6株H9N2亞型禽流感病毒分子特征及遺傳演化分析

邢燕茹，祝宇翔，范春燕，于海，汪秀會*

(1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)，屬于正黏病毒科甲型流感病毒屬，是一種人畜共患病原體，禽類是其天然的宿主。流感病毒基因組由8段單鏈RNA組成，具有很高的原位重組潛力[1]。其中，H9N2亞型AIV屬于低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus，LPAIV)，也是目前世界上傳播最廣泛和最具破壞性的AIV[2]。H9N2亞型AIV與其他亞型AIV在家禽和野生鳥類間廣泛傳播，加上疫苗廣泛接種的壓力，促使流感病毒不斷進化，為新型變異毒株和重組毒株的產(chǎn)生創(chuàng)造了有利條件[3-4]。H9N2亞型AIV可由家禽直接或間接傳播給哺乳動物，包括人類[5-6]，對公共衛(wèi)生安全具有一定的威脅[7]。許多學(xué)者認為H9N2亞型AIV是造成人類流感大流行的潛在風(fēng)險因素[8]。目前H9N2亞型AIV是我國雞群中流行最為廣泛的病毒亞型[2]，一旦獲得跨種傳播的能力，很有可能對人類的生命安全造成威脅和挑戰(zhàn)[9]。因此，要加強H9N2亞型AIV的監(jiān)測和防控，對潛在的流行病學(xué)提供早期預(yù)警，以降低人類流感大流行的風(fēng)險[4，10]。

為了解H9N2亞型AIV的分子變化特征及其跨物種傳播的可能性，本研究對實驗室保存的6株H9N2亞型AIV的8個基因片段進行序列測定和遺傳進化分析，并且進一步對6株分離株與6株H9N2亞型AIV代表毒株的血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)同源性和關(guān)鍵氨基酸位點進行了對比分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在河南、山東、四川等地區(qū)采集肺組織病料中分離到6株AIV，分別為A/chicken/Henan/HN1/2011(H9N2),A/chicken/Henan/HN2/2011(H9N2),A/chicken/Shandong/SD-B40/2014(H9N2),A/chicken/Sichuan/SC-B44/2014(H9N2),A/chicken/Shandong/SD-3297/2016(H9N2),A/chicken/Shandong/SD-3220/2016(H9N2),由本實驗室保存。

9～11日齡的SPF雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；病毒RNA提取試劑盒，購自Qiagen公司；LATaq預(yù)混酶、反轉(zhuǎn)錄酶和pMD-18T載體，購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒，購自O(shè)mega公司；DL2000 DNA Marker，購自全式金公司。

M. DL2000 DNA Marker；1. SD-B40毒株；2. SC-B44毒株；3. HN1毒株；4. HN2毒株；5. SD-3297毒株；6. SD-3220毒株。

M. DL2000 DNA Marker；1. SD-B40毒株；2. SC-B44毒株；3. HN1毒株；4. HN2毒株；5. SD-3297毒株；6. SD-3220毒株。

1.2 病毒擴增

6株病毒分別接種至5枚9～11日齡SPF雞胚的尿囊腔中大量增殖，除去24 h內(nèi)死亡的雞胚，在37 ℃孵化箱中孵育72 h后將雞胚放入4 ℃冰箱過夜，用針管吸出雞胚尿囊液。對雞胚中吸出的尿囊液進行血凝檢測，將血凝陽性的尿囊液保存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)病毒基因組的提取，進一步分析毒株的基因序列。

1.3 病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

分別提取6株病毒的總RNA，將提取好的病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，放入冰箱保存，溫度為-20 ℃。

1.4 8個基因片段PCR擴增及序列測定

分別以6株病毒的cDNA為模板，使用流感病毒通用引物分別對6株病毒的8個基因片段進行PCR擴增。PCR擴增反應(yīng)體系為：LATaq預(yù)混酶25 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR擴增反應(yīng)程序為：預(yù)變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min 30 s，35個循環(huán)；終延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切下與目的基因片段大小一致的片段，膠回收純化。將含有8個基因片段的PCR產(chǎn)物分別連接到pMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，送至上海擎科生物科技有限公司進行測序。

