安徽甜瓜和栝樓蔓枯病的病原菌鑒定及其有效藥劑篩選

夏智杰,張 雷,宋江華,傅 敏,張立新,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230036; 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,安徽 合肥 230036)

瓜類蔓枯病(gummy stem blight)是一種典型的世界性土傳病害[1],可危害甜瓜、黃瓜等瓜類蔬菜莖蔓,致其產(chǎn)生褐色油漬狀斑點(diǎn),嚴(yán)重時(shí)造成莖蔓分叉處開裂枯死,植株死亡率高達(dá)60%～80%,減產(chǎn)30%以上[2-4]。該病害于1869年在德國(guó)首次被發(fā)現(xiàn),隨后在美國(guó)、瑞典、加拿大、日本、印度、中國(guó)新疆等地區(qū)相繼報(bào)道了甜瓜、西瓜、黃瓜等瓜類作物的發(fā)生和危害[5]。目前引起瓜類蔓枯病的病原菌主要有Stagonosporopsiscitrull,Stagonosporopsiscucurbitacearum和Stagonosporopsiscaricae[6]。據(jù)報(bào)道,S.citrulli引起的黃瓜蔓枯病在美國(guó)北卡州是僅次于根結(jié)線蟲的黃瓜第二大病害[7];在我國(guó),S.cucurbitacearum引起廣東省苦瓜蔓枯病暴發(fā)流行,部分設(shè)施大棚中苦瓜蔓枯病發(fā)病率超過80%[8];在吉林省S.citrulli引起西瓜主產(chǎn)區(qū)暴發(fā)蔓枯病,導(dǎo)致大面積失收,嚴(yán)重影響了西瓜生產(chǎn)[9]。該病害具有發(fā)病早、危害重、損失大等特點(diǎn)[10],對(duì)瓜類作物的安全生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。

蔓枯病在瓜類植株整個(gè)生育期均可發(fā)生,苗期蔓枯病的發(fā)病率較低,孕蕾期植株開始表現(xiàn)癥狀,生長(zhǎng)中后期發(fā)病最為嚴(yán)重。葉片和莖蔓是最主要的發(fā)病部位,葉片發(fā)病初期可出現(xiàn)水漬狀小斑點(diǎn),后期逐漸發(fā)展為輪紋狀的黃褐色斑點(diǎn)或呈“V”形病斑,嚴(yán)重時(shí)可在發(fā)病部位觀察到黑色點(diǎn)狀的分生孢子器。莖蔓部發(fā)病初期可出現(xiàn)水漬狀褐色病斑,隨著病情發(fā)展,病斑可沿莖蔓拓展幾厘米到幾十厘米,后期病斑上可出現(xiàn)散生黑色顆粒物[11-12]。近年來,隨著安徽省瓜類蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大,瓜類蔓枯病的發(fā)生也呈加重趨勢(shì)。2021—2022年在舒城和巢湖地區(qū)的甜瓜和栝樓田間出現(xiàn)了嚴(yán)重的蔓枯病,為明確這些瓜類蔓枯病的病原菌類型,本研究對(duì)該地區(qū)的病樣進(jìn)行了采集、病原菌分離和鑒定,以及室內(nèi)藥劑篩選工作,以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中瓜類蔓枯病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品：2021—2022年分別從安徽舒城縣、巢湖市的甜瓜和栝樓田塊,采集蔓枯癥狀的莖蔓組織,放于自封袋內(nèi),帶回實(shí)驗(yàn)室用于病原菌的分離;金香玉甜瓜種子(武漢金陽(yáng)紅種苗農(nóng)業(yè)有限公司)、皖蔞9號(hào)栝樓種子(安徽有余跨越瓜蔞食品開發(fā)有限公司)催芽育苗后用于病原菌致病性測(cè)定。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基;燕麥培養(yǎng)基(oat meal agar, OA);誘導(dǎo)產(chǎn)孢培養(yǎng)基：原PDA培養(yǎng)基配方中加入酵母提取物2 g。

試劑及儀器：DL2000 DNA Marker、2×TaqMaster Mix,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。RLD-500C-4 人工氣候箱,寧波樂電儀器制造有限公司;C1000 Touch PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司;CKX53倒置顯微鏡,日本Olympus株式會(huì)社。

