日本腦炎病毒感染宿主后m6A甲基化相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位研究

歐宇達(dá)，李曉晗，陳婧，趙炳樞，陳健芃，毛玎懿，周江飛，周斌

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，是一種單股正鏈RNA病毒[1-2]。由JEV感染引起的日本腦炎是一種蚊媒嗜神經(jīng)性人獸共患病毒性傳染病，嚴(yán)重危害畜牧養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全[3]。研究JEV與宿主的互作，有助于發(fā)掘新的抗病毒靶點(diǎn)，為研發(fā)有效的抗病毒藥物提供理論基礎(chǔ)。m6A甲基化(N6-methyladenosine)是RNA中腺嘌呤6號(hào)碳原子發(fā)生甲基化修飾，是真核生物mRNA上最重要的表觀(guān)遺傳修飾方式之一，參與調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、降解等過(guò)程，在真核生物的生長(zhǎng)、代謝、生殖、疾病發(fā)生發(fā)展等多種生理或病理過(guò)程中起著重要的作用[4]。m6A甲基化修飾是個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程，主要由其相關(guān)蛋白家族如甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like protein 3，METTL3)，甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like protein 14，METTL14)，去甲基化酶肥胖和脂肪相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated，F(xiàn)TO)，結(jié)合蛋白如YTF家族蛋白(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3)等發(fā)揮各自的功能而共同完成[5-10]。近年來(lái)，關(guān)于m6A及其相關(guān)蛋白影響病毒-宿主互作的研究屢有報(bào)道，它們可通過(guò)對(duì)病毒基因組的修飾直接影響病毒的生命周期，或者通過(guò)調(diào)控宿主免疫、代謝等途徑等間接影響病毒復(fù)制，提示m6A是調(diào)節(jié)抗病毒免疫的潛在靶點(diǎn)。

目前已發(fā)現(xiàn)黃病毒科、黃病毒屬的一些成員如寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的感染與m6A及其相關(guān)蛋白具有關(guān)聯(lián)性，m6A通過(guò)不相同的機(jī)制，調(diào)控它們的復(fù)制[11-12]。然而對(duì)于JEV是否受到m6A調(diào)控，目前暫未有研究報(bào)道。因此，本研究選擇JEV的易感動(dòng)物C57BL/6小鼠作為體內(nèi)模型，易感細(xì)胞BHK-21作為體外模型，通過(guò)m6A水平檢測(cè)、Western blot、激光共聚焦等試驗(yàn)探究JEV感染在體內(nèi)外兩個(gè)層面的m6A水平的變化及其主要相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位的變化，對(duì)JEV的感染與m6A的關(guān)系進(jìn)行初步探究，為后續(xù)進(jìn)一步研究m6A對(duì)JEV感染的調(diào)控及其相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和試驗(yàn)動(dòng)物

乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)和JEV NJ2008株(GenBank序列號(hào)：GQ918133)由本實(shí)驗(yàn)室保存。3周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。

1.2 主要抗體、試劑

鼠源JEV-NS5單克隆抗體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)曹勝波教授惠贈(zèng)；兔源METTL3(15073-1-AP)、METTL14(26158-1-AP)、FTO(27226-1-AP)、YTHDF1(17479-1-AP)、YTHDF2(24744-1-AP)、YTHDF3(25537-1-AP)多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司。

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素購(gòu)自Gibco公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鼠源β-actin單抗，羊抗鼠、羊抗兔IgG HRP，購(gòu)自Santa Cruz公司；TRIzol購(gòu)自TaKaRa公司；羊抗兔 IgG H&L(Alexa Fluor 488)、羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor 594)購(gòu)自Proteintech公司；EvaGreen 2×qPCR MasterMix、5×All-In-One RT Master Mix快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京愛(ài)必夢(mèng)生物材料有限公司；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biosharp公司；AR級(jí)純度化學(xué)試劑購(gòu)自南京壽德試驗(yàn)器材有限公司；RIPA 細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DAPI染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；EpiQuikTMm6A RNA甲基化定量比色法檢測(cè)試劑盒(P-9005)購(gòu)自EpiGentek公司。

