感赤星病與健康煙葉在腈菌唑應用后的葉際微生態(tài)

張 藝,王 豐,蔡劉體,汪漢成,熊 晶,陳興江

(1.貴州大學 農(nóng)學院,貴州 貴陽 550025; 2.貴州省煙草科學研究院,貴州 貴陽 550081; 3.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司,貴州 畢節(jié) 551700)

煙草赤星病(tobacco brown spot)是由子囊菌亞門鏈格孢屬(Alternariasp.)真菌引起的煙草葉斑病,主要發(fā)生在煙葉成熟期,典型癥狀為褐色同心輪紋病斑,溫濕度適宜時可大面積流行成災[1-3]。目前,煙草赤星病的防治主要以化學防治為主。腈菌唑是一種高效、低毒、廣譜、兼具保護和治療作用的三唑類殺菌劑,對由子囊菌、擔子菌引起的病害具有較好防效[4-5],主要通過抑制真菌麥角甾醇的生物合成、破壞細胞膜的完整性和流動性,以及細胞的抗逆性達到殺菌目的[6]。目前,該藥劑在我國主要登記用于子囊菌引起的黑斑病、葉斑病、白粉病等病害的防治。在煙葉生產(chǎn)上,該藥劑主要用于煙草白粉病、赤星病的防治[7]。

植物葉際作為微生物的主要棲息地,為微生物的定殖提供了良好的生存環(huán)境。葉際微生物的菌群結(jié)構(gòu)與病害的發(fā)生密切相關[8-9]。已有的研究發(fā)現(xiàn),健康與感病煙葉組織葉際微生物在菌群結(jié)構(gòu)與多樣性上均存在差異。目前,煙草赤星病危害期其葉際真菌和細菌的菌群組成已多有報道[10]。赤星病發(fā)生初期時,不同成熟度健康與感病煙葉的優(yōu)勢真菌和細菌具有相似性,真菌優(yōu)勢菌屬均包括鏈格孢屬、亞隔孢殼屬、枝孢霉屬,細菌優(yōu)勢菌屬均包括假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬細菌[11]。赤星病發(fā)生中后期時,感赤星病煙葉葉際細菌群落中還存在大量泛菌屬細菌[12]。病害的發(fā)生會改變?nèi)~際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性,同時,葉際微生物的菌群組成也會受寄主葉片成熟度、環(huán)境及藥劑的使用而發(fā)生變化[13]。已有的研究發(fā)現(xiàn),菌核凈可顯著抑制煙葉葉際鞘脂單胞菌屬、黃色桿菌屬和沙雷氏菌屬菌群的豐度[14],甲氧基丙烯酸酯類的醚菌酯在防治煙草赤星病的過程中可顯著抑制鏈格孢屬、假單胞菌屬、泛菌屬等菌屬的豐度[15]。當前,腈菌唑在我國用于煙草葉斑類病害的防控已有多年,其對白粉病的防控效果優(yōu)于赤星病。作為煙草葉斑類病害防控的常用藥劑,其在赤星病發(fā)生期應用時的葉際微生態(tài)機制卻缺乏認識,特別是其應用后,健康與感病煙葉葉際微生物的菌群結(jié)構(gòu)與代謝功能的調(diào)控規(guī)律仍不清楚。了解殺菌劑應用后葉際微生物的響應規(guī)律對指導藥劑的科學使用具有重要意義。

為此,本文采用高通量測序技術和Biolog代謝表型技術,分析腈菌唑施藥后健康煙葉與感赤星病煙葉葉際真菌和細菌的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及代謝功能,旨在了解腈菌唑施用不同時期內(nèi)煙葉葉際微生物的變化規(guī)律,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種云煙105,購自云南省煙草公司玉溪市公司;12.50%腈菌唑微乳劑(ME),購自北京東旺公司;GeneJET膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒,均購自Thermo Scientific公司。多功能噴霧器,購自貴州黔豐源農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司;自動氣象站,配有溫度計(MC-KWS)、雨量計(MC-YL)和濕度計(MC-KWS)等,購自北京新紅科技有限公司;Biolog ECO代謝板,購自美國Biolog公司(USA, CA, Hayward)。

