牛布氏桿菌病和分枝桿菌病二聯(lián)表位疫苗的構(gòu)建及其免疫效果評價

盧寶平，扈立偉，任君，杜榮起，顧天越，包利霞，劉青，朱凡杰，張東超，2*，金天明

(1. 天津農(nóng)學(xué)院/天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2. 天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/天津市畜禽病原檢測與基因工程疫苗工程技術(shù)中心，天津 300392；3. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/天津市畜禽分子育種與生物技術(shù)重點實驗室，天津 300192)

牛布氏桿菌病(bovine brucellosis)在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是一種人畜共患傳染病[1]。布氏桿菌生存能力特別強，能很快適應(yīng)新的宿主，可以直接或間接地傳播給主要宿主和易感宿主[2]。牛分枝桿菌病(bovine mycobacteriosis)是一種牛的慢性疾病，常導(dǎo)致生產(chǎn)力下降，同時可引起重大的公共衛(wèi)生風(fēng)險[3]。目前預(yù)防兩種疾病的疫苗存在免疫效果不理想和毒力返強風(fēng)險等，且市場上尚無牛布氏桿菌病和分枝桿菌病的二聯(lián)疫苗。因此，研發(fā)一種更安全、有效地防控牛布氏桿菌病和分枝桿菌病的二聯(lián)疫苗具有實際意義。

布氏桿菌Omp25作為一種菌體外膜蛋白，具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生特異性抗體。最新研究發(fā)現(xiàn)，布氏桿菌的毒力與Omp25有關(guān)，缺失Omp25的疫苗菌株在動物模型中毒力減弱，且提供的免疫保護水平與商品化減毒疫苗的保護效果相似[4]。分枝桿菌基因組上的3個獨立基因編碼的抗原85(Ag85)復(fù)合物是牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌(Mtb)和卡介苗(BCG)分泌蛋白，這些蛋白質(zhì)是分枝桿菌細(xì)胞壁合成所需的轉(zhuǎn)移酶[5]。Ag85A作為主要的分枝桿菌分泌蛋白，在誘導(dǎo)強烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[6]。

表位疫苗是基于已知核苷酸或氨基酸序列，利用計算機輔助的免疫信息學(xué)分析等技術(shù)確定和篩選可能的優(yōu)勢表位，然后人工合成或借助基因工程技術(shù)制備含有優(yōu)勢表位的多肽疫苗[7]。表位疫苗最大的優(yōu)點是免疫優(yōu)勢表位的聚集，提高了疫苗的免疫原性，減少其不良反應(yīng)。

本研究通過在線生物軟件對Omp25和Ag85A蛋白進(jìn)行表位篩選，通過連接肽對所篩選的表位進(jìn)行連接，構(gòu)建出2條具有高免疫原性、副作用較小的新表位基因肽段NewⅠ和NewⅡ。將NewⅠ、Omp25、NewⅡ、Ag85A依次用自剪切肽T2A、P2A、E2A進(jìn)行連接，設(shè)計出串聯(lián)基因COE，并構(gòu)建重組質(zhì)粒GV658-COE。免疫動物后，可通過NewⅠ和NewⅡ多表位基因肽段激發(fā)機體細(xì)胞免疫，并通過布氏桿菌Omp25和牛分枝桿菌Ag85A特異性抗原激發(fā)機體免疫反應(yīng)，進(jìn)而實現(xiàn)多基因的協(xié)同免疫效應(yīng)，為牛布氏桿菌病和分枝桿菌病的基因疫苗研究提供試驗基礎(chǔ)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及試驗動物

限制性內(nèi)切酶PacⅠ和EcoRⅤ購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Flag/HA/Myc/His 標(biāo)記小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)和Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑(CCK-8)試劑盒購自金克隆北京生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的大鼠抗CD3+IgG，藻膽蛋白(APC)標(biāo)記的大鼠抗CD4+IgG，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的大鼠抗CD8+IgG抗體均購自biosciences pharmingen公司；ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；6周齡SD大鼠購自北京斯貝福生物科技有限公司(許可證號：SCXK(京)2019-0010)。

