牛羊毛發(fā)中3種β-受體激動(dòng)劑藥物殘留測(cè)定的EMR-Lipid方法研究

李文輝，于寒冰，倪香艷，張晶晶，魏紫嫣，王樂(lè)宜，趙雅妮，趙瑩，方芳，孫志文

(北京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，北京 102600)

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等是最常見的β-受體激動(dòng)劑類藥物，具有促進(jìn)動(dòng)物快速生長(zhǎng)、降低脂肪含量、提高瘦肉率的作用[1-2]，在我國(guó)常被違規(guī)作為促生長(zhǎng)添加劑使用而被廣泛關(guān)注。政府多次發(fā)布牛羊養(yǎng)殖過(guò)程非法使用β-受體激動(dòng)劑類藥物的情況，藥物在動(dòng)物體內(nèi)殘留通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后會(huì)使人產(chǎn)生肌肉震顫、心悸、惡心等中毒癥狀，危害人類健康[1-3]。歐盟和國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)制定了藥物的限制使用規(guī)定，我國(guó)早在1997年明令禁止克倫特羅作飼料添加劑，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250號(hào)公告[4]已經(jīng)對(duì)克倫特羅等β-受體激動(dòng)劑類藥物在所有可食用動(dòng)物組織中做出明確的禁用規(guī)定，但現(xiàn)實(shí)養(yǎng)殖過(guò)程中，為了縮短上市周期，獲得高回報(bào)收益，特別是在牛羊等長(zhǎng)養(yǎng)殖周期動(dòng)物上的使用仍然存在。

目前通常選用可食性組織或者血液和尿液作為監(jiān)測(cè)目標(biāo)，動(dòng)物可食性組織的采集需在屠宰之后，存在時(shí)滯性和局限性，即使檢出不合格，對(duì)于已流入市場(chǎng)的不合格樣品因追溯困難也難以做到及時(shí)有效的管控；同時(shí)藥物在血液和尿液中代謝速度快，停藥一段時(shí)間后已檢測(cè)不到藥物殘留，此時(shí)動(dòng)物組織中仍可能有藥物殘留，容易造成漏檢，嚴(yán)重威脅著動(dòng)物性食品安全，使監(jiān)管面臨巨大挑戰(zhàn)[1-2]。多項(xiàng)研究表明動(dòng)物毛發(fā)中可以蓄積多種獸藥，包括興奮劑類、激素類等藥物[3，5-8]，同時(shí)，β-受體激動(dòng)劑藥物在動(dòng)物毛發(fā)中代謝活性低，動(dòng)物毛發(fā)消除規(guī)律研究表明藥物在毛發(fā)中可以穩(wěn)定存在，因此可作為β-受體激動(dòng)劑藥物在畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)違法添加監(jiān)測(cè)監(jiān)管的靶標(biāo)，也成為評(píng)價(jià)動(dòng)物性產(chǎn)品中藥物殘留量的重要參考組織[1-2]。為了解決上述問(wèn)題，本研究提供了一種牛羊毛發(fā)樣品中β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留檢測(cè)方法，利用動(dòng)物毛發(fā)實(shí)現(xiàn)無(wú)需宰殺動(dòng)物檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑類藥物并可以對(duì)牛羊養(yǎng)殖屠宰整個(gè)周期持續(xù)監(jiān)測(cè)，結(jié)合高效的強(qiáng)化基質(zhì)去除技術(shù)(EMR-Lipid)獲取出色的待測(cè)藥物回收率，提高多種藥物同時(shí)定量分析的效率，滿足高效率測(cè)定的需求，準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度高，為動(dòng)物性產(chǎn)品中β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留量測(cè)定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備和耗材

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有MassLynx V4.1軟件處理系統(tǒng)，美國(guó)沃特世公司)；TTL-DCII氮吹儀(美國(guó)Jnc公司)；Vortex 3000 Elite旋渦振蕩器(德國(guó)艾卡公司)；JM-03D-80超聲波清洗器(潔盟清洗設(shè)備公司)；A11球磨機(jī)(德國(guó)艾卡公司)；Captiva EMR-Lipid凈化柱、QuEChERS凈化柱和萃取鹽包(美國(guó)安捷倫公司)；HLB和MCX固相萃取柱(美國(guó)沃特世公司)；GCB石墨化炭黑(美國(guó)賽默飛公司)；溶劑過(guò)濾器(孔徑 0.22 μm，美國(guó)頗爾公司)。