1.2 田間施藥處理

1.2.1 試驗設計

試驗于2020年8月底在貴州省威寧縣黑石頭鎮(zhèn)進行,選取煙株長勢一致的煙田劃分小區(qū),各試驗小區(qū)隨機排列,每小區(qū)60株煙株,小區(qū)設3次重復,各小區(qū)之間設保護行。12.50%腈菌唑微乳劑(ME)的每667 m2用量為60 mL,每667 m2用水量為60 L,試驗時采用多功能噴霧器將藥液均勻噴霧至煙葉表面,直至液滴流失。使用自動氣象站檢測并記錄試驗過程中的降雨量、溫度和空氣相對濕度,并分別于施藥前0 d、施藥后5、10、15 d,各小區(qū)隨機選取10株煙株調(diào)查煙葉發(fā)病情況,計算各時期的病情指數(shù)[16]。

1.2.2 樣品采集

于施藥前0 d,施藥后5、10、15 d分別取樣,采用消毒剪刀分別剪取煙株中下部相同部位的感病與健康組織煙葉樣品,分別裝入50 mL無菌離心管中,每處理3次重復。樣品采集后放入低溫保存箱,并迅速帶回實驗室用于后續(xù)研究,樣品編號如表1所示。

表1 樣品采集信息

1.3 煙葉葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)與代謝功能差異分析

1.3.1 葉際真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性

采用CTAB[17]法提取煙葉葉際微生物的基因組DNA,使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度,檢測合格后用于構(gòu)建文庫。以上述樣品的總DNA為模板,以真菌引物ITS1-5F-F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS1-1F-R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對葉際微生物基因組DNA ITS1區(qū)域進行PCR擴增。以細菌引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對樣品葉際微生物基因組DNA 16S-V4區(qū)域進行PCR擴增。PCR反應程序和擴增體系參照文獻[18-19]的方法進行。擴增產(chǎn)物回收后,使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進行文庫的構(gòu)建,采用Illumina MiSeq測序平臺對PCR擴增產(chǎn)物進行雙端測序分析,以上分析均在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3.2 葉際微生物代謝功能

分別取施藥前后不同部位煙葉混合樣品各1 g,將其置于盛有50 mL 0.8%的無菌生理鹽水的100 mL三角瓶中,28 ℃下以180 r·min-1振蕩搖培2 h,取出后靜置30 min,取100 μL上清液依次分別加入到ECO代謝板的測試孔中[20]。將ECO代謝板置于OmniLog恒溫培養(yǎng)箱,28 ℃培養(yǎng)7 d,采用Biolog D5E_OKA_data.exe軟件收集煙葉葉際微生物在生長過程中代謝孔內(nèi)顏色變化值,收集后使用HemI軟件制作熱圖分析樣品葉際微生物的代謝功能[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。測序數(shù)據(jù)通過FLASH和Trimmomatie軟件進行過濾優(yōu)化和雙端序列連接[21]。優(yōu)質(zhì)序列

使用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)對相似度≥97%的序列進行OTU(operational taxonomic units)聚類,并在聚類過程去除單序列和嵌合體[22]。真菌和細菌分別通過UNIT數(shù)據(jù)庫[23]和SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行注釋[24]。采用QIIME V1.9.1軟件計算Alpha多樣性指數(shù)[25],運用SPSS軟件對真菌和細菌的Alpha多樣性指數(shù)進行差異顯著性分析。利用R軟件(Version 2.15.3)繪制真、細菌稀釋曲線圖、物種積累箱形圖、門屬水平相對豐度圖、借環(huán)境因子Spearman相關性圖,分析樣品微生物群落與多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 感赤星病與健康煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的差異

2.1.1 測序深度分析

本次測序共8組24個樣品,在真菌群落中,測序深度接近800、OTU數(shù)量接近300時曲線物種累積箱和趨于平緩(圖1-A、C)。在細菌群落中,測序深度和OTU數(shù)量均接近300時趨于平緩(圖1-B、D)。二者趨于平緩表明測序深度已經(jīng)基本覆蓋了樣品中絕大多數(shù)物種,抽樣充分,可以進行數(shù)據(jù)分析。