1.2 目的基因與序列合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中布氏桿菌Omp25基因(GenBank：AM694369.2)和牛分枝桿菌Ag85A基因(GenBank：GQ150315.1)的核苷酸序列，通過在線軟件ABCPerd和IEBD預(yù)測Omp25基因的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，將所選取的肽段通過VaxiJen軟件預(yù)測其免疫原性，同時用ToxinPred軟件預(yù)測是否具有細(xì)胞毒性，最后選取肽段高評分、免疫原性好且無細(xì)胞毒性肽段的表位作為目標(biāo)表位[8]。將上述篩選出來的細(xì)胞表位通過GPGPG/GPLS連接肽進(jìn)行連接，構(gòu)建出新的肽段NewⅠ。同法預(yù)測Ag85A基因，構(gòu)建出肽段NewⅡ。將NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A依次用自剪切肽T2A、P2A和E2A進(jìn)行連接，構(gòu)建出新的肽段，將其命名為COE。根據(jù)大鼠表達(dá)蛋白質(zhì)偏好密碼子進(jìn)行基因序列優(yōu)化，同時在4個氨基酸序列之后分別添加Flag、HA、Myc和His標(biāo)簽。將COE基因構(gòu)建至真核表達(dá)載體GV658的PacⅠ和EcoRⅤ酶切位點之間，最后由上海吉凱生物技術(shù)有限公司合成并提供目的質(zhì)粒、陰性質(zhì)粒及其甘油菌。

M. DNA Marker；1. COE基因PCR產(chǎn)物。

M. DNA Marker；1. GV658-COE質(zhì)粒；2. 線性化GV658質(zhì)粒；3. GV658-COE質(zhì)粒雙酶切。

1.3 COE基因的PCR及雙酶切鑒定

根據(jù)上述構(gòu)建的COE基因序列設(shè)計特異性引物，COE-F：5′-GTGGATCCGAGCTCGGTACCCGCCACGATATCCATCCAGGAGCAGCCCCCCGTGCCCGCCCCCGTGGAG-3′；COE-R：5′-ATATTTTATTACCGGTTTAATTAACTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCGCCCTGGGGGGC-3′，其中加粗堿基為交換配對堿基，斜體堿基為酶切位點。

將獲得的甘油菌接種氨芐抗性培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，利用上述引物進(jìn)行菌液PCR，反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×PCRTaqmix Buffer，1 μL COE-F，1 μL COE-R，2 μL菌液，8.5 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性35 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸15 min。隨后將PCR產(chǎn)物利用瓊脂凝膠電泳驗證。將上述驗證正確的陽性菌擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并利用限制性內(nèi)切酶PacⅠ和EcoRⅤ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞

將HEK293細(xì)胞按照1×105個/孔加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)，直到細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%。利用Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑對重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在48 h時在顯微鏡下對轉(zhuǎn)染組進(jìn)行拍照，觀察重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，用DAPI試劑對細(xì)胞核進(jìn)行染色，觀察綠色熒光蛋白(GFP)在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)位置。

1.5 Western blot驗證重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

將成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用PBS洗2次，加入裂解液使其充分裂解，加入4×蛋白上樣緩沖液，在100 ℃加熱15 min，冷卻后備用。將上述樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育后，進(jìn)行顯色，在Bio-Rad凝膠成像儀中拍照保存。

1.6 CCK-8法評估重組質(zhì)粒對細(xì)胞的安全性

取濃度為1.0×104個/mL的HEK293細(xì)胞進(jìn)行96孔板鋪板，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到60%～70%時，將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒分別按照4個質(zhì)量濃度50、100、200和400 ng/μL進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別于24、48、72 h加入CCK-8溶液100 μL，37 ℃避光孵育0.5 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測每孔的OD值，計算細(xì)胞活力。