供試藥劑：98%啶酰菌胺原藥,武漢曙歐科技有限公司;97%咪鮮胺原藥,江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司;95%苯醚甲環(huán)唑原藥,深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司;98%戊唑醇原藥,97%多菌靈原藥,98%吡唑醚菌酯原藥,先正達(dá)作物保護(hù)有限公司;97%異菌脲原藥,湖北成豐化工有限公司。

1.2 病原菌的分離和純化

采用組織分離法[13]對(duì)病原菌進(jìn)行分離和純化。將采集得到的具有蔓枯癥狀的莖蔓用滅菌剪刀在病健交界處剪取2～3 mm的病組織,先后浸入0.1%HgCl290 s、75%乙醇45 s 進(jìn)行表面消毒,無菌水沖洗3次后,用滅菌的濾紙吸干病組織表面水分,最后轉(zhuǎn)移至PDA平板上,置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng),待長(zhǎng)出菌落后挑取菌落邊緣的菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后轉(zhuǎn)接到另一平板上純化培養(yǎng)。在新鮮的PDA中進(jìn)行單孢分離,獲得純化的后代,并對(duì)分離所得的菌株進(jìn)行編號(hào),于PDA斜面保存。

1.3 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上,26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d,觀察并記錄菌落形態(tài)特征;參照李英等[14]誘導(dǎo)蔓枯病菌產(chǎn)孢的方法, 將純化后的菌株接種于誘導(dǎo)產(chǎn)孢培養(yǎng)基上,26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后,在40 W紫外燈下(20 h黑暗/4 h紫外)下30 cm照射4 d,在倒置熒光顯微鏡下觀察菌株的分生孢子形態(tài),并測(cè)量分生孢子大小;同時(shí)將純化后的菌株接種于燕麥培養(yǎng)基上,26 ℃黑暗條件培養(yǎng)7 d后,在40 W紫外燈下(20 h黑暗/4 h紫外)下30 cm照射4 d,在倒置熒光顯微鏡下觀察菌株的子囊孢子形態(tài),并測(cè)量子囊孢子大小。

1.4 目的位點(diǎn)的序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)分離地點(diǎn)及寄主植物的不同,隨機(jī)選擇5個(gè)代表性菌株,其中安徽舒城3株(SC1-1、SC2-1、SC3-1),巢湖市2株(CH1-1、CH2-1)進(jìn)行分子鑒定。采用CTAB法提取各菌株的基因組DNA,利用3個(gè)目的位點(diǎn)的引物對(duì)測(cè)試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,包括ITS(ITS-1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′, ITS-4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATA-3′)[15]、TUB2基因(T1： 5′-AACATGCGTGAGATTG-3′, Bt2b： 5′-ACCCTCAGTGTAGTGA-3′)[16]和LSU(LROR： 5′-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3′, LR7： 5′-TACTACCACCAAGATCT-3′)[17], 以上引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。

25 μL PCR擴(kuò)增體系：10 μmol·L-1上下游引物各1.0 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、基因組DNA 1.0 μL,ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。ITS、TUB2基因擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃再次延伸5 min。LSU位點(diǎn)擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s,48 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),純化后送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列比對(duì)和校對(duì)后,將獲得的測(cè)試菌株目的基因序列遞交GenBank,各菌株目的片段的序列登錄號(hào)見表1。同時(shí)下載Stagonosporopsis屬內(nèi)各近緣種模式菌株及參考菌株的目的序列,經(jīng)Clustal X 1.83序列比對(duì),并手動(dòng)截齊兩端,按LSU-ITS-TUB2順序連接成多基因聯(lián)合序列?；谧畲笏迫环?maximum likelihood, ML),設(shè)置自展值(boot straps)為1 000,用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 菌株信息及目的位點(diǎn)序列

