圍內(nèi), 546 nm處的熒光強(qiáng)度與402 nm處的熒光強(qiáng)度之比(F546 nm/F402 nm)與LVF濃度之間存在良好的線性關(guān)系。 在此基礎(chǔ)上, 提出了一種簡單、 靈敏、 選擇性好的LVF檢測方法, 并用于鹽酸左氧氟沙星滴眼液、 鹽酸左氧氟沙星膠囊、 鹽酸左氧氟沙星片3種藥物制劑中LVF含量的分析測定, 結(jié)果較滿意。

示意圖1 TMB、 AO和LVF結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

5.0 mmol·L-1TMB儲(chǔ)備液: 準(zhǔn)確稱取0.060 0 g TMB于50 mL容量瓶中, 溶于25 mL無水乙醇, 用超純水定容。 0.10 mmol·L-1TMB工作液: 準(zhǔn)確移取1.0 mL TMB儲(chǔ)備液至50 mL容量瓶中, 先加入25 mL無水乙醇, 再用超純水定容。 pH 5.0 NaAc-HCl緩沖液: 0.20 mol·L-1NaAc和0.10 mol·L-1HCl在pH計(jì)上配制而成。 LVF工作液: 0.20 mmol·L-1。 AO(分子式: C17H20ClN3·1/2ZnCl2)儲(chǔ)備液: 1.0 mmol·L-1。 AO工作液: 0.50 mmol·L-1。 除LVF為標(biāo)準(zhǔn)品外, 實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純(AR), 實(shí)驗(yàn)用水均為超純(UP)水(18.25 MΩ cm 25 ℃)。 鹽酸左氧氟沙星膠囊、 鹽酸左氧氟沙星片、 鹽酸左氧氟沙星滴眼液均購自內(nèi)江某藥店。

用F-4600型的熒光分光光度計(jì)(日本日立)掃描并記錄樣品的熒光光譜, 測定參數(shù): 激發(fā)狹縫為2.5 nm, 發(fā)射狹縫為5 nm, 光電倍增管(PMT)電壓為700 V。 采用U-3010型的紫外可見分光光度計(jì)(日本日立)掃描并記錄樣品的紫外吸收光譜。 用pHS-3E的pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)調(diào)節(jié)溶液的pH值。

1.2 方法

1.2.1 FRET體系的構(gòu)建

分別移取不同體積的TMB工作液(0～1.5 mL)于10 mL比色管中, 依次加入1.0 mL pH 5.0NaAc-HCl緩沖液和0.80 mL AO工作液, 定容至5 mL, 搖勻, 在室溫下靜置7 min。 待體系反應(yīng)完全后, 以310 nm為激發(fā)波長, 在熒光分光光度計(jì)上掃描并記錄330～630 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

依次移取1.0 mL TMB工作液和1.0 mL pH 5.0 NaAc-HCl緩沖液于10 mL比色管中, 分別加入不同體積(0～0.80 mL)的AO工作液, 定容至5 mL, 搖勻, 在室溫下靜置7 min。 在相同激發(fā)波長下, 用熒光分光光度計(jì)掃描并記錄相同波長范圍內(nèi)的熒光光譜。

1.2.2 LVF的比率熒光傳感器的構(gòu)建

依次準(zhǔn)確移取1.0 mL TMB工作液、 1.0 mL pH 5.0 NaAc-HCl緩沖液于10 mL比色管中, 向其中加入不同體積的LVF工作液, 隨后加入0.80 mL AO工作液, 定容至5 mL, 搖勻, 室溫下靜置反應(yīng)9 min。 在310 nm激發(fā)波長下, 在熒光分光光度計(jì)上掃描并記錄其330～630 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。 計(jì)算402和546 nm處的熒光強(qiáng)度比值F546 nm/F402 nm, 以F546 nm/F402 nm為縱坐標(biāo), LVF濃度為橫坐標(biāo), 繪制工作曲線。

1.2.3 樣品的處理與分析

鹽酸左氧氟沙星滴眼液: 5 mL·支-1, 含LVF(以C18H20FN3O4計(jì))15 mg, 即3 mg·mL-1。 使用時(shí)移取1.2 mL, 用超純水定容至50 mL, 稀釋至與LVF工作液相當(dāng)?shù)臐舛取?/p>

鹽酸左氧氟沙星膠囊: 20粒·盒-1, 0.1 g·粒-1(以C18H20FN3O4計(jì))。 參照參考文獻(xiàn)[24-25], 隨機(jī)取5粒膠囊, 用研缽將其中的粉末研細(xì)。 稱取適量粉末, 約含LVF 0.1 g, 用適量0.1 mol·L-1HCl溶解, 定容100 mL。 用0.22 μm的針頭過濾器過濾, 用超純水稀釋至與LVF工作液相當(dāng)?shù)臐舛取?/p>

鹽酸左氧氟沙星片劑: 10片·盒-1, 0.2 g·片-1(以C18H20FN3O4計(jì))。 處理方法與鹽酸左氧氟沙星膠囊相同。

準(zhǔn)確移取各樣品溶液0.70 mL, 按1.2.2的方法測定LVF含量, 并做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 FRET體系的構(gòu)建

