巨型艾美耳球蟲感染對雞Toll樣受體的影響

潘仰棟，刁胤軒，蒲響林，陸明敏，徐立新，嚴若峰，李祥瑞，宋小凱

(南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095)

雞球蟲為頂復門艾美耳屬(Eimeria)腸道寄生性原蟲，公認的雞球蟲有7種，其中巨型艾美耳球蟲(E.maxima)是臨床上危害最嚴重的蟲種之一。雞球蟲感染引起雞球蟲病，該病全球流行，給全球養(yǎng)禽業(yè)帶了巨大的經濟損失，Blake等[1]估算雞球蟲病2016年在全球范圍內造成的經濟損失為104億英鎊。

在雞球蟲入侵宿主的早期，先天性免疫在抗球蟲感染中發(fā)揮主要作用[2-3]。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)是一種重要的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，作為先天性免疫的重要組成部分，它能夠檢測識別多種病原體相關的分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，如脂質、蛋白質、脂蛋白和核酸等，啟動機體的先天性免疫和獲得性免疫[4-6]。已有研究表明，一些腸道病原體如沙門菌感染雞后，會引起宿主多種TLR發(fā)生免疫應答，且應答水平不同[7]；在雞球蟲方面，早熟艾美耳球蟲(E.praecox)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)感染亦可引起宿主特定TLR表達水平的變化[8-9]，提示雞TLR在抵抗腸道病原體感染中發(fā)揮重要作用。而有關巨型艾美耳球蟲感染對宿主TLR的影響還未見報道。雞球蟲主要入侵腸道組織，盲腸扁桃體是腸道中重要的局部免疫組織[10]，外周血、脾臟則是機體重要的免疫組織。為了探究巨型艾美耳球蟲感染對宿主TLR的影響，本研究用巨型艾美耳球蟲感染雞后，選取上述3個組織，對其中的TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21等8種TLR轉錄水平進行檢測[7-8，11-12]，為探究雞TLR在抗球蟲感染中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與蟲株

1日齡海蘭褐雛雞購自南京某雞場，未進行任何疫苗接種，飼養(yǎng)于無雞球蟲卵囊環(huán)境中，自由采食，飼料和飲用水不含任何抗球蟲藥物。

巨型艾美耳球蟲由南京農業(yè)大學寄生蟲病實驗室分離純化，4 ℃保存在2.5%重鉻酸鉀溶液中，每3個月復蘇1次。

1.2 試驗試劑

UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR(with dsDNase)、DEPC水、TRIzol購自諾威贊公司，GS AntiQ qPCR SYBR Green Master Mix購自金沙公司，三氯甲烷、異丙醇和乙醇購自Aladdin，外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋。

1.3 試驗儀器

全自動樣品組織研磨儀(上海凈信)，超微量紫外分光光度計Nanodrop One(Thermo)，冷凍臺式離心機(Eppendorf)，熒光定量PCR儀(ABI Quant Studio 6 Flex)。

1.4 試驗動物的分組與感染

將14日齡雛雞隨機分為感染組和對照組，每組20只雞。感染組每只雞經口感染2×104個巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊，感染組與對照組分開飼養(yǎng)，對照組在無球蟲環(huán)境下進行飼養(yǎng)。

1.5 待檢樣本采集與處理

分別于感染后第0、3、7和11天，隨機選取5只雞，收集其外周血、脾臟及盲腸扁桃體，做好標記，對照組同步采樣。

1.5.1 雞盲腸扁桃體分離

將盲腸扁桃體剪成1 mm左右的碎塊轉移至2 mL離心管中，向離心管中加入2～3個氧化鋯珠子和1 mL TRIzol。離心管放入全自動樣品組織研磨機中，60 HZ運行10 min使組織細胞充分裂解。