1.5 致病性測(cè)定

采用分生孢子懸浮液進(jìn)行致病性測(cè)定。收集誘導(dǎo)產(chǎn)孢培養(yǎng)基上的分生孢子,無菌水漂洗后調(diào)節(jié)分生孢子懸浮液濃度約為107mL-1。將甜瓜及栝樓種子消毒、催芽,出苗后長(zhǎng)至4片真葉時(shí),取大小相近的健康幼苗,用75%乙醇擦拭消毒、無菌水清洗后,晾干。將配制好的孢子懸浮液噴灑幼苗葉片及莖部至有水滴流下,另設(shè)無菌水處理為對(duì)照組,每次處理重復(fù)3次,置于25 ℃人工氣候箱內(nèi)保濕培養(yǎng)(相對(duì)濕度85%,12 h光照/12 h黑暗),逐日觀察記錄幼苗發(fā)病情況。待接種的幼苗發(fā)病后,從病組織處再分離病原菌,經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定后,驗(yàn)證是否與原接種病原菌相同,從而完成柯赫氏法則。

1.6 病原菌室內(nèi)藥劑篩選

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定7種藥劑對(duì)瓜類蔓枯病病原菌的毒力。供試藥劑母液用無菌水溶解稀釋,設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度。97%異菌脲、95%苯醚甲環(huán)唑濃度梯度為5、1、0.5、0.1、0.05 μg·mL-1,98%啶酰菌胺、97%咪鮮胺濃度梯度為1、0.5、0.1、0.05、0.01 μg·mL-1,98%吡唑醚菌酯、98%戊唑醇濃度梯度為25、5、1、0.5、0.1 μg·mL-1,97%多菌靈濃度梯度為200、100、50、25、5 μg·mL-1。

無菌操作條件下,將不同濃度的藥劑以1∶9等比例分別加入到滅菌的PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻后等量倒入培養(yǎng)皿中,制成含有相應(yīng)濃度藥劑的平板,以加入等量無菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。將供試菌株在PDA平板26 ℃培養(yǎng)5 d后,用打孔器在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌碟,接種到含藥培養(yǎng)基中央和對(duì)照PDA平板中,每個(gè)濃度為1組處理,每組處理重復(fù)3次。培養(yǎng)至對(duì)照組菌落直徑為培養(yǎng)皿直徑的2/3時(shí),采用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-6 mm)×100%。按最小二乘法作毒力回歸方程、EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜和栝樓蔓枯病田間癥狀

甜瓜和栝樓蔓枯病主要侵染其莖蔓,初期癥狀為在近節(jié)處產(chǎn)生褐色油浸狀斑點(diǎn),略凹陷(圖1-a),嚴(yán)重時(shí),莖蔓近節(jié)處開裂,同時(shí)伴有黃白色流膠,干燥后呈紅褐色或黑色(圖1-b);發(fā)病后期病節(jié)處干枯,凹陷,呈灰白色,表面散生黑色小點(diǎn)(圖1-c)。

a, c, 甜瓜蔓枯病田間發(fā)病癥狀;b, 栝樓蔓枯病田間發(fā)病癥狀。a, c, Diseased symptoms of C. melo in the field; b, Diseased symptoms of T. kirilowii in the field.圖1 甜瓜和栝樓蔓枯病田間發(fā)病癥狀Fig.1 Field sympthoms of gummy stem blight on Cucumis melo and Trichosanthes kirilowii

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

對(duì)采集的6份甜瓜及4份栝樓病樣進(jìn)行組織分離,從甜瓜病樣中分離得到22個(gè)純化菌株,從栝樓病樣中得到12個(gè)純化菌株。從甜瓜和栝樓莖蔓處分離得到蔓枯病的病原菌菌株形態(tài)無明顯差異。各分離菌株在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后呈現(xiàn)白色菌落,氣生菌絲發(fā)達(dá)、棉絮狀,中間稠密, 略隆起(圖2-a),初白色, 老化后灰白色,菌落背面初白色, 后期變?yōu)槟G色, 基生菌絲深褐色(圖2-b);分生孢子短圓形至圓柱形,兩端鈍圓,無色,平均大小為5.6 μm×3.0 μm,單胞(圖2-c);假囊殼內(nèi)子囊呈棍棒狀,無色透明,頂端鈍圓,內(nèi)含8個(gè)子囊孢子(圖2-d);子囊孢子為無色透明雙胞,橢圓形,孢子橫向有一個(gè)分隔膜,隔膜處明顯縊縮將孢子分為兩部分細(xì)胞,上細(xì)胞較寬,頂端較鈍,下細(xì)胞較窄,子囊孢子平均大小為12.85 μm×5.7 μm(圖2-e)。