A. 生存曲線(xiàn)；B.感染第9天；C.感染第13天；D.感染第14天。***表示腎組織與腦組織比較差異極顯著(P<0.001)。

1.3 細(xì)胞接毒及樣本處理

將BHK-21細(xì)胞傳代后均勻鋪至35 mm細(xì)胞碟皿進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右時(shí)，接種稀釋好的JEV病毒液，感染復(fù)數(shù)(MOI)=0.1，孵育1.5 h后棄去病毒液，用含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基維持，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間，收取樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。若收樣用于m6A水平檢測(cè)，則提取RNA；若收樣用于Western blot，則提取總蛋白，將35 mm細(xì)胞碟皿棄上清液，用預(yù)冷的1×PBS清洗后加入RIPA裂解液，置于4 ℃搖床孵育30 min，于冰浴中用細(xì)胞刮子刮下殘留團(tuán)塊，將液體轉(zhuǎn)移到離心管，以4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，測(cè)定蛋白濃度，按體積比1∶5的比例加入5×SDS Loading buffer，待上樣用。上樣時(shí)根據(jù)每個(gè)樣品蛋白濃度加入不同體積樣品，以調(diào)齊蛋白上樣量(統(tǒng)一為30 μg)。

1.4 小鼠模型建立與臟器樣本的處理

將同批次小鼠分別設(shè)置對(duì)照組10只和JEV攻毒組10只，隨機(jī)分籠飼養(yǎng)。為了使腹腔注射的病毒能較完全地進(jìn)入血腦屏障，攻毒前將所有小鼠用微量注射器進(jìn)行破腦處理，并緩慢注射50 μL無(wú)菌1×PBS以保證破腦成功，待小鼠狀態(tài)恢復(fù)后開(kāi)始攻毒。攻毒組每只小鼠腹腔注射稀釋好2×104PFU(0.2 mL毒價(jià)為105PFU/mL的病毒液)的JEV病毒，對(duì)照組腹腔注射等量無(wú)菌1×PBS。每日觀(guān)察小鼠生命體征和精神狀態(tài)，攻毒組每次有小鼠出現(xiàn)JEV感染典型癥狀(拒食、離群、精神沉郁、共濟(jì)失調(diào)、顫抖)后，抽取等量同日對(duì)照組小鼠，一同斷頸處死后剖取腦、脾和腎等臟器，迅速凍存于液氮中，待后續(xù)試驗(yàn)取用。若樣本用于m6A水平檢測(cè)或熒光定量PCR(RT-qPCR)，則將樣品各切取0.1 g，在冰浴中加入RIPA充分研磨后，在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心2 min，棄沉淀將研磨液轉(zhuǎn)至離心管，進(jìn)行RNA的提??；若樣本用于Western blot，則提取總蛋白，加入RIPA裂解液充分研磨，于4 ℃搖床孵育30 min，孵育后每個(gè)樣品超聲破碎10 min，再以4 ℃、12 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，測(cè)定蛋白濃度，按1∶5比例加入5×SDS Loading buffer，待上樣用。上樣時(shí)根據(jù)每個(gè)樣品蛋白濃度加入不同體積樣品，以調(diào)齊蛋白上樣量(統(tǒng)一為30 μg)。

1.5 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

用TRIzol試劑抽提總RNA，根據(jù)5×All-In-One MasterMix快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反轉(zhuǎn)錄體系。體系1：將4 μL提取的RNA和2 μL 4×AccuRT Reaction Mix加入PCR管中，總體系為6 μL，混勻、瞬離，室溫靜置5 min。體系2：將2 μL 5×Accurt Reaction Stopper、4 μL 5×All-In-One RT Master Mix以及6 μL DEPC水同時(shí)加入PCR管中，總體系為12 μL，混勻、瞬離。將體系2與體系1混勻、瞬離。置于PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min(35個(gè)循環(huán))。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)小鼠臟器中病毒載量

選取1.4中每個(gè)發(fā)病日同一只發(fā)病小鼠的腦、脾和腎，各臟器切取等質(zhì)量的3份(均為0.1 g)，進(jìn)行樣本處理、RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)qPCR引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成引物。本研究所使用的引物序列如表1所示。根據(jù)EvaGreen試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，設(shè)置qPCR反應(yīng)程序。根據(jù)qPCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較各臟器中病毒載量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用相對(duì)定量法進(jìn)行分析，每組數(shù)據(jù)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將試驗(yàn)得到的JEV的目的基因Ct值與自身內(nèi)參(GAPDH)Ct值相減得到每一組的ΔCt，再將試驗(yàn)組ΔCt與對(duì)照組ΔCt相減可得ΔCt，2-ΔCt表示目的基因表達(dá)水平與對(duì)照組的倍數(shù)差異。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 細(xì)胞和小鼠臟器的m6A水平檢測(cè)