1.7 動物免疫

將18只SD大鼠適應(yīng)性飼喂后，隨機分為3組，第1組為重組質(zhì)粒GV658-COE組，第2組為空載質(zhì)粒GV658組，第3組為空白對照PBS組，自由采食和飲水。將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒按照400 μg/只的劑量進(jìn)行腿部肌肉注射，間隔14 d加強免疫1次，共免疫3次，免疫前進(jìn)行尾靜脈采血。

1.8 T淋巴細(xì)胞的分型檢測

在無菌條件下取大鼠脾臟，加入PBS對脾臟進(jìn)行研磨，過200目篩網(wǎng)收集脾細(xì)胞懸液，在4 ℃和1 500 r/min條件下離心5 min，棄掉上清液，加5 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，冰上裂解10 min，離心，反復(fù)裂解，直到細(xì)胞懸液中無紅細(xì)胞為止。按照抗體說明書對淋巴細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)染色，樣品上機，收集和分析數(shù)據(jù)。

1.9 抗體水平檢測

每次采血后，室溫靜置2 h，2 500 r/min離心20 min，小心吸取血清并做好標(biāo)記。參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。在酶標(biāo)包被板上按照50 μL/孔量分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋血清樣品，置于37 ℃溫育30 min，使用洗滌液洗滌3次；每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，再置于37 ℃溫育60 min，洗滌3次；每孔先后加入顯色劑A和B(各50 μL)，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 μL；混勻后使用分光光度計檢測各樣品在450 nm波長處的OD值。

1.10 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS和GraphPad Prism 7.0進(jìn)行單因素方差分析并繪圖。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原表位的篩選及連接

目的基因Omp25和Ag85A進(jìn)行表位預(yù)測結(jié)果見表1，將所選取的肽段通過GPGPG/GPLS連接肽進(jìn)行連接，同時在N端添加Flag和Myc標(biāo)簽，構(gòu)建出的新肽段分別命名為NewⅠ和NewⅡ。

表1 B細(xì)胞及T細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果

NewⅠ序列為：AIQEQPPVPAPVEVAPQYSWGPGPGAIQEQPPVPAPVEVAPQYSWGPGPGGYGWNKA-KTSTVGSIKPDDGPGPGGYGWNKAKTSTVGSIKPDDG-PGPGGYSWAKKSKDGLEVKQGFGPGPGIKLNNGLDD-ESKFRVGPLSQEQPPVPAPGPGPGFQQDQIVYGPGPGV-SAALLPFSATAFAADGPGPGVSAALLPFSATAFAADGPG-PGVSAALLPFSATAFAAD。

NewⅡ序列為：LVGAVGGTATAGAFSRPGLPGPGPGSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKGPGPGDAGGYK-ASDMWGPKEDPAWQRNGPGPGKPSDLGGNNLPAKG-PGPGLGATPNTGPAPGPGPGLVGAVGGTATAGAFSRP-GLPGPGPGSSFYSDWYQPACGKAGCQTYKGPGPGPS-QAMGPTGPLSSELPGWLQAGPGPGVEYLQVPSPGPG-PGSALTLAIYHGPGPGGVFDFPDSGTHGPGPGPQQFV-YAGAMSGLLD。

2.2 NewⅠ和NewⅡ序列的二級結(jié)構(gòu)及其抗原性

NewⅠ和NewⅡ序列的預(yù)測結(jié)果分別是：α螺旋分別為8.89%和3.23%，β轉(zhuǎn)角分別為4.44%和6.85%，延伸鏈分別為19.56%和16.53%，無規(guī)則卷曲分別為67.1%和73.39%。表明該序列中無規(guī)則卷曲占比較高，具有良好的免疫原性；通過在線軟件VaxiJen預(yù)測NewⅠ和NewⅡ序列的抗原性，評分分別為0.945 2和0.904 7，分值均大于0.4，說明該序列可能具有較好的抗原性。