a, b,菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落形態(tài);c,分生孢子,標(biāo)尺為10 μm;d,子囊,標(biāo)尺為10 μm;e,子囊孢子,標(biāo)尺為10 μm。a, b,Colony characters of isolates on PDA medium for 7 d; c,Conidia, scale bar=10 μm; d,Asci, scale bar=10 μm; e,Ascospores, scale bar=10 μm.圖2 病菌分離物的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of the isolates

2.3 多位點(diǎn)序列分析

為明確甜瓜和栝樓蔓枯病的病原菌種類,根據(jù)分離地點(diǎn)、寄主植物以及分離頻率,選取5個(gè)代表性菌株進(jìn)行分子鑒定。對(duì)其3個(gè)位點(diǎn) (ITS、TUB2、LSU) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)序后進(jìn)行序列同源性比對(duì)及多位點(diǎn)序列聚類分析。BLAST序列同源性搜索結(jié)果顯示,菌株SC1-1、SC2-1、SC3-1、CH1-1、CH2-1的rDNA-ITS、rDNA-LSU序列與GenBank中參考菌株S.citrulli(MT040723和MN943656)的同源性為100%;測(cè)試菌株的β-tublin基因序列與參考菌株S.citrulli(MH853667)的同源性為99.06%?；贚SU、ITS、TUB2的多位點(diǎn)序列聚類分析結(jié)果,測(cè)試菌株與參考菌株S.citrulliCBS 214.65以90%的自舉置信值緊密地聚在一起(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及多位點(diǎn)序列分析,確定引起安徽省甜瓜和栝樓蔓枯病的病原菌為S.citrulli。測(cè)試菌株目的位點(diǎn)序列的GenBank登錄號(hào)見表1。

圖3 基于LSU、ITS、TUB2的位點(diǎn)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree inferred from concatenated sequences of partial LSU, ITS and TUB2

2.4 病原菌致病性測(cè)定

將代表性菌株的分生孢子懸浮液噴霧接種進(jìn)行致病性測(cè)定,結(jié)果表明,供試菌株對(duì)甜瓜和栝樓幼苗均具有致病性。甜瓜幼苗接種2 d后,葉片失綠呈淡黃色,莖蔓處呈油浸狀,整株猝倒,且從病斑上均能再次分離純化出相同的病原菌;栝樓幼苗接種3 d后,栝樓葉片失綠干枯出現(xiàn)不規(guī)則黃褐色病斑,莖蔓干枯脫水變?yōu)辄S褐色;5 d后栝樓葉片完全干枯,莖蔓表面分布大量黑色分散小點(diǎn),與田間瓜類蔓枯病發(fā)病癥狀相似,對(duì)照組未發(fā)病。將發(fā)病組織重新進(jìn)行病原菌的分離和鑒定,確定與原接種的菌株一致(圖4)。

a,甜瓜幼苗對(duì)照;b,接種菌株S.citrulli SC1-1的甜瓜幼苗;c,栝樓幼苗對(duì)照;d,接種菌株S.citrulli CH1-1的栝樓幼苗。a, Control(C. melo seedlings); b, C. melo seedlings inoculated with S. citrulli SC1-1; c, Control (T. kirilowii seedlings); d, T. kirilowii seedlings inoculated with S. citrulli CH1-1.圖4 蔓枯病菌在甜瓜(2 d)和栝樓(5 d)幼苗上的致病性Fig.4 Pathogenicity of S. citrulli isolates on C. melo(2 d) and T. kirilowii (5 d) seedlings

2.5 七種藥劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

通過菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了7種藥劑對(duì)甜瓜和栝樓蔓枯病的病原菌S.citrulli(SC1-1、SC2-1、SC3-1、CH1-1、CH2-1)的毒力(表2、表3)。結(jié)果表明,啶酰菌胺、咪鮮胺的EC50值在0.010 6～0.043 8 μg·mL-1,這2種殺菌劑抑菌效果最好;其次為異菌脲和苯醚甲環(huán)唑,EC50值在0.867 5～1.767 5 μg·mL-1;多菌靈的抑菌效果最差,其EC50值最高,為40.677 7 μg·mL-1。