1.5.2 雞外周血淋巴細胞分離

用無菌采血管(含4%枸櫞酸鈉)給雛雞心臟采血?？鼓c無菌PBS按1∶1比例混合稀釋。5 mL稀釋抗凝血沿管壁緩慢加入到含有5 mL淋巴細胞分離液的15 mL離心管中，室溫水平轉子500g離心20 min。用1 mL槍頭吸取第2層白色淋巴細胞層并轉移到另一個無菌15 mL離心管中，用無菌PBS洗滌2次，室溫水平轉子300g離心10 min，獲得雞外周血淋巴細胞[13]。

1.5.3 雞脾臟淋巴細胞分離

200目濾網鋪在一次性平皿上，取處死后雞的脾臟置于濾網上，加入少量PBS研磨。濾過的細胞懸液加入到含有3 mL淋巴細胞分離液的15 mL離心管中，室溫水平轉子500g離心20 min[14]。洗滌步驟同外周血。

1.6 提取總RNA和反轉錄cDNA

用TRIzol法提取細胞總RNA[15]。計算各RNA樣品所需體積及DEPC水的體積，向無RNA酶的200 μL PCR管中加入以下試劑及RNA樣品，RNA模板500 ng，4 μL UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix，1 μL dsDNase，NF Water補至20 μL。反轉錄程序為37 ℃ 2 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。

1.7 雞不同組織中TLR的mRNA水平檢測

用實時熒光定量PCR檢測球蟲感染后雞8種TLR的mRNA水平，每個樣本3個計數重復，最后試驗結果采用2-ΔΔCt法計算，分析各組TLR的mRNA水平變化。實時熒光定量PCR反應體系為：1 μL cDNA模板，上、下游引物各0.2 μL，0.2 μL ROX Reference Dye Ⅱ，5 μL 2×GS AntiQ qPCR SYBR Master Mix，3.4 μL ddH2O，總反應體積10 μL。反應程序為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性20 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。實時熒光定量PCR引物序列見表1。

表1 TLR熒光定量PCR引物

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數據進行單因素方差分析，采用One-way ANOVA法進行差異性分析，用GraphPad Prism 8.0作圖。試驗數據以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 雞盲腸扁桃體TLR的mRNA水平變化

用實時熒光定量PCR檢測球蟲感染后第0、3、7、11天雞盲腸扁桃體TLR的mRNA水平。結果如圖1所示，感染后盲腸扁桃體TLR4和TLR21 mRNA水平無顯著差異。TLR1和TLR3 mRNA水平顯著上調(P<0.05)。TLR2 mRNA水平在第3和第7天無顯著差異，在第11天顯著上調(P<0.01)。TLR5和TLR7 mRNA水平在第7和11天顯著上調(P<0.05)。TLR15 mRNA水平在第7天顯著上調(P<0.05)，第11天時下降。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，n=5。下同。

2.2 雞外周血TLR的mRNA水平變化

用實時熒光定量PCR檢測球蟲感染后第0、3、7、11天后雞外周血TLR的mRNA水平。結果如圖2所示，感染后雞外周血TLR4 mRNA水平無顯著差異，TLR21 mRNA水平在第3和第7天無顯著差異。TLR1 mRNA水平在第7天顯著上調(P<0.001)。TLR2的mRNA水平在感染后3、7、11天顯著下調(P<0.05)。TLR3 mRNA水平只有第7天顯著上調(P<0.001)。TLR5和TLR15 mRNA水平在第3天顯著上調(P<0.001)。TLR7 mRNA水平在第7和第11天顯著上調(P<0.01)。TLR21 mRNA水平在11天時顯著上調(P<0.01)。

圖2 巨型艾美耳球蟲感染雞外周血TLR的mRNA水平變化

2.3 雞脾臟TLR的mRNA水平變化

用實時熒光定量PCR檢測球蟲感染后第0、3、7、11天后雞脾臟TLR mRNA水平變化。結果如圖3所示，感染后脾臟TLR4和TLR21 mRNA水平無顯著差異。TLR1、TLR3和TLR5 mRNA水平在第7天顯著上調(P<0.01)。TLR2 mRNA水平在感染后顯著下調(P<0.01)。TLR7和TLR15 mRNA水平在第3天顯著上調(P<0.01)。

