腹瀉奶牛源大腸桿菌的分離鑒定及中藥的體外抑菌效果

吳道義，馬金萍*，王明進(jìn)，王霞，曾繼晶，周禮揚(yáng)，羅耀，李坤

(1. 畢節(jié)市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，貴州 畢節(jié) 551799；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

機(jī)會(huì)性致病菌大腸桿菌(Escherichiacoli)是畜牧生產(chǎn)上一種十分重要的人畜共患病原微生物，可通過(guò)自然界中的土壤和水體等多種媒介進(jìn)行傳播，對(duì)人類食品安全和公共衛(wèi)生產(chǎn)生較大威脅[1]。目前抗生素和抗菌藥物被廣泛用于治療大腸桿菌感染，以降低畜禽的發(fā)病率和死亡率，但抗菌藥物的大量使用產(chǎn)生諸多危害，一方面可通過(guò)動(dòng)物的糞便和尿液進(jìn)入土壤和水環(huán)境，影響微生態(tài)平衡，產(chǎn)生耐藥微生物，通過(guò)食物鏈引發(fā)公共衛(wèi)生問(wèn)題[2-3]；另一方面，可導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性問(wèn)題加劇，交叉耐藥和多重耐藥也愈發(fā)嚴(yán)重，臨床治療難度加大，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。因此，通過(guò)病原菌的分離鑒定和耐藥性研究，掌握牛場(chǎng)的主要致病菌及其耐性情況，可以指導(dǎo)臨床科學(xué)，準(zhǔn)確地用藥，對(duì)于奶牛腹瀉病的預(yù)防和控制有著極其重要的臨床意義[5]。隨著耐藥性問(wèn)題的日益嚴(yán)峻，開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物和產(chǎn)品已迫在眉睫。中藥在防治人和家畜疾病中發(fā)揮著重要作用，其安全、耐藥性低，已成為替抗產(chǎn)品研究的熱點(diǎn)[6]。

本研究通過(guò)對(duì)貴州畢節(jié)某奶牛場(chǎng)腹瀉奶牛的新鮮糞便進(jìn)行病原菌分離純化、生化鑒定、序列比對(duì)確定病原種類，并進(jìn)行致奶牛腹瀉病原菌對(duì)常見(jiàn)抗生素敏感性的測(cè)定和相關(guān)耐藥基因的PCR擴(kuò)增分析，旨在為畜牧養(yǎng)殖中大腸桿菌性腹瀉病的防控及耐藥菌的研究奠定基礎(chǔ)和提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

50份腹瀉奶牛糞便采自貴州省某荷斯坦奶牛場(chǎng)，用無(wú)菌棉簽撥開(kāi)糞便，再用新的無(wú)菌棉簽從糞便內(nèi)部采集少許，收集于50 mL無(wú)菌離心管中，迅速置于液氮中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)試劑

大腸桿菌分離鑒定培養(yǎng)基，包括麥康凱、LB(肉湯/瓊脂)和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管和藥敏紙片購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司；革蘭染色試劑盒和細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；試驗(yàn)所用擴(kuò)增引物均由生工生物(上海)股份有限公司合成。虎耳草和杜鵑花購(gòu)自同仁堂。

1.3 細(xì)菌的分離與鑒定

稱取約1 g糞便樣品于10 mL無(wú)菌離心管中，再加入約5倍體積的LB肉湯，充分振蕩混勻，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)2 h。接種環(huán)蘸取微量菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)18～20 h。挑取優(yōu)勢(shì)菌落采用三區(qū)劃線法依次接種于麥康凱和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～20 h，連續(xù)傳代純化，挑取菌體典型的單菌落進(jìn)行革蘭染色和顯微鏡檢查細(xì)菌形態(tài)。

1.4 生化鑒定

將純化培養(yǎng)的菌落接種于大腸桿菌微量生化反應(yīng)管中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.5 16S rRNA基因序列測(cè)定