按照1.3的方法在35 mm細(xì)胞碟皿鋪細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，感染JEV 24 h后，收集和處理樣品，提取RNA；切取1.4中第1個(gè)發(fā)病日(第9天)的感染小鼠和對(duì)照小鼠的腦、腎，處理樣品，將上述樣品提取RNA。按照EpiQuikTMm6A RNA Methylation Quantification Kit說(shuō)明書(shū)中的具體步驟檢測(cè)樣本中m6A水平。

1.8 蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞和小鼠臟器m6A相關(guān)蛋白表達(dá)水平

選取1.2中第1個(gè)發(fā)病日(第9天)的JEV感染小鼠和對(duì)照小鼠的腦、腎切取等質(zhì)量(0.1 g)樣品，收取35 mm中細(xì)胞碟皿中JEV(MOI=0.1)感染0、6、12、24和36 h的細(xì)胞樣品，按照1.3和1.4中的方法提取總蛋白。通過(guò)Western blot檢測(cè)組織和細(xì)胞中m6A相關(guān)蛋白水平，以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.9 激光共聚焦

將BHK-21細(xì)胞均勻鋪于共聚焦小皿，待細(xì)胞匯合度為90%左右，感染JEV(MOI=0.1)24 h，設(shè)對(duì)照組和感染組。感染24 h后，收獲細(xì)胞樣本，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，并用0.1% Triton X-100室溫透膜處理，然后各組使用METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3和JEV NS5抗體4 ℃孵育過(guò)夜，并通過(guò)FITC和TRITC標(biāo)記的熒光二抗染色，使用DAPI染核，使用共聚焦顯微鏡觀(guān)察蛋白在胞內(nèi)的定位分布。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用GraphPad Prism 8軟件分析，用t檢驗(yàn)方法比較對(duì)照組和試驗(yàn)組中的數(shù)據(jù)，各試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 JEV感染小鼠模型的生存曲線(xiàn)和臟器病毒載量

初步建立了JEV感染的C57BL/6小鼠模型，攻毒組部分小鼠分別于攻毒后的第9、13和14 天開(kāi)始出現(xiàn)感染癥狀，第15天后未出現(xiàn)發(fā)病小鼠，最終存活率為30%(圖1A)。每個(gè)發(fā)病日選取同一只發(fā)病鼠的腦、脾和腎3種JEV靶器官，各器官切取等質(zhì)量的3份(均為0.1 g)提取RNA進(jìn)行RT-qPCR。檢測(cè)各器官中病毒載量，以JEV在小鼠中組織嗜性最強(qiáng)的靶器官腦為參照，對(duì)3種器官的病毒載量進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，3個(gè)發(fā)病日的樣品中，均只在腦和腎中檢出有病毒，且腦中的病毒載量極顯著高于腎(P<0.001)，而脾臟中始終未檢出病毒(圖1B、1C、1D)。因此采用腦和腎進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 JEV感染對(duì)體內(nèi)外m6A水平的影響

采取同一個(gè)發(fā)病日的對(duì)照小鼠和發(fā)病小鼠的腦和腎以及感染JEV(MOI=0.1)的BHK-21細(xì)胞，分別提取RNA并檢測(cè)總體m6A水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，攻毒組小鼠的腦、腎中帶有m6A修飾的RNA占總RNA的比例極顯著升高(P<0.01，圖2A、2B)；同樣地，感染JEV的BHK-21細(xì)胞和未感染細(xì)胞相比，m6A修飾的RNA占比也極顯著升高(P<0.01，圖2C)。結(jié)果說(shuō)明，JEV感染能使小鼠腦、腎以及BHK-21細(xì)胞總體m6A水平上升，推測(cè)JEV的感染可能通過(guò)m6A水平的上升來(lái)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的某些生物學(xué)變化，這些變化與JEV的感染具有關(guān)聯(lián)性。

**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 JEV感染對(duì)體內(nèi)外m6A相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