表2 七種殺菌劑對(duì)安徽舒城菌株的室內(nèi)毒力測(cè)定

表3 七種殺菌劑對(duì)安徽巢湖菌株的室內(nèi)毒力測(cè)定

3 討論

蔓枯病是世界范圍內(nèi)葫蘆科植物的主要病害,該病害于1823年在瑞典首次被報(bào)道[18]。S.caricae、S.citrulli和S.cucurbitacearum是引起蔓枯病的病原菌,3種病原菌具有相同的形態(tài)特征和重疊的地理、寄主范圍[6,18-19]。瓜類蔓枯病病原菌以前的鑒定方法主要是基于形態(tài)學(xué),以及部分大亞基(LSU)和小亞基(SSU)的核苷酸序列,但由于 LSU和 SSU 序列數(shù)據(jù)不能提供足夠的系統(tǒng)發(fā)育信息,無法區(qū)分密切相關(guān)的屬或種[20-22]。學(xué)者們利用LSU、ITS與TUB2多位點(diǎn)序列分析,為亞隔孢殼科的分類鑒定提供了強(qiáng)大的系統(tǒng)發(fā)育主干,可清楚區(qū)分該科中各屬內(nèi)的近緣種[23-25]。

本研究對(duì)安徽省引起甜瓜和栝樓蔓枯病的病原菌進(jìn)行鑒定,通過組織分離法從病樣組織中分離獲得菌落形態(tài)一致的分離物,通過致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特征和多位點(diǎn)序列分析,將獲得的5株代表性菌株確定為S.citrulli。目前,在21個(gè)不同屬 37種瓜類上發(fā)現(xiàn)蔓枯病[26],其中,甜瓜和西瓜是最為易感的品種[27]。Huang等[28]將采集于臺(tái)灣地區(qū)的西瓜蔓枯病的病原菌鑒定為S.citrulli,但譚蕊[29]將來自于西南地區(qū)的西瓜蔓枯病的病原菌鑒定為S.cucurbitacearum和S.caricae;秦健等[8]鑒定廣東省苦瓜蔓枯病的病原為S.cucurbitacearum。結(jié)合前人研究報(bào)道,筆者認(rèn)為我國(guó)瓜類蔓枯病的病原菌存在3個(gè)種,且可侵染多種葫蘆科作物,但不同地理區(qū)域瓜類作物蔓枯病的病原菌種類是否存在明顯差異,這有待進(jìn)一步開展廣泛的調(diào)查和研究。

目前,化學(xué)防治仍為防治瓜類蔓枯病的主要手段。本研究測(cè)定了7種殺菌劑對(duì)蔓枯病病原菌的毒力,其中咪唑類殺菌劑咪鮮胺和煙酰胺類殺菌劑啶酰菌胺對(duì)瓜類蔓枯病菌S.citrulli的抑制效果最佳,這與前人報(bào)道的咪鮮胺和啶酰菌胺對(duì)瓜類蔓枯病病原菌的室內(nèi)抑菌效果一致[30]。但煙酰胺類殺菌劑作用位點(diǎn)單一, 病原菌極易產(chǎn)生抗性。Thomas等[31]和Keinath等[32]報(bào)道美國(guó)部分地區(qū)西瓜蔓枯病菌S.citrulli已對(duì)啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性。建議在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中啶酰菌胺與其他殺菌劑混合使用或交替使用,以提高防治效果和避免產(chǎn)生抗藥性。此外,有研究表明,播種感染的種子,即使是低水平的種傳接種也會(huì)導(dǎo)致溫室和大田蔓枯病的嚴(yán)重發(fā)生[33]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),在感染蔓枯病死亡植株附近11%～15%的幼苗可表現(xiàn)出蔓枯病癥狀[34]。因此,播種無菌種子和及時(shí)清理田間蔓枯病植株也十分必要。