A,真菌OTU測序深度;B,細菌OTU測序深度;C,真菌水平物種累積箱形圖;D細菌水平物種累積箱形圖。A, OTU sequencing depth of fungi; B, OTU sequencing depth of bacteria; C, Horizontal species accumulation of fungi; D, Horizontal species accumulation of bacteria.圖1 煙葉樣品真菌、細菌的OTU測序深度和水平物種累積箱形圖Fig.1 Box diagram of OTU sequencing depth and horizontal species accumulation for fungi and bacteria in tobacco samples

2.1.2 葉際真菌和細菌Alpha多樣性差異

腈菌唑處理前后感病煙葉與健康煙葉葉際真菌和細菌群落的覆蓋度指數(shù)分別在0.97、0.81以上,表明測序數(shù)據(jù)合理,可以真實、合理地反映真菌和細菌的群落分布。在真菌群落結(jié)構(gòu)中,施藥前后感病煙葉葉際真菌群落的多樣性和豐富度指數(shù)均低于健康煙葉。感病煙葉的多樣性指數(shù)在施藥5 d時升高,10 d時降低,15 d時升高,豐富度指數(shù)則一直保持上升趨勢;健康煙葉的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均保持上升趨勢(表2)。

表2 煙葉葉際真菌和細菌Alpha多樣性差異(OTU水平)

在細菌群落結(jié)構(gòu)中,施藥前后感病煙葉葉際細菌群落的多樣性指數(shù)均高于健康煙葉,感病煙葉和健康煙葉的多樣性指數(shù)在施藥5 d時降低,10、15 d時升高。感病煙葉在施藥5 d時豐富度指數(shù)降低,而后保持上升趨勢;健康煙葉豐富度指數(shù)一直保持上升趨勢(表2)。

2.1.3 施藥不同時期的群落多樣性與相對豐度的差異

真菌群落在門水平上,子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)為施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢菌群。施藥前后感病煙葉的子囊菌門相對豐度均高于健康煙葉,而擔子菌門與之相反。施藥前感病煙葉和健康煙葉的子囊菌門相對豐度分別為93.67%、63.90%,施藥后相對豐度均降低。施藥前感病煙葉和健康煙葉的擔子菌門相對豐度分別為2.52%、6.77%,施藥后感病煙葉的擔子菌門相對豐度在施藥5、10 d時降低,15 d時增加;健康煙葉擔子菌門相對豐度在施藥5 d時降低,10 d、15 d時增加(圖2-A)。

A、C分別為真菌門水平和屬水平;B、D分別為細菌門水平和屬水平。A and C are at the fungal phylum and genus level, respectively; B and D are at the bacterial phylum and genus level, respectively.圖2 感病與健康煙葉真菌和細菌群落組成相對豐度圖Fig.2 Relative abundance of fungal and bacterial community composition of diseased and healthy tobacco leaves

細菌群落在門水平上,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)為施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的優(yōu)勢菌群,且施藥前后感病煙葉的變形菌門相對豐度均高于健康煙葉。施藥前感病煙葉和健康煙葉的變形菌門相對豐度分別為38.81%、6.04%,感病與健康煙葉施藥后5 d、10 d時相對豐度均降低,15 d時均增加。施藥前感病煙葉和健康煙葉的厚壁菌門相對豐度分別為0.56%、16.33%,施藥后感病煙葉相對豐度增加,而健康煙葉施藥后相對豐度降低(圖2-B)。