挑取純化的典型單菌落在LB肉湯中搖菌過(guò)夜，取2 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液在4 ℃、12 000 r/min的條件下，離心5 min，然后棄掉上清液以獲得沉淀的菌體，通過(guò)DNA(細(xì)菌)提取試劑盒提取菌體DNA，作為PCR反應(yīng)的模板底物。擴(kuò)增引物為16S rDNA通用引物(27F/1492R，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，目的基因片段長(zhǎng)度為1 465 bp。25 μL的PCR反應(yīng)體系包括12.5 μL的2×TaqPCR Master Mix，1 μL的DNA模板，上/下游引物(10 μmol/L)各2 μL，9.5 μL的ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性25 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后吸取10 μL的PCR產(chǎn)物取用于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司南京分公司進(jìn)行基因序列測(cè)序。將菌體的測(cè)序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收藏的細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。本試驗(yàn)選擇的參考基因序列為：大腸桿菌(KP789331.1、KP789332.1、OP355282.1、OP355452.1、P051137.1、LC428294.1、KT260801.1、CP104371.1、KX349997.1、MN208163.1、KJ477001.1、OL823013.1、MK561310.1),金黃色葡萄球菌(L37597.1)和變異鏈球菌(OQ608657.1)。

1.6 藥敏試驗(yàn)

針對(duì)致奶牛腹瀉的大腸桿菌，本試驗(yàn)共檢測(cè)了其對(duì)16種常見(jiàn)抗生素的耐藥情況。判斷依據(jù)為CLSI公布的大腸桿菌對(duì)抗生素藥敏紙片敏感范圍的最新標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感程度，將試驗(yàn)結(jié)果分為3種，即耐藥(R)、中介(I)和敏感(S)。

1.7 耐藥基因PCR檢測(cè)

參考之前報(bào)道的相關(guān)耐藥基因的引物[7-12]，進(jìn)行腹瀉奶牛源大腸桿菌的相關(guān)耐藥基因PCR檢測(cè)。反應(yīng)使用的PCR反應(yīng)體系和程序與1.5相同，不同基因PCR反應(yīng)中的退火溫度和預(yù)期產(chǎn)品大小詳見(jiàn)表1。然后通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增條帶分析。

表1 耐藥基因序列

1.8 大腸桿菌對(duì)小鼠的致病性研究

24只4周齡ICR小鼠(購(gòu)自青龍山動(dòng)物繁殖中心)，雌雄各半，平均體重(18.0±1.5)g。小鼠適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組，生理鹽水；攻毒組I，低劑量(3×107CFU/mL)；攻毒組Ⅱ，中劑量(3×108CFU/mL)；攻毒組Ⅲ，高劑量(3×109CFU/mL)。對(duì)照組小鼠分別進(jìn)行腹腔注射0.2 mL生理鹽水，攻毒組小鼠進(jìn)行腹腔注射組0.2 mL的菌液，觀察小鼠的精神、腹瀉、飲食和死亡情況。

1.9 中草藥的體外抑菌研究

虎耳草和杜鵑花經(jīng)過(guò)水煮、旋蒸濃縮，制備凍干粉。在3 mL的LB液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的虎耳草(1.5、3 和6 mg/mL)和杜鵑花(3.125、6.25和12.5 mg/mL)水提物，然后挑單菌落，在培養(yǎng)基中混勻。設(shè)置時(shí)間梯度(0、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、7和9 h)，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定

從50份荷斯坦奶牛腹瀉糞便中分離到31份(62.0%)疑似大腸桿菌的菌株，這些菌株在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落特征為表面光滑和邊緣整齊的粉紅色圓形或扁平的菌落；而在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的菌落特征為金屬光澤的紫黑色菌落。在顯微鏡下，致奶牛腹瀉病原菌的染色鏡檢結(jié)果為革蘭陰性、短桿狀且兩端鈍圓的散在或成對(duì)出現(xiàn)的細(xì)菌(圖1)。

圖1 革蘭染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.2 生化鑒定

致畢節(jié)某牛場(chǎng)奶牛腹瀉病原菌的生化試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2，其中除蔗糖為陰性外，其他的糖和醇類反應(yīng)均為陽(yáng)性，靛基質(zhì)和MR試驗(yàn)為陽(yáng)性，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)和VP試驗(yàn)為陰性。

表2 大腸桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S rRNA 基因序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