TMB的熒光光譜和AO的吸收光譜有相當(dāng)程度的重疊, 且TMB的熒光峰和AO的熒光峰可以明顯分開[圖1(a)], 說明TMB和AO之間理論上可以發(fā)生FRET。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 在pH 5.0 NaAc-HCl緩沖溶液中, 保持TMB濃度不變, 以310 nm的波長激發(fā), 增加AO濃度, AO熒光強(qiáng)度依次增加, TMB熒光強(qiáng)度則依次降低[圖1(b)]。 在相同實(shí)驗(yàn)條件下, 保持AO濃度不變, 增加TMB濃度, TMB和AO的熒光強(qiáng)度均依次增大[圖1(c)]。 這充分證明了能量供體TMB和能量受體AO之間可以建立FRET體系。 為了得到較強(qiáng)的FRET效率, 選擇80 μmol·L-1AO和20 μmol·L-1TMB構(gòu)建FRET體系。

2.2 TMB熒光量子產(chǎn)率的檢測

以溶解在0.1 mol·L-1NaOH中的熒光素(熒光量子產(chǎn)率為0.91)[26]為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 用origin做圖求斜率[圖2(a)], 再根據(jù)式(1)進(jìn)行計(jì)算, 得TMB的熒光量子產(chǎn)率23.6%。

(1)

圖2 (a) TMB的熒光量子產(chǎn)率圖; (b) LVF濃度對FRET體系的影響

式(1)中,φ為TMB的熒光量子產(chǎn)率;φs為熒光素的熒光量子產(chǎn)率;As為熒光素在激發(fā)波長490 nm下的熒光積分面積, 積分范圍為470～650 nm;Ax為TMB在激發(fā)波長310 nm下的熒光積分面積, 積分范圍為330～530 nm;Ix為TMB在310 nm波長處的吸光強(qiáng)度;Is為熒光素在490 nm波長下的吸光強(qiáng)度;n為溶劑折射率, 在水中nx=ns[27]。

2.3 供體-受體之間距離的計(jì)算

根據(jù)能量轉(zhuǎn)移理論, 通過如式(2)—式(5)計(jì)算供體-受體之間距離

(2)

(3)

(4)

(5)

式中,F(λ)為供體在λ處的熒光強(qiáng)度,ε(λ)為受體在處的摩爾吸收系數(shù),J即表示供體熒光光譜和受體吸收光譜之間重疊部分的積分面積;K2為偶極空間取向因子, 因?yàn)槟芰抗w和受體的空間分布可以被認(rèn)為是隨機(jī)且均等的, 故取2/3;N取水和有機(jī)溶劑平均折射率1.37;φ為供體的熒光量子產(chǎn)率;R0表示E=50%時(shí), 供體和受體之間的距離;r是供體和受體之間的能量轉(zhuǎn)移距離;F表示加入受體后供體的熒光強(qiáng)度,F0表示不加入受體時(shí)供體的熒光強(qiáng)度,E表示能量轉(zhuǎn)移效率[28-29]。 計(jì)算結(jié)果為:J=4.48×10-15cm3·L·mol-1,R0=2.37 nm,E=62.5%,r=2.17 nm。R0和r均小于7 nm, 進(jìn)一步表明TMB和AO之間確實(shí)能發(fā)生FRET。

2.4 LVF對FRET體系的影響

當(dāng)體系中加入適量LVF后, TMB熒光強(qiáng)度降低, AO熒光強(qiáng)度增加, 體系的FRET效率明顯增大[圖2(b)], 且AO在546 nm處的熒光強(qiáng)度和TMB在402 nm處的熒光強(qiáng)度之比F546 nm/F402 nm與LVF濃度之間存在線性關(guān)系。 由此可以建立一種測定LVF含量的新型比率型熒光傳感器。

2.5 LVF傳感器機(jī)理探討

在酸性介質(zhì)中, TMB中氨基質(zhì)子化而帶正電荷, 且AO和LVF均以陽離子形式存在, 故三者之間不易發(fā)生靜電作用, 且各有機(jī)分子也不易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 LVF的吸收光譜和TMB的熒光光譜在350～400 nm之間有相當(dāng)程度重疊[圖1(a)], 固定TMB的濃度, 增加LVF的濃度, TMB的熒光依次減弱, LVF的熒光依次增強(qiáng)[圖3(a)]; 固定LVF的濃度, 增加TMB的濃度, TMB和LVF的熒光皆依次增強(qiáng)[圖3(b)], 說明供體TMB和受體LVF之間發(fā)生了FRET。 此外, AO的吸收光譜和LVF的熒光光譜在450～550 nm之間有相當(dāng)程度重疊[圖1(a)], 固定AO的濃度, 增加LVF的濃度, LVF和AO的熒光均依次增加[圖3(c)]; 固定LVF的濃度, 增加AO的濃度, LVF的熒光依次減弱, AO的熒光則依次增強(qiáng)[圖3(d)], 說明LVF作為供體將熒光能量轉(zhuǎn)移給受體AO。 由此說明, LVF在TMB和AO間起橋梁作用, 其將吸收的TMB的熒光能量轉(zhuǎn)移給AO, 從而提高了體系的FRET效率, 故可根據(jù)TMB和AO熒光強(qiáng)度比值建立測定LVF含量的比率型熒光傳感器。 體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的機(jī)理如示意圖2。