施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的主要真菌菌屬為鏈格孢屬(Alternaria)、谷菌根菌屬(Archaeorhizomyces)、Boeremia、枝孢霉屬(Cladosporium)、Symmetrospora、亞隔孢殼屬(Didymella)、附球菌屬(Epicoccum),其中鏈格孢屬為優(yōu)勢菌屬,施藥前感赤星病煙葉中鏈格孢屬相對豐度(84.40%)遠高于健康煙葉(36.48%)。施藥5 d時,感病煙葉與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為鏈格孢屬(分別降低了5.52%、11.40%)、枝孢霉屬(0.80%、9.72%)、Boeremia(0.35%、5.29%)、Symmetrospora(1.57%、0.73%);而亞隔孢殼屬(0.37%、0.1%)相對豐度增加。施藥10 d時,感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為枝孢霉屬(4.93%、2.37%),以及感病煙葉中的Boeremia(0.15%),健康煙葉中的附球菌屬(0.59%)、鏈格孢屬(6.13%);感病煙葉相對豐度增加的菌屬為鏈格孢屬(11.59%)、Symmetrospora(0.02%)、亞隔孢殼屬(0.02%);健康煙葉相對豐度增加的菌屬為谷菌根菌屬(4.15%)、Boeremia(0.09%)、Symmetrospora(5.89%)。施藥15 d時,感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為鏈格孢屬(23.08%、8.43%),健康煙葉相對豐度降低的菌屬為枝孢霉屬(0.24%)、Symmetrospora(0.79%)、亞隔孢殼屬(0.03%)、附球菌屬(0.87%);感病與健康煙葉中相對豐度增加的菌屬為Boeremia(0.74%、0.20%),感病煙葉相對豐度增加的菌屬為亞隔孢殼屬(1.21%)、附球菌屬(0.60%),健康煙葉相對豐度增加的菌屬為谷菌根菌屬(1.21%)(圖2-C)。

細菌群落在屬水平上,施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的主要菌屬為科薩克氏菌屬(Kosakonia)、乳球菌屬(Lactococcus)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、魏斯氏菌屬(Weissella)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、馬賽菌屬(Massilia),甲基桿菌屬(Methylobacterium)、其中科薩克氏菌屬為優(yōu)勢菌屬,施藥前感赤星病煙葉中科薩克氏菌屬相對豐度(23.38%)遠高于健康煙葉(3.47%)。施藥5 d時,感病煙葉中相對豐度降低的菌屬為魏斯氏菌屬(0.1%)、假單胞菌屬(4.92%)、馬賽菌屬(2.01%),健康煙葉相對豐度降低的菌屬為科薩克氏菌屬(2.46%)、泛菌屬(1.90%);感病煙葉相對豐度增加的菌屬為科薩克氏菌屬(4.14%)、乳球菌屬(18.12%)、泛菌屬(6.04%)、甲基桿菌屬(0.22%),健康煙葉相對豐度增加的有假單胞菌屬(1.23%)、乳球菌屬(0.78%)。施藥10 d時,感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為科薩克氏菌屬(25.84%、0.78%)、乳球菌屬(17.45%、0.78%)、泛菌屬(4.70%、0.22%),以及感病煙葉的甲基桿菌屬(0.11%);感病煙葉相對豐度增加的菌屬為鞘脂單胞菌屬(0.89%)、假單胞菌屬(8.05%)、馬賽菌屬(1.23%),健康煙葉相對豐度增加的菌屬為鞘脂單胞菌屬(0.22%)、甲基桿菌屬(0.56%)。施藥15 d時,感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為鞘脂單胞菌屬(0.34%、0.11%)以及感病煙葉的乳球菌屬(0.67%)、假單胞菌屬(6.38%)、馬賽菌屬(1.01%),健康煙葉的鞘脂單胞菌屬(0.11%)、甲基桿菌屬(0.34%);感病煙葉相對豐度增加的菌屬為科薩克氏菌屬(12.42%)、泛菌屬(17.00%),健康煙葉相對豐度增加的菌屬為科薩克氏菌屬(3.92%)、泛菌屬(9.62%)、假單胞菌屬(2.46%)、馬賽菌屬(0.11%)(圖2-D)。

2.1.4 環(huán)境因子對煙草葉際真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

在試驗開展期間該地區(qū)長時間有小雨。自動氣象站測量結(jié)果顯示,在施藥前0 d、施藥后5 d、10 d、15 d時的降雨量分別為13.60、19.00、11.30和25.40 mm;溫度分別為18.32、18.97、17.51和16.54 ℃;空氣相對濕度分別為82.49%、83.81%、78.99%和90.98%;病情指數(shù)分別為44.44、48.14、63.58、70.55(表3)。

表3 環(huán)境因子與病情指數(shù)