致奶牛腹瀉病原菌的16S rRNA基因擴(kuò)增條帶均在1 500 bp左右，見(jiàn)圖2，條帶大小符合目的條帶長(zhǎng)度。PCR測(cè)序結(jié)果呈現(xiàn)單一峰值，表明測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，分離菌株擴(kuò)增序列與GenBank中大腸桿菌參考株基因序列的同源性達(dá)到99.65%～99.86%，通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)參考序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)分離菌株與KJ47700.1和MN561310.1參考株被劃為一支，說(shuō)明其與該2菌株的同源性較高(圖3)。

M. DNA Marker DL2000；1～7. 部分菌株。

圖3 分離菌的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)

致奶牛腹瀉病原菌對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥性分析結(jié)果詳見(jiàn)表3，這些分離株對(duì)四環(huán)素、青霉素G、強(qiáng)力霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑和恩諾沙星呈現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，且存在多重耐藥性，耐藥率為38.71%～100%(圖4)，而對(duì)其他9種抗生素相對(duì)敏感。

圖4 多重耐藥性結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.5 耐藥基因的檢測(cè)

耐藥基因PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，分離株中存在的耐藥基因有β-內(nèi)酰胺類的blaCTX-M和blaTEM，四環(huán)素類耐藥基因TetK、TetB、TetC、TetD、TetA，氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-Ia、rmtB，喹諾酮類耐藥基因qnrS、qepA、oqxA，其余耐藥基因檢測(cè)結(jié)果均為陰性(圖5)。主要耐藥基因的攜帶率為6.45%～100.00%(圖6)。

M. DNA Marker DL2000；1. blaSHV；2. blaCTX-M；3. blaTEM；4. TetA；5. TetB；6. TetC；7. TetD；8. TetM；9. TetK；10.ermA；11. ermB；12. ermC；13. ant(3″)-Ia；14. aac(6′)-Ib；15. rmtB；16. qnrS；17. qepA；18. oqxA。

圖6 耐藥基因攜帶率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.6 大腸桿菌對(duì)小鼠的致病性

腹腔注射6 h后，中劑量和高劑量攻毒的ICR小鼠陸續(xù)出現(xiàn)表現(xiàn)不同程度的精神沉郁、昏睡、腹瀉等臨床癥狀。8 h低劑量組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、昏睡的癥狀，但腹瀉不明顯，高劑量小鼠全部死亡(100%)。12 h中劑量組小鼠死亡2只(33.33%)。18 h 低劑量組小鼠死亡1只(16.67%)，中劑量組小鼠全部死亡(100%)。剖檢發(fā)現(xiàn)，腹腔注射大腸桿菌后，攻毒組小鼠肝臟和脾臟明顯出血，腸道形態(tài)改變，腸壁變薄和鼓氣，有明顯的出血，且腸道內(nèi)有大量黃色內(nèi)容物。

2.7 中草藥的抑菌效果

體外抑菌研究發(fā)現(xiàn)，虎耳草水提物對(duì)腹瀉奶牛源的多重耐藥大腸桿菌沒(méi)有明顯抑菌作用，而不同濃度的杜鵑花水提物均可以顯著的抑制該耐藥性大腸桿菌的增殖，特別是中、高濃度的杜鵑花水提物作用下，大腸桿菌基本未增殖(圖7)。