2.3 COE基因的驗證與表達(dá)

PCR和雙酶切結(jié)果顯示，在3 231 bp處出現(xiàn)明亮的目的條帶，與目的基因序列片段大小一致(圖1、圖2)。經(jīng)測序和同源性分析，未發(fā)現(xiàn)堿基的缺失、增加及突變，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

通過熒光顯微鏡觀察，重組質(zhì)粒GV658-COE在轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后，可觀察到清晰的綠色熒光，且綠色熒光蛋白基本在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞結(jié)果

2.5 Western blot驗證重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖4所示。NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A蛋白分別在22.3、17.3、23.9和35.6 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，空載及未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞未出現(xiàn)條帶，β-actin內(nèi)參各組均在42 kDa處出現(xiàn)特異性條帶。結(jié)果表明，融合Flag、HA、Myc和His標(biāo)簽的NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A蛋白在HEK293細(xì)胞中能夠成功表達(dá)，且特異性蛋白條帶與實際蛋白大小相符。

圖4 重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

A. 24 h；B. 48 h；C. 72 h；****表示P<0.001，ns表示P>0.05。下同。

2.6 CCK-8法評估重組質(zhì)粒對細(xì)胞活性的影響

將重組質(zhì)粒GV658-COE、空載質(zhì)粒GV658和PBS分別和轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行混合，按照50、100、200、400 ng的劑量轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。結(jié)果如圖5所示，在24 h時，細(xì)胞存活率分別是101%、100%、107%和107%，最高濃度劑量組與PBS組相比差異不顯著(P>0.05)，且相同濃度劑量組組間差異不顯著(P>0.05)。在48和72 h時，最高濃度劑量組與PBS組差異極顯著(P<0.01)，但相同濃度劑量組組間差異不顯著(P>0.05)。

2.7 T淋巴細(xì)胞分型

由表2可見，與PBS組相比，三免后重組質(zhì)粒組大鼠脾臟中CD4+T淋巴細(xì)胞在CD3+T淋巴細(xì)胞中的百分比顯著升高(P<0.05)，而CD8+T淋巴細(xì)胞在CD3+T淋巴細(xì)胞中的百分比顯著降低(P<0.05)；在CD3+T淋巴細(xì)胞中CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞的比值無顯著性差異(P=0.27)。而且，重組質(zhì)粒組與空載質(zhì)粒組、空載質(zhì)粒與PBS組之間所有指標(biāo)均無顯著性差異。

表2 CD4+、CD8+與CD3+ T淋巴細(xì)胞比值 %

2.8 ELISA檢測抗體水平

由圖6可見，在免疫第42天時，重組質(zhì)粒免疫大鼠產(chǎn)生的布氏桿菌IgG抗體水平極顯著高于空白對照PBS組(P<0.01)，顯著高于空載質(zhì)粒GV658組(P<0.05)，且GV658組和PBS組之間大鼠產(chǎn)生的布氏桿菌IgG抗體水平無顯著性差異(P>0.05)。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同。

由圖7可見，在免疫第14天時，重組質(zhì)粒免疫大鼠產(chǎn)生的分枝桿菌IgG抗體水平顯著高于空載質(zhì)粒GV658組(P<0.05)，極顯著高于空白對照PBS組(P<0.01)；在免疫第28和42天時，重組質(zhì)粒免疫大鼠產(chǎn)生的分枝桿菌IgG抗體水平顯著高于空白對照PBS組(P<0.05)。而且，GV658組和PBS組之間大鼠產(chǎn)生的分枝桿菌IgG抗體水平無顯著性差異(P>0.05)。