本文對葉際真菌和細菌top50的菌屬進行Spearman相關分析,結(jié)果顯示,在真菌屬水平上,取樣時間與粉褶蕈屬(Entoloma)、青霉菌屬(Penicillium)、擬孔菌屬(Fomitiporia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、木霉屬(Trichoderma)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、亞隔孢殼屬(Didymella)、枝孢霉屬(Cladosporium)的相對豐度呈顯著正相關;與浪梗霉屬(Polythrincium)的相對豐度呈極顯著正相關;與谷菌根菌屬(Archaeorhizomyces)的相對豐度呈顯著負相關。溫度與粉褶蕈屬(Entoloma)、青霉菌屬(Penicillium)、擬孔菌屬(Fomitiporia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、木霉屬(Trichoderma)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、枝孢霉屬(Cladosporium)的相對豐度呈顯著負相關,與浪梗霉屬(Polythrincium)的相對豐度呈極顯著負相關。相對濕度和降雨量與擬孔菌屬(Fomitiporia)的相對豐度呈顯著正相關。病情指數(shù)與Plectosphaerella、畢赤酵母菌屬(Pichia)、黑團孢屬(Periconia)的相對豐度呈顯著負相關;與尾孢菌屬(Cercospora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉菌屬(Aspergillus)、Boeremia的相對豐度呈極顯著負相關,與鏈格孢屬(Alternaria)呈極顯著正相關(圖3-A)。

*, P<0.05; **, P<0.01.圖3 腈菌唑處理后葉際真菌(A)和細菌(B)群落的Spearman相關分析熱圖Fig.3 Heat map of Spearman correlation analysis based on phyllosphere fungal (A) and bacterial (B) communities after myclobutanil treatment

在細菌屬水平上,取樣時間與紅球菌屬(Rhodococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)的相對豐度呈顯著負相關;與Quadrishaera、Aureimonas、西地西菌屬(Cedecea)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、沙雷菌屬(Serratia)的相對豐度呈顯著正相關。溫度與Quadrishaera、Aureimonas、西地西菌屬(Cedecea)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、沙雷菌屬(Serratia)的相對豐度呈顯著負相關。相對濕度和降雨量與Quadrishaera、金色單胞菌屬(Aureimonas)、西地西菌屬(Cedecea)、沙雷菌屬(Serratia)、泛菌屬(Pantoea)的相對豐度均呈顯著正相關。病情指數(shù)與鏈球菌屬(Streptococcus)、未經(jīng)鑒定的腸桿菌科(undentified-Enterobactericeae)的相對豐度呈顯著正相關關系(圖3-B)。

2.2 腈菌唑?qū)Ω谐嘈遣∨c健康煙葉葉際微生物代謝功能的差異

本文采用Biolog-ECO微孔板對施藥前后煙葉樣品進行代謝功能分析,Biolog ECO微孔板中含有羧酸類、氨基酸、糖類、雙親化合物、聚合物和胺/氨基化合物共31種碳源。施藥前,感病煙葉葉際微生物對α-丁酮酸、L-蘇氨酸的代謝較弱;對葡萄糖-1-磷酸鹽、4-羥基苯甲酸、α-環(huán)式糊精、D,L-α-甘油的代謝程度一般,對其他碳源代謝均可高效代謝,尤其是對α-D-乳糖、D-甘露醇、D-半乳糖酸內(nèi)酯、γ-羥基丁酸、L-天冬酰胺酸、吐溫40、吐溫80。健康煙葉葉際微生物對α-丁酮酸的代謝較弱,對2-羥基苯甲酸代謝程度一般,對其他碳源代謝均可高效代謝。施藥5 d時,感病煙葉葉際微生物對α-丁酮酸代謝程度增加,對D-葡糖胺酸、α-環(huán)式糊精代謝程度保持不變,其余碳源代謝程度均降低;健康煙葉葉際微生物對所有碳源代謝程度均降低。施藥10 d時,相較于施藥前和施藥5 d時,感病煙葉葉際微生物對α-丁酮酸代謝程度增加,對其余碳源代謝均降低;健康煙葉相較于施藥前,α-丁酮酸代謝程度增加,其余碳源代謝程度均降低,相較于施藥5 d時,α-D-乳糖、D-半乳糖醛酸、苯乙基胺等11種碳源代謝程度保持不變,D-纖維二糖、D-木糖、丙酮酸甲酯等14種碳源代謝程度增加,對其余碳源代謝程度均降低。施藥15 d時,相較于施藥前,感病煙葉葉際微生物對α-丁酮酸代謝程度增加,其余碳源代謝程度均降低,相較于施藥10 d時,D-纖維二糖、α-D-乳糖、D-葡糖胺酸等8種碳源代謝程度均增加,2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、α-丁酮酸代謝程度均降低,其余碳源代謝程度均增加;健康煙葉相較于施藥前,所有碳源代謝程度均降低,相較于施藥10 d時,苯乙基胺、L-精氨酸、L-苯基丙氨酸等6種碳源代謝程度增加,D-木糖、L-絲氨酸、D-半乳糖醛酸等10種碳源代謝程度不變,其余碳源代謝程度均降低(圖4)。