1.5 HA及NA同源性分析

利用DNAStar中的SeqMan軟件對測序得到的各基因片段序列進行拼接，再利用EditSeq軟件對結(jié)果進行整理，獲得6株病毒完整的HA和NA基因序列，并翻譯為氨基酸序列。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載各譜系代表毒株的核苷酸和氨基酸序列，6株代表毒株分別為A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)，A/Duck/Hong Kong/Y439/97(H9N2)，A/quail/Hong Kong/G1/1997(H9N2)，A/Chicken/Hong Kong/G9/97(H9N2)，A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)，A/Chicken/ShangHAi/F/98(H9N2)。利用MegAlign 7.1軟件分析6株分離株與6株代表毒株HA和NA序列的同源性。

1.6 8個基因片段遺傳進化分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

從NCBI上下載19株代表毒株的8個基因片段序列，同時將6株病毒的8個基因片段序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫上的BLAST模塊進行比對，將同源性最高的序列作為參考序列，將分離到的6株病毒與19株代表毒株的8個基因片段序列利用MEGA 7.0軟件分別進行遺傳進化分析，并完成系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.7 HA和NA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載H9N2亞型AIV的6株代表毒株(同1.5)HA和NA蛋白的氨基酸序列，將分離到的6株病毒與6株代表毒株的HA和NA蛋白氨基酸序列一起導(dǎo)入MegAlign 7.1軟件，比較分析關(guān)鍵氨基酸位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒擴增

將實驗室保存的6株病毒接種于SPF雞胚，收取尿囊液后通過血凝檢測鑒定病毒的分離情況，收取的6株病毒雞胚尿囊液均可使1%雞紅細胞凝集，說明6株病毒均獲得擴增。后續(xù)對這6株病毒進行病毒RNA提取、RT-PCR擴增及序列測定。

將6株病毒分別接種至SPF雞胚的尿囊腔中大量增殖，用針管吸出雞胚尿囊液，進行血凝試驗。6株病毒雞胚尿囊液均有較高的血凝活性，其中SD-B40和HN2毒株為1∶512；HN1和SD-3220毒株為1∶1 024；SC-B44和SD-3297毒株為1∶2 048，血凝活性最高。具體結(jié)果見表1。

表1 分離株詳細信息

2.2 病毒的8個基因片段擴增及序列測定

提取6株分離株的RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過PCR對6株病毒的8個基因片段進行PCR擴增，所有擴增的片段大小均與預(yù)期相符，如圖1為HA基因片段，圖2為NA基因片段，均連接到pMD-18T載體上，送至公司測序。

2.3 HA和NA同源性分析

將分離到的6株病毒分別與NCBI數(shù)據(jù)庫下載的6株代表毒株的HA和NA序列進行同源性對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SD-3220、SD-3297、SD-B40、HN1、SC-B44毒株的HA核苷酸和氨基酸序列均與Y280毒株同源性最高，HN1分別為93.9%和95%，SD-3220為89.9%和91.2%，SD-3297為89.9%和91.2%，SD-B40為90.7%和93%，SC-B44為94.6%和96.4%；而HN2毒株核苷酸和氨基酸序列與G9毒株同源性最高，為95.7%和95.1%。6株病毒與Y439毒株的HA核苷酸和氨基酸序列同源性最低，分別為80.6%～84.5%和84.8%～88.5%，說明6株病毒與Y439譜系遺傳距離較遠。

NA序列同源性分析結(jié)果顯示，SD-B40、SC-B44、HN1、SD-3297和SD-3220毒株NA核苷酸序列與Y280毒株同源性最高，分別為91%、94.5%、94.7%、90.5%和91.5%，HN2毒株與F/98毒株同源性最高。SC-B44、HN1、SD-3297和SD-3220毒株NA氨基酸序列與Y280和F/98毒株同為最高，分別為96.4%、96.4%、91.4%和92.3%；SD-B40毒株與Y280毒株同源性最高，為93.2%；HN1毒株與F/98毒株同源性最高，為97.6%。