圖7 分枝桿菌IgG變化

3 討論

布氏桿菌可導(dǎo)致妊娠母牛的流產(chǎn)和公牛的睪丸炎[9]，牛分枝桿菌常常引起牛的肺結(jié)核、淋巴結(jié)核和腸結(jié)核[10]，兩種疾病一直影響著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，時刻威脅著動物的生命與健康，接種疫苗是預(yù)防這兩種疾病最有效的途徑。表位疫苗具有免疫力持久、抗原優(yōu)化、成本低的巨大優(yōu)勢。由于兩種細(xì)菌都是胞內(nèi)寄生菌，因此，能夠激發(fā)有效的細(xì)胞免疫就顯得格外重要。表位疫苗可以達(dá)到這樣的效果，研制表位疫苗的關(guān)鍵是找到特異性抗原，其抗原的結(jié)構(gòu)與其功能具有密切的相關(guān)性[11]。

隨著信息技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為表位疫苗的設(shè)計奠定了基礎(chǔ)，使用這些免疫信息學(xué)工具可以很好的預(yù)測特異性抗原表位[12]?？乖恼_選擇是設(shè)計表位疫苗的關(guān)鍵，選擇可以有效刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位是決定表位疫苗是否有效的關(guān)鍵所在[13-14]。單獨表位構(gòu)成的表位基因疫苗的效果遠(yuǎn)低于T、B細(xì)胞表位聯(lián)合后所構(gòu)建的疫苗[15]。本試驗采用在線軟件IEBD、BepiPred、ABCPred對序列進(jìn)行T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位預(yù)測，克服了單一肽表位作為候選表位疫苗的局限性。在相同細(xì)胞表位間通過柔性肽GPGPG連接，T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位間用剛性肽GPLS連接，以此形成多抗原表位來啟動抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，引起高效免疫反應(yīng)[16]。

2A肽是來源于病毒的短肽，一般為18～25個氨基酸，它們通常被稱為“自我剪切”肽，能使一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生多種蛋白。2A肽并不是完全的“自我剪切”，而是通過使核糖體跳過2A元件C末端的甘氨酸和脯氨酸肽鍵的合成而發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致2A序列末端和下游產(chǎn)物分離。其中，上游蛋白的C端將會添加一些額外的2A殘基，而下游蛋白的N端將會有額外的脯氨酸。目前有4種常用的2A肽，分別是P2A、T2A、E2A和F2A，來源于4種不同的病毒。

本研究通過前期的預(yù)測，選取的抗原肽段穩(wěn)定性良好，抗原性較高，不容易發(fā)生變形，適合用來進(jìn)行表位疫苗設(shè)計。兩種新肽段的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲都占比較高，容易形成抗原表位[17]。布氏桿菌和分枝桿菌的感染都能促進(jìn)適應(yīng)性Th1免疫應(yīng)答，引起干擾素-γ(IFN-γ)釋放，增強抗原向T細(xì)胞的呈遞[18-19]。細(xì)胞免疫是清除細(xì)胞內(nèi)寄生微生物的最為有效的防御反應(yīng)，T細(xì)胞功能性亞群主要分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞能夠識別細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類抗原復(fù)合物，CD4+T細(xì)胞的受體能識別與MHCⅡ類結(jié)合的外來抗原。本研究構(gòu)建的二聯(lián)表位疫苗通過細(xì)胞計數(shù)試驗首先證明了重組質(zhì)粒具有較好的安全性；免疫大鼠后，CD4+T淋巴細(xì)胞比例顯著升高，表明強烈激發(fā)了機體的細(xì)胞免疫反應(yīng)；另外，該疫苗在免疫大鼠14 d后，體液免疫也表現(xiàn)出較好的效果，明顯優(yōu)于牛分枝桿菌cfp10-esat6-cfp7融合基因重組乳酸菌的免疫原性[20]。值得注意的是，隨著免疫次數(shù)的增加，血清中的抗體效價呈明顯上升趨勢，而未到達(dá)一個峰值，猜測與免疫的質(zhì)粒濃度有關(guān)，有待進(jìn)一步驗證。本研究所構(gòu)建的重組二聯(lián)表位基因疫苗彌補了現(xiàn)有疫苗的部分不足之處，具有一定的免疫保護效果，有望成為牛布氏桿菌病和分枝桿菌病預(yù)防的候選疫苗。