通過(guò)Western blot檢測(cè)同一個(gè)發(fā)病日(第9天)的JEV感染小鼠和對(duì)照小鼠腦、腎中METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3蛋白表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在感染JEV小鼠的腦和腎中，METTL3表達(dá)均顯著增加，且腦中該蛋白與對(duì)照組相比的上升幅度遠(yuǎn)大于腎，而其他蛋白未發(fā)生明顯變化(圖3A)。隨著時(shí)間點(diǎn)的推移，感染JEV(MOI=0.1)的BHK-21細(xì)胞中METTL3表達(dá)量逐漸增加，而其他蛋白未呈現(xiàn)出明顯的或有規(guī)律的變化趨勢(shì)(圖3B、3C)。以上結(jié)果說(shuō)明，JEV感染促進(jìn)了C57BL/6小鼠腦、腎以及BHK-21細(xì)胞中METTL3的表達(dá)。

圖3 JEV感染后小鼠腦、腎(A)和BHK-21細(xì)胞(B)中m6A相關(guān)蛋白的變化

2.4 JEV感染對(duì)細(xì)胞中m6A相關(guān)蛋白亞細(xì)胞定位的影響

將JEV(MOI=0.1)感染BHK-21細(xì)胞24 h，用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞中的METTL3、METTL14、FTO基本分布在細(xì)胞核中，YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3基本分布在細(xì)胞質(zhì)中，而感染JEV后METTL3、METTL14的亞細(xì)胞定位發(fā)生了明顯的改變，從核中往外彌散到細(xì)胞質(zhì)，與JEV的NS5蛋白共存于細(xì)胞質(zhì)中(圖4A、4B)，但其他蛋白的亞細(xì)胞定位未出現(xiàn)明顯變化(圖4C、4D、4E和4F)。這個(gè)現(xiàn)象說(shuō)明JEV具備“招募”甲基轉(zhuǎn)移酶并改變其亞細(xì)胞定位的能力，這樣更多的METTL3和METTL14蛋白出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，然后與JEV產(chǎn)生某些聯(lián)系，調(diào)控其復(fù)制。

圖4 JEV感染后BHK-21細(xì)胞中m6A相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位(標(biāo)尺=10 μm)

3 討論

以JEV、ZIKV、HCV、登革病毒(DENV)、西尼羅河病毒(WNV)和黃熱病毒(YFV)為代表的黃病毒嚴(yán)重危害人類(lèi)和動(dòng)物健康[13]，揭示病毒與宿主互作關(guān)系是不斷提升病毒病診斷與防治技術(shù)的基礎(chǔ)。近年來(lái)，學(xué)者們填補(bǔ)了m6A甲基化在黃病毒中作用研究的空白，m6A對(duì)ZIKV和HCV的負(fù)向調(diào)控作用被發(fā)現(xiàn)，其通過(guò)加速病毒RNA轉(zhuǎn)錄本的降解抑制ZIKV的復(fù)制，通過(guò)結(jié)合蛋白YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3作用于脂滴影響病毒的裝配、釋放，抑制HCV的復(fù)制[11-12]，但仍然存在許多未知的機(jī)制有待發(fā)掘，并且同為黃病毒屬的JEV的m6A相關(guān)研究也仍是一片空白。因此，探究m6A是否調(diào)控以及如何調(diào)控JEV的復(fù)制，揭示m6A修飾在JEV感染中的作用，具有重要意義。

JEV具有強(qiáng)烈的神經(jīng)嗜性，腦是JEV在小鼠體內(nèi)十分重要的靶器官[3，14-15]。除腦外，脾臟、腎臟、肝臟、肺臟和腸也是較為重要的靶器官，且侵染選擇性、侵染效率因毒株、小鼠種類(lèi)、周齡和個(gè)體差異而異[14，16]。本文以C57BL/6小鼠作為JEV體內(nèi)感染模型，在腦和腎臟中檢測(cè)出明顯的病毒載量，而脾臟未檢測(cè)出，說(shuō)明在3周齡雌性C57BL/6小鼠中，JEV在腦和腎臟中具有較強(qiáng)的復(fù)制能力，而在脾臟中的復(fù)制能力極其微弱。隨后發(fā)現(xiàn)感染了JEV的小鼠腦和腎臟以及BHK-21細(xì)胞中總體m6A水平都顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明JEV的感染可誘導(dǎo)體內(nèi)外m6A水平上調(diào)，這表明JEV的復(fù)制可能受到m6A修飾的調(diào)控。