2.4 8個基因片段遺傳進化分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

對6株病毒及其同源性較高的毒株和各譜系代表毒株進行遺傳進化分析，同時構(gòu)建了8個基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示(如圖3、圖4)，這6株病毒均屬于歐亞系，其HA基因?qū)儆赮280/G9-like譜系，NA基因均屬于Y280-like譜系；6株病毒的PB1、PA、NP和NS基因均屬于F/98-like譜系；在M基因和PB2基因來源上有些差異，SC-B44、HN1和HN2毒株的M基因和PB2基因均屬于F/98-like譜系，而SD-B40、SD-3297和SD-3220毒株的M基因和PB2基因均屬于G1-like譜系。因此，SD-B40、SD-3297和SD-3220毒株的8個基因來源符合G57基因型(S基因型)。

▲表示本研究分離株。下同。

圖4 NP(A)、PA(B)、PB1(C)和PB2(D)基因片段系統(tǒng)進化樹

2.5 HA和NA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點分析

2.5.1 HA蛋白裂解位點及受體結(jié)合關(guān)鍵位點分析

將6株病毒的核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，與6個代表毒株HA氨基酸關(guān)鍵位點進行對比分析，結(jié)果見表2。HN1、SC-B44毒株的HA蛋白裂解位點為PARSSR↓GL，SD-3220、SD-3297、SD-B40毒株的裂解位點為PSRSSR↓GL，與早期各譜系代表毒株相比，第2位發(fā)生了由A變?yōu)镾的突變，只有HN2毒株裂解位點為PAKSSR↓GL，第3位發(fā)生了由R變?yōu)镵的突變，6株病毒的裂解位點均為非連續(xù)性堿性氨基酸，符合低致病性毒株特點。SD-3220、SD-3297、SD-B40毒株受體結(jié)合位點左沿為NGLMGR，HN1和SC-B44毒株受體結(jié)合左沿為NGQQGR，HN2毒株受體結(jié)合左沿為NGLQGR，與早期代表毒株相比，SD-3220、SD-3297、SD-B40、HN2毒株發(fā)生了Q226L突變，可能使得這些毒株對人型α-2，6唾液酸受體更具有親和性。228位均為G，未發(fā)生突變。SD-3220、SD-3297、SD-B40毒株受體結(jié)合位點右沿為GTSTA，HN1、HN2和SC-B44毒株受體結(jié)合位點右沿為GTSKA，與早期代表毒株相比，SD-3220、SD-3297、SD-B40毒株發(fā)生了K/A141T突變。

表2 HA蛋白裂解位點、受體結(jié)合位點左沿和受體結(jié)合位點右沿分析

HA蛋白受體結(jié)合關(guān)鍵位點分析結(jié)果顯示(如表3)，在本試驗中的6株病毒的HA蛋白受體結(jié)合關(guān)鍵位點第153、183、194、220位較為保守，均為WNLR；第190和226位變動較大，其中SD-3220、SD-3297和SD-B40毒株發(fā)生了A190T突變，HN1和SC-B44毒株發(fā)生了A190V突變。6株病毒的155位均為T，這可能會使病毒獲得與人型α-2，6唾液酸受體結(jié)合的能力。

表3 HA蛋白受體結(jié)合關(guān)鍵位點分析

2.5.2 HA蛋白潛在糖基化位點分析

將分離的6株病毒與代表毒株的HA蛋白潛在糖基化位點進行比較分析，結(jié)果顯示(如表4)，6株病毒的第21、105、133、290、484、543位點較為保守，6株病毒均有該位點。HN1和SC-B44毒株共有8個潛在糖基化位點，SD-3220、SD-3297、SD-B40毒株共有7個潛在糖基化位點，HN2毒株HA的潛在糖基化位點僅有6個。相對于代表毒株，HN1和SC-B44毒株發(fā)生了137位由S、T或D變?yōu)镹的突變，增加了這一糖基化位點；SD-3220、SD-3297、SD-B40毒株發(fā)生了P307S突變，增加了這一糖基化位點；SD-3220、SD-3297、SD-B40毒株發(fā)生了T212I位突變，缺失了這一糖基化位點；HN2毒株發(fā)生了S299R突變，缺失了這一糖基化位點。