A. 添加虎耳草水；B. 添加杜鵑花水。

3 討論

致病性大腸桿菌是全球牛場(chǎng)中腹瀉犢牛、乳房炎和子宮內(nèi)膜炎患病奶牛常被檢出的主要病原微生物，該菌不僅危害動(dòng)物的健康，更給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了十分嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是奶牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展和壯大必須面臨和解決的難題[13]。2022年，貴州某奶牛場(chǎng)出現(xiàn)大量牛腹瀉病例，通過(guò)對(duì)新鮮病料的病原菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)，62.0%腹瀉糞便中存在病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化鑒定和PCR擴(kuò)增及測(cè)序比對(duì)，確定這些病原菌為大腸桿菌，即腹瀉病例中大腸桿菌的感染率高達(dá)62.0%。對(duì)小鼠致病性研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的大腸桿菌對(duì)小鼠的致死性較強(qiáng)，且小鼠出現(xiàn)了明顯的腹瀉癥狀。對(duì)這些病原菌的耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)菌對(duì)4種常見(jiàn)的抗生素(強(qiáng)力霉素、青霉素G、四環(huán)素和紅霉素)耐藥性嚴(yán)重，且均為嚴(yán)重的多重耐藥，而對(duì)其他常見(jiàn)的抗生素相對(duì)敏感。這與從甘肅某規(guī)?；?chǎng)腹瀉犢牛糞便[14]和新疆疑似大腸桿菌導(dǎo)致死亡的牛病料[15]分離的大腸桿菌耐藥性結(jié)果相近，但本研究分離的菌株多重耐藥性相對(duì)較低。為進(jìn)一步研究其耐藥原因，本試驗(yàn)進(jìn)行了致腹瀉大腸桿菌分離菌株的耐藥基因擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些腹瀉病原菌中存在的耐藥基因有2種β-內(nèi)酰胺類基因(blaCTX-M和blaTEM)，5種四環(huán)素類基因(TetK、TetD、TetB、TetA和TetC)，2種氨基糖苷類耐藥基因(ant(3″)-Ia、rmtB)，3種喹諾酮類耐藥基因(qnrS、qepA、oqxA)，這些耐藥基因與之前研究報(bào)道的結(jié)果相近[7，14-15]。分析發(fā)現(xiàn)這些致腹瀉的菌株耐藥表型與其對(duì)應(yīng)的耐藥基因型存在不一致的現(xiàn)象，推測(cè)可能存在耐藥基因的變異或耐藥基因相互協(xié)同作用或與其他基因協(xié)作，從而表現(xiàn)出耐藥表型。

細(xì)菌耐藥性及超級(jí)細(xì)菌問(wèn)題，已受到越來(lái)越多研究者的重視。特別近些年來(lái)，在生產(chǎn)實(shí)踐中多重耐藥性大腸桿菌的報(bào)道及其相關(guān)耐藥基因的揭示已普遍存在，研究發(fā)現(xiàn)這些耐藥基因會(huì)在細(xì)菌間垂直傳播[16]。大腸桿菌是食品衛(wèi)生和環(huán)境污染檢測(cè)的重要指示菌，糞便中的大腸桿菌是污染的主要來(lái)源，經(jīng)糞-口傳播循環(huán)使病原菌永久存在和放大化，給牛大腸桿菌病的防治帶來(lái)困難?？股氐倪^(guò)度濫用，特別臨床常用的抗生素，諸如喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、四環(huán)素類、氨基糖苷類和磺胺類[17]，使得大腸桿菌已經(jīng)產(chǎn)生較嚴(yán)重的耐藥性。同時(shí)由于濫用抗生素迫使菌體不斷更新耐藥基因，耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，這也是抗生素對(duì)其效果越來(lái)越差，臨床表現(xiàn)為治愈率低下的重要原因[18]。杜鵑花不僅有行氣活血、補(bǔ)虛的作用，最新的研究發(fā)現(xiàn)該中藥還能消炎殺菌、驅(qū)蟲(chóng)和止咳等[19]，但關(guān)于其抗菌的研究相對(duì)較少。劉艷霞[20]發(fā)現(xiàn)藏藥杜鵑花對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有一定的抑菌作用。本研究證實(shí)了杜鵑花對(duì)多重耐藥性大腸桿菌有顯著的抑菌功效，可以進(jìn)一步進(jìn)行替抗藥物或飼料添加劑的開(kāi)發(fā)。

因此，針對(duì)該奶牛場(chǎng)出現(xiàn)的多重耐藥性大腸桿菌導(dǎo)致腹瀉的問(wèn)題，治療中應(yīng)選用尚未出現(xiàn)耐藥性的抗生素，也可以一種或多種抗生素聯(lián)合，從而提高抗菌效果。優(yōu)先考慮頭孢曲松、磷霉素、卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星等抗生素，同時(shí)確定用藥的最佳劑量，減少耐藥性的發(fā)生；也可以考慮使用杜鵑花等具有抑菌作用的藥物作為飼料添加劑作來(lái)預(yù)防大腸桿菌腹瀉病，或通過(guò)灌胃中藥水提物進(jìn)行治療，但需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。此外，要注重環(huán)境衛(wèi)生消毒工作，加強(qiáng)奶牛飼養(yǎng)管理，減少致病菌和病毒的滋生，提高奶牛抵抗力。