圖3 LVF濃度(a); TMB濃度(b); LVF濃度(c)和AO濃度(d)對FRET體系的影響

示意圖2 基于TMB和AO之間FRET的LVF比率

2.6 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.6.1 緩沖介質(zhì)及酸度的選擇

pH對TMB的熒光強(qiáng)度影響較大, 在酸性條件下TMB熒光較強(qiáng), 堿性條件下熒光減弱甚至趨于0, 故考察了不同緩沖介質(zhì)及酸度對FRET體系的影響。 分別比較了5種不同的緩沖溶液(PBS、 Tris-HCl、 B-R、 NaAc-HCl、 NaAc-HAc)對LVF比率熒光傳感器的靈敏度和線性關(guān)系的影響, 結(jié)果表明, 在NaAc-HCl緩沖溶液中, 傳感器的線性范圍最寬、 靈敏度和線性關(guān)系最好, 故選擇NaAc-HCl緩沖溶液作為介質(zhì)。 研究了不同pH值對體系靈敏度的影響, 結(jié)果表明, 在NaAc-HCl緩沖溶液中, 當(dāng)pH 5.0或5.5時(shí), 體系的靈敏度都比較好, 如圖4(a)所示。 而pH 5.0時(shí), 體系的線性關(guān)系更好、 線性范圍更寬[圖4(b), (c)], 故選擇pH 5.0的緩沖溶液。 研究了緩沖溶液不同用量對體系靈敏度的影響, 緩沖溶液的用量對體系影響不大, 綜合考慮體系靈敏度和樣品溶液體積, 選擇1.0 mL緩沖溶液最適宜。 故選擇1.0 mL pH 5.0的NaAc-HCl緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì)。

圖4 (a) pH值及pH 5.0 (b)和pH 5.5(c)的緩沖介質(zhì)對FRET體系的影響

2.6.2 穩(wěn)定性

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下, 探究了反應(yīng)時(shí)間對熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系的影響。 結(jié)果表明, 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到7 min時(shí), 體系基本反應(yīng)完全, 連續(xù)掃描1 h, 體系的熒光強(qiáng)度基本不變, 說明該體系較穩(wěn)定[圖5(a)]。 為使反應(yīng)充分進(jìn)行, 選擇反應(yīng)時(shí)間為9 min。

圖5 (a)時(shí)間對FRET體系的影響; (b)線性回歸方程

2.7 線性回歸方程

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下, 以LVF濃度(mmol·L-1)為橫坐標(biāo),F546 nm/F402 nm為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。 如圖5(b), 當(dāng)LVF濃度在2～80 μmol·L-1范圍內(nèi), 體系的F546 nm/F402 nm與LVF濃度之間存在良好的線性關(guān)系。 其線性回歸方程為F546 nm/F402 nm=87.92c+3.108, 相關(guān)系數(shù)R為0.999 3, 檢出限為15.7 nmol·L-1(3s/k,s為11次空白平行樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為線性回歸方程的斜率)。 與文獻(xiàn)已報(bào)道的分析方法相比(表1), 本研究設(shè)計(jì)的比率型熒光探針具有靈敏度高、 選擇性好等特點(diǎn)。

表1 不同方法檢測LVF的性能比較

2.8 選擇性

圖6 共存物質(zhì)對FRET體系的影響

2.9 實(shí)際樣品分析

按照1.2.3方法分別對鹽酸左氧氟沙星膠囊、 鹽酸左氧氟沙星片、 鹽酸左氧氟沙星滴眼液3種商業(yè)LVF藥物制劑進(jìn)行處理, 得到3種不同的樣品溶液。 準(zhǔn)確移取一定量的不同樣品溶液, 按照1.2.2對其中的LVF含量分析測定, 并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果表明, 3種樣品的回收率均在93%～97%之間, RSD%均小于5%, 且3種樣品中LVF含量的測定值與實(shí)際藥品的標(biāo)示值基本吻合, 說明基于TMB和AO間FRET體系的比率型熒光探針用于實(shí)際藥品中LVF含量的測定, 方法可靠。 分析結(jié)果如表2所示。

表2 樣品分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié) 論

基于能量供體TMB和能量受體AO之間FRET效應(yīng), 設(shè)計(jì)開發(fā)了一種新型的高靈敏檢測LVF的比率型熒光探針。 該比率型熒光探針具有單波長激發(fā)的雙發(fā)射帶, 可以消除環(huán)境影響, 提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和方法的選擇性。 在最優(yōu)條件下, 對LVF的線性檢測范圍為2～80 μmol·L-1, 檢出限為15.7 nmol·L-1。 該方法操作簡單、 快速、 選擇性好、 靈敏度高, 分析結(jié)果可靠, 直接用于商用藥物制劑中LVF含量的檢測, 為新型比率型熒光傳感器的設(shè)計(jì)與應(yīng)用提供了研究參考。