表4 HA蛋白潛在糖基化位點分析

2.5.3 NA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點分析

對H9N2亞型AIV的6株代表毒株和6株分離株的NA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點及潛在糖基化位點進行了對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(如表5)，6株分離株均有62～64位氨基酸的缺失，在6株代表毒株中，Y280和F/98毒株有62～64位氨基酸的缺失。這2個毒株所代表的譜系在我國近20年的流行中占主要地位。6株分離株與代表毒株相比，部分NA糖基化位點較為保守，SD-B40、SD-3297和SD-3220增加了368這一糖基化位點；除了HN2毒株，其余毒株失去了402這一糖基化位點。NA蛋白的紅細胞結(jié)合位點分析結(jié)果顯示，6株病毒的431～433位均為PQE；368和369位氨基酸變化較大，SD-B40發(fā)生了D401G突變。

表5 NA蛋白關(guān)鍵氨基酸位點分析

3 討論

H9N2亞型AIV自1992年在我國廣東省首次分離后，成為目前我國禽類中分布最廣泛且流行率最高的AIV亞型[11-12]。H9N2亞型AIV容易將內(nèi)部基因重新組合到其他亞型的流感病毒中，成為變異病毒基因組的供體[13]。新型重組毒株可能在家禽與家禽之間、家禽與哺乳動物之間、哺乳動物與哺乳動物之間進行傳播，對家禽業(yè)的健康發(fā)展和公眾健康安全造成極大威脅[14-15]。近年來，我國人感染H9N2亞型AIV的病例逐漸增多，血清學(xué)監(jiān)測顯示，人類對H9N2亞型AIV的易感程度高于H5和H7亞型AIV。因此，加強對H9N2亞型AIV的監(jiān)測具有重要意義。

在我國H9N2亞型AIV流行的譜系分為幾個階段，在2000年之前主要為BJ/94-like譜系，隨后逐漸被F/98-like譜系取代，從2010年開始F/98-like譜系逐漸被Y280-like譜系取代，直到現(xiàn)在我國普遍流行的譜系仍然為Y280-like。本研究中的6株病毒均屬于歐亞系，其HA和NA基因均屬于Y280/G9-like譜系，現(xiàn)有的人類感染的H9N2亞型AIV數(shù)據(jù)顯示，Y280/G9-like譜系是大多數(shù)人類病例的來源[16]。6株病毒的PB1、PA、NP和NS基因均屬于F/98-like譜系，其中SD-B40、SD-3297和SD-3220毒株的M基因和PB2基因均屬于G1-like譜系，因此，SD-B40、SD-3297和SD-3220毒株的8個基因來源符合G57基因型。該基因型在2007年出現(xiàn)并逐漸在雞群中穩(wěn)定下來，成為當(dāng)前H9N2亞型AIV流行的最主要基因型[17]。該基因型的HA和NA基因均來源于BJ/94-like譜系(Y280-like譜系)[18]，內(nèi)部基因PB1、PA、NP和NS以F/98-like譜系作為骨架，PB2基因和M基因由F/98-like譜系轉(zhuǎn)變?yōu)镚1-like譜系。而SC-B44、HN1和HN2毒株的M基因和PB2基因來源于F/98-like譜系，這可能與這些毒株分離年份較早有關(guān)。

HA蛋白介導(dǎo)流感病毒附著在細胞唾液酸受體上并與宿主細胞膜融合[11]，HA裂解位點氨基酸序列不同，可影響病毒的組織趨向性、擴散性、致病性。HPAIV的HA裂解位點存在連續(xù)4個以上堿性氨基酸(-RRRR-)，可被宿主不同組織細胞中廣泛存在的多種蛋白酶裂解，引起宿主全身感染[19-20]。LPAIV的HA裂解位點一般只有單一的堿性氨基酸(-R-)[21]，只有特異蛋白酶才能識別出這種結(jié)構(gòu)的HA蛋白并使之發(fā)生裂解，所以病毒的增殖僅限于呼吸道和消化道等[20]。本試驗所分離的6株病毒的HA裂解位點均為非連續(xù)性堿性氨基酸，符合LPAIV毒株特點。