在m6A修飾的過(guò)程中，METTL3和METTL14等甲基轉(zhuǎn)移酶催化甲基化過(guò)程，F(xiàn)TO等去甲基化酶催化去甲基化過(guò)程，兩過(guò)程動(dòng)態(tài)可逆，而結(jié)合蛋白YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3發(fā)揮了輔助作用，幫助m6A修飾實(shí)現(xiàn)對(duì)靶RNA的生物學(xué)功能，如提高翻譯效率，延緩或加速mRNA的降解，調(diào)控RNA的剪切和核轉(zhuǎn)運(yùn)等[4-10]。而m6A對(duì)不同病毒復(fù)制的促進(jìn)或者抑制，通常由上述蛋白中的1～2種起著決定性作用，如m6A在A549細(xì)胞中正向調(diào)控甲型流感病毒(IAV)復(fù)制由METTL3和YTHDF2主導(dǎo)[16]，在小鼠源巨噬細(xì)胞中正向調(diào)控水皰性口炎病毒(VSV)和仙臺(tái)病毒(SeV)由METTL14主導(dǎo)[17-18]。參考Winkler等[19]、李衛(wèi)宇[20]的相關(guān)研究方法進(jìn)一步試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)感染JEV小鼠的腦和腎中METTL3的表達(dá)量相比對(duì)照組有了明顯增加，且病毒載量較高的腦中METTL3表達(dá)量上升幅度顯著高于病毒載量相對(duì)較低的腎臟；感染JEV的BHK-21細(xì)胞中METTL3表達(dá)量隨感染時(shí)間推移而上升，初步推測(cè)JEV感染C57BL/6小鼠和BHK-21細(xì)胞造成的m6A水平上升，是由METTL3主導(dǎo)，JEV的感染與METTL3存在較大關(guān)聯(lián)。

與其他黃病毒一樣，JEV復(fù)制的全過(guò)程在細(xì)胞質(zhì)中完成[3]。正常情況下，METTL3、METTL14和FTO定位于細(xì)胞核中表達(dá)[5，7]，而YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3則分布在細(xì)胞質(zhì)中[8-10]。因此，在共聚焦顯微鏡下觀(guān)察，理論上感染JEV后如果METTL3、METTL14和FTO不發(fā)生易位，則不會(huì)和病毒蛋白共存于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3能和病毒蛋白共存于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。已有文獻(xiàn)報(bào)道一些在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的病毒如柯薩奇病毒A組16型(CVA16)、腸病毒71(EV71)、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染細(xì)胞后，可誘導(dǎo)METTL3、METTL14和FTO定位改變，即大量蛋白由細(xì)胞核被“招募”到了細(xì)胞質(zhì)，從而細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均有彌散分布該蛋白的情況[19-22]。研究者發(fā)現(xiàn)，METTL3與EV71的3D蛋白之間存在互作，并通過(guò)降低3D的泛素化和SUMO化修飾提高3D穩(wěn)定性及聚合酶活性進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制，這個(gè)過(guò)程卻與m6A修飾沒(méi)有直接關(guān)系[21]。不同的是，SARS-CoV-2的RdRP(RNA依賴(lài)的RNA聚合酶)可反過(guò)來(lái)抑制METTL3的泛素化和SUMO化而促進(jìn)METTL3的表達(dá)，進(jìn)而加強(qiáng)SARS-CoV-2自身RNA的m6A修飾，促進(jìn)病毒復(fù)制，這個(gè)發(fā)現(xiàn)的前提是建立在他們已發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2基因組RNA上存在m6A修飾，且m6A修飾促進(jìn)該病毒復(fù)制[23]。本研究的共聚焦顯微鏡結(jié)果表明，在感染JEV的BHK-21細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象，JEV感染“招募”METTL3和METTL14出核，而這種亞細(xì)胞定位改變的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

本研究將JEV的感染和m6A甲基化建立起聯(lián)系，JEV感染后在體內(nèi)外引起m6A水平和METTL3蛋白上調(diào)，但是m6A調(diào)控JEV復(fù)制的具體機(jī)制是今后試驗(yàn)中需要解決的問(wèn)題?？傊?，本文為JEV的感染機(jī)制研究提供了新思路。