圖3 巨型艾美耳球蟲感染雞脾臟TLR的mRNA水平變化

3 討論

雞感染球蟲后，機體會自動產生一系列相關的防御反應，以抵抗球蟲的入侵。在感染早期，先天性免疫反應發(fā)揮主要的抗感染作用，先天性免疫的激活需要模式識別受體的參與[2-3]。TLR是模式識別受體的重要組成部分，也是連接先天性免疫與獲得性免疫的橋梁[5，16-17]，因此，研究雞球蟲感染對宿主Toll樣受體的影響，對于闡明其在抗球蟲感染中的作用具有重要意義。

本研究檢測了巨型艾美耳球蟲感染對雞3種組織中8種Toll樣受體水平的影響。已有文獻報道，TLR1和TLR2主要參與細菌性抗原的識別作用[18-19]，本研究中TLR1水平在3種組織中均上調，這與雞感染沙門菌后脾臟和盲腸的變化趨勢一致，提示TLR1可能也參與雞巨型艾美耳球蟲抗原的識別[7]。TLR2水平在盲腸扁桃體中無顯著變化，而在外周血與脾臟中顯著下調，這與沙門菌感染后雞脾臟TLR2中水平下調相似，TLR2水平降低可下調IL-1、IL-8、INF-β等促炎性細胞因子的表達量，從而抑制炎性反應[20-21]，推測巨型艾美耳球蟲可通過抑制系統(tǒng)免疫中TLR2 的表達來利于在雞體內中的增殖。TLR3、TLR7 和TLR21主要識別病原核酸成分。在本研究中，TLR3和TLR7 mRNA水平在3種組織中均顯著上調，這與一些沙門菌感染和早熟艾美耳球蟲感染結果相似，提示TLR3和TLR7可能參與對巨型艾美耳球蟲抗原的識別[8]。TLR4可以識別脂多糖、甘露聚糖、錐蟲糖基磷脂酰肌醇等多種抗原，但在本研究中TLR4的水平在巨型艾美耳球蟲感染后未表現出顯著的變化趨勢。這與Sumners等[8]報道的結果相似，但與Li等[22]報道沙門菌感染的結果不一致，推測這可能與TLR識別抗原的時間有關，需要對采樣時間進一步細分研究。TLR5主要識別細菌的鞭毛蛋白[23]。本研究中TLR5的mRNA水平在3種組織中均表現出上調，提示TLR5可能也參與雞對巨型艾美耳球蟲抗原的識別。TLR15是禽類特有的TLR。本研究中TLR15的mRNA水平在3種組織中均表現出上調，提示TLR15可能也參與雞對巨型艾美耳球蟲抗原的識別。

本研究還發(fā)現 TLR1、TLR3、TLR5、TLR7 和TLR15 mRNA水平在3種組織中都顯著上升，但免疫應答時間有一些差異，具體體現在：盲腸扁桃體中TLR1和TLR3的mRNA水平在感染后第3天就顯著上升，這比外周血和脾臟的免疫應答時間更早，提示盲腸扁桃體中TLR1和TLR3在局部免疫中可能更早發(fā)揮抗巨型艾美耳球蟲作用；相反外周血和脾臟中TLR5和TLR15 mRNA水平的上調則早于盲腸扁桃體，這提示TLR5和TLR15可能在系統(tǒng)免疫中優(yōu)先發(fā)揮抗巨型艾美耳球蟲作用。

4 結論

本研究結果表明，巨型艾美耳球蟲感染后，TLR2在外周血和脾臟中呈現下降趨勢，TLR1、TLR3、TLR5、TLR7 和TLR15 mRNA水平顯著上升，TLR1和TLR3 mRNA水平在盲腸扁桃體上升早于外周血和脾臟，而其TLR5和TLR15 mRNA水平上升晚于外周血和脾臟。本研究為揭示雞TLR在抗球蟲感染中的作用提供了依據，也為探索雞球蟲先天性免疫機制提供了參考。