當(dāng)前H9N2亞型AIV的HA蛋白已獲得優(yōu)先與人型α-2，6唾液酸受體結(jié)合的能力[14]，其中Q226L和G228突變發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是跨物種傳播的先決條件[1，22-23]。在2016—2020年我國流行的H9N2亞型AIV中，99.5%毒株HA蛋白226位為L，表明當(dāng)前我國流行毒株普遍增加了病毒跨宿主感染哺乳動物的風(fēng)險[24]。本研究中SD-3220、SD-3297、SD-B40、HN2毒株的HA蛋白發(fā)生了Q226L突變，推測可能具有感染人的潛在風(fēng)險，但6株病毒的228位并未發(fā)生突變。有研究表明，A190V突變可以增強病毒對宿主細胞膜的吸附能力及在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力[10]。HA蛋白的A190V突變不影響病毒與受體結(jié)合特異性，但會增強與小鼠和人類肺組織細胞受體結(jié)合的親和力，190V對人類具有高度親和力，190T次之，190A最低。同時，HA蛋白的A190V突變也是H9N2亞型AIV跨越物種屏障感染哺乳動物的重要決定因素之一[10，25]。在本研究中，SD-3220、SD-3297和SD-B40的190位為T。SC-B44和HN1毒株的HA蛋白發(fā)生了A190V突變，病毒與小鼠和人肺組織細胞受體結(jié)合的親和力較強，存在引起流感大流行的風(fēng)險。

HA蛋白的糖基化對防止病毒蛋白被水解、阻礙宿主抗體識別、維持蛋白三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用[5，21，26]。本研究中HN1和SC-B44毒株的HA蛋白發(fā)生了S/D137N突變，增加了這一糖基化位點，可能導(dǎo)致毒力增強及抗原變異[27]。本研究中所有毒株均有133位糖基化位點，可以增強病毒對SPF雞的毒力、組織臟器復(fù)制能力、病理損傷及體外排毒[28]，SD-3220、SD-3297、SD-B40毒株擁有305位糖基化位點，但210位糖基化位點缺失。HA蛋白305位和210位糖基化位點的增加可以提高病毒與宿主受體的結(jié)合能力[29]。HA蛋白第210位糖基化位點的缺失降低了病毒結(jié)合雞紅細胞的能力，提高了病毒HA蛋白的熱穩(wěn)定性及病毒對雞胚的致死性[30]。

NA蛋白莖部的氨基酸缺失可擴大H9N2亞型AIV的宿主范圍，對小鼠更易感，還可以影響病毒的毒力[31]。本研究中的6株病毒的NA均有62～64位氨基酸的缺失，這也可能是我國H9N2亞型AIV在我國廣泛流行傳播的原因之一。NA莖部缺失可能是H9N2亞型AIV適應(yīng)性突變其中的一種。SD-B40、SD-3297和SD-3220增加了368這一糖基化位點。除了HN2毒株，其余毒株失去了402這一糖基化位點，2個糖基化位點對病毒的影響需要進一步研究。根據(jù)紅細胞結(jié)合位點分析，6株病毒的431～433位點較為保守，而368和369位氨基酸變化較大。在亞洲分離的H9N2亞型AIV的紅細胞結(jié)合位點一直處于特定的選擇壓力下，因此會產(chǎn)生累積突變，從而提高了病毒的適應(yīng)性[25]。

隨著對H9N2亞型AIV研究的深入，發(fā)現(xiàn)了H9N2亞型AIV的宿主范圍不斷擴大，其具有內(nèi)部基因較高的相容性，從而致使其在哺乳動物中的致病性和傳播性都在不斷增強[23]。本研究的6株H9N2亞型AIV均為LPAIV，其HA和NA蛋白發(fā)生了哺乳動物適應(yīng)性突變，增強了對哺乳動物甚至對人的易感性。因此，我們需要對H9N2亞型AIV的跨物種傳播的能力保持充分警惕，并采取更多預(yù)防措施來防止H9N2亞型AIV的傳播，減少對家禽及人類的威脅。