顏色值分別代表微生物代謝碳源的程度,122～<192為代謝程度低,192～262為代謝程度一般,262以上為代謝程度高。The color values represent the degree of the microbes metabolizing carbon sources. The value 122-<192, 192-262 and >262 represent the leaf microbes metabolized in Biolog ECO microplate poorly, moderately, effectively, respectively.圖4 煙葉葉際微生物代謝功能聚類熱圖Fig.4 Cluster heat map of phyllosphere microbial metabolic function in tobacco leaves

3 討論

葉際微生物在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和葉片健康方面均具有不可忽視的作用[26-27]。已有研究發(fā)現(xiàn)煙草赤星病危害期其葉際優(yōu)勢真菌為鏈格孢屬,優(yōu)勢細菌有泛菌屬和假單胞菌屬[11]。本文采用Illumina高通量測序技術,對應用腈菌唑前后感赤星病煙葉和健康煙葉葉際真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性進行分析,發(fā)現(xiàn)施藥前后感病和健康煙葉葉際優(yōu)勢真菌菌群均為子囊菌門,其次為擔子菌門;優(yōu)勢細菌菌群為變形菌門,其次為厚壁菌門。感赤星病煙葉和健康煙葉施藥前后的真菌有鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬、Boeremia、Symmetrospora等菌屬,優(yōu)勢菌屬為鏈格孢屬。施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的主要細菌有泛菌屬、假單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬等,其中優(yōu)勢菌屬為泛菌屬。這與前人對于感赤星病煙葉采烤后優(yōu)勢真菌菌群和感赤星病煙葉成熟期優(yōu)勢真菌與細菌菌群的研究結(jié)果一致[12,28]。進一步證實鏈格孢屬為赤星病煙葉葉際優(yōu)勢真菌,泛菌屬、假單胞菌屬為葉際優(yōu)勢細菌。本文研究發(fā)現(xiàn),感病煙葉的真菌鏈格孢屬相對豐度遠高于健康煙葉,說明煙草感赤星病時,鏈格孢屬占據(jù)主導地位;其余真菌(枝孢霉屬、Symmetrospora、亞隔孢殼屬等)和細菌(泛菌屬、假單胞菌屬等),在煙草亞隔孢葉斑病和煙葉霉爛病危害期均出現(xiàn)[29-30],為此,推測這些菌屬為煙葉上的習居菌。

藥劑的使用會改變?nèi)~際微生物群落結(jié)構(gòu)[31]。研究發(fā)現(xiàn),施用菌核凈會使煙葉葉際細菌中鞘脂單胞菌屬、黃色桿菌屬和沙雷氏菌屬的相對豐度降低[14];高效氯氰菊酯在推薦使用劑量范圍內(nèi)使用會引起植物葉際真菌生物量的降低和細菌生物量的增加[32];白僵菌的施用也會使水稻葉際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變[33]。本文發(fā)現(xiàn),施藥后感病煙葉和健康煙葉葉際病原真菌鏈格孢屬的相對豐度均降低,說明腈菌唑能有效防治煙草赤星病的發(fā)生。本文通過Spearman相關分析發(fā)現(xiàn),病情指數(shù)與鏈格孢屬呈極顯著正相關,表明病情指數(shù)越大,鏈格孢屬的相對豐度越高,而病情指數(shù)與尾孢菌屬、鐮孢菌屬、曲霉屬、Symmetrospora的相對豐度呈極顯著負相關,推測這些菌屬與鏈格孢屬之間存在潛在的競爭作用,但其具體機理及這些真菌是否參與侵染有待進一步研究。除靶標病原菌外,腈菌唑會影響煙葉包括附球菌屬、枝孢霉屬、Symmetrospora、亞隔孢殼屬等在內(nèi)的多種病原真菌,同時也會影響包括假單胞屬、泛菌屬在內(nèi)的多種非致病細菌菌群結(jié)構(gòu)的變化,這與前人研究結(jié)果類似[12]。此外,腈菌唑作為三唑類殺菌劑的典型代表,已在多種作物上登記,本文研究結(jié)果也進一步驗證了腈菌唑的廣譜性。

高多樣性和豐度水平的葉際微生物群落可能有助于提高葉際環(huán)境的功能冗余,維持宿主植物的健康水平[34]。本文利用Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)用作表征微生物群落多樣性和衡量微生物群落豐富度,研究發(fā)現(xiàn),感赤星病煙葉的葉際真菌群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均低于健康煙葉,且存在顯著性差異,結(jié)果與煙草靶斑病[35]等真菌性病害的相關葉際微生物多樣性與豐富度研究結(jié)果一致,推測真菌性病害的發(fā)生均會降低葉際菌群的豐富度與多樣性,也進一步證明菌群高豐富度和多樣性更有利于維持宿主植物的健康水平。腈菌唑應用后感病煙葉真菌的多樣性先升高,后降低,而后升高;豐富度一直保持上升趨勢,而細菌多樣性和豐富度均先降低,而后升高。健康煙葉真菌多樣性和豐富度一直保持上升趨勢,而細菌多樣性先降低,而后升高,豐富度則一直保持上升趨勢。說明藥劑處理顯著改變了葉際微生物群落多樣性與豐富度,本文研究結(jié)果與前人研究發(fā)現(xiàn)施用拮抗菌群、殺菌劑會改變感野火病、赤星病煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果類似[15,36]。

葉際微生物群落對碳源代謝活性的強弱能反映代謝功能的強弱。本文利用Biolog-ECO技術研究分析了施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉對常見31種碳源的碳源利用差異,體現(xiàn)煙葉葉際微生物整體活性和微生物群落生態(tài)功能,發(fā)現(xiàn)施藥前感病煙葉對α-丁酮酸、L-蘇氨酸利用較弱外,還有少數(shù)幾個碳源利用程度較低。而健康煙葉除了對α-丁酮酸的代謝較弱,對2-羥基苯甲酸代謝程度一般,對其他碳源代謝均可高效代謝。說明感病煙葉葉際微生物對于碳源的代謝能力低于健康煙葉,健康煙葉的生物活性高于感病煙葉。腈菌唑處理后,相較于施藥前,感病煙葉與健康煙葉的碳源利用降低,隨著時間的增加,對碳源的利用又逐漸升高,健康煙葉恢復對碳源利用能力比感病煙葉強。表明腈菌唑能快速降低感赤星病煙葉與健康煙葉葉際微生物的代謝活性,很大程度上改善了煙葉葉際微環(huán)境,但對于健康煙葉的活性影響比感病煙葉小,隨著施藥時間的增加,代謝活性緩慢增加,表明腈菌唑在煙葉上的持效期有限,其用于赤星病防控時可適當增加藥劑施用次數(shù)。

4 結(jié)論

赤星病發(fā)生期,感病煙葉和健康煙葉葉際優(yōu)勢菌屬均為鏈格孢屬、科薩克氏菌屬,但赤星病煙葉中鏈格孢屬、泛菌屬相對豐度高于健康煙葉,而真菌和細菌的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均低于健康煙葉。腈菌唑施用后降低了赤星病煙葉和健康煙葉葉際主要優(yōu)勢菌屬鏈格孢屬的相對豐度、增加了科薩克氏菌屬相對豐度;感赤星病煙葉葉際真菌多樣性和豐富度指數(shù)先降低,而后增加,健康煙葉中多樣性和豐富度指數(shù)均增加。施藥前赤星病煙葉對碳源的代謝能力低于健康煙葉,健康煙葉能高效代謝幾乎所有碳源。施藥后二者碳源代謝程度均降低,隨著時間的延長,碳源代謝程度逐漸恢復。