1.2 主要試劑和標(biāo)準(zhǔn)品

試劑：乙腈、甲醇和甲酸(色譜級(jí)和質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)賽默飛公司)；十二烷基磺酸鈉和鹽酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：克倫特羅(C11668560)，萊克多巴胺(C16805000)，沙丁胺醇(C16903000)，含量均≥98.0% (美國(guó)Dr.E公司)。克倫特羅-D9同位素標(biāo)記物(C11668561)，萊克多巴胺-D6同位素標(biāo)記物(A16805010)，沙丁胺醇-D3同位素標(biāo)記物(XA16903001)，含量均≥98.0%(美國(guó)Dr.E公司)。

1.3 溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

0.01 g/mL十二烷基磺酸鈉溶液：稱取十二烷基磺酸鈉10 g，加水溶解并稀釋至1 000 mL，混勻。0.1 mol/L鹽酸溶液：取鹽酸8.3 mL，加水稀釋至1 000 mL，混勻。5%氨化乙腈溶液：取氨水5 mL，加入乙腈95 mL，混勻。0.1%甲酸溶液：取甲酸1 mL，加水稀釋至1 000 mL，混勻。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取約10 mg標(biāo)準(zhǔn)品(精密稱定)，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃以下保存，有效期12個(gè)月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液：吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸溶液溶解并稀釋至刻度，配成濃度為100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 試樣的制備與保存

1.4.1 樣品采集

選取牛羊皮膚毛發(fā)，毛發(fā)從根部剪斷，保存?zhèn)溆?，單只?dòng)物采集毛發(fā)的量應(yīng)不少于4 g。

1.4.2 樣品制備和保存

取2 g毛發(fā)加入50 mL燒杯中，加入20 mL 0.01 g/mL的十二烷基磺酸鈉溶液[2]，超聲清洗30 min，后用水洗凈毛發(fā)，放在40 ℃的干燥箱中烘干，用球磨機(jī)將其粉碎至粉末，置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 試樣的提取和凈化

1.5.1 提取

取試樣(0.50±0.02)g(精確至0.01 g)置于離心管內(nèi)，樣品中添加適量同位素標(biāo)記物標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 ng/mL)25 μL，取5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液于離心管中，渦旋混勻。于60 ℃水浴中水解4 h，7 000 r/min離心10 min，取上清液加入10 mL 5%氨化乙腈，加萃取鹽包，渦旋混勻5 min，8 000 r/min離心10 min，上清液取5 mL氮?dú)獯抵?.5 mL左右備用。

1.5.2 凈化

將提取后的上清液和0.5 mL超純水加入到Captiva EMR-Lipid凈化柱中，收集濾液后，加入50 mg GCB，用渦旋混合器混勻1 min，然后在4 ℃，9 000 r/min離心10 min，得到的凈化溶液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，得到待測(cè)樣品溶液供儀器測(cè)定分析。

1.6 測(cè)定方法條件

1.6.1 液相色譜參考條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18柱，規(guī)格50 mm×2.1 mm，填料粒徑1.7 μm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min，梯度洗脫。具體程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.6.2 質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧ESI+離子源；檢測(cè)方式：MRM質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)信號(hào)采集；毛細(xì)管電離電壓：3.00 kV；離子源溫度：150 ℃；霧化溫度；450 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：800 L/h。待測(cè)藥物及同位素內(nèi)標(biāo)定性/定量離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量的參考值見表2。

表2 藥物及同位素內(nèi)標(biāo)定性定量離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液、混合內(nèi)標(biāo)工作液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度為0.1、1、5、10、50和100 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液(含內(nèi)標(biāo)溶液均為5.00 ng/mL)，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以待測(cè)分析物特征離子質(zhì)量色譜峰的峰面積與內(nèi)標(biāo)物特征離子質(zhì)量色譜峰的峰面積比值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.8 靈敏度

參照文獻(xiàn)[9-11]中關(guān)于方法學(xué)考察的操作，采用空白基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法的檢出限，S/N≥10的濃度為方法的定量限，在0.5 g空白試樣中添加適量標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，制備得到添加樣品，經(jīng)前處理過(guò)程后上機(jī)檢測(cè)，在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白試樣對(duì)所測(cè)的藥物無(wú)干擾，以評(píng)價(jià)方法的靈敏度。

1.9 準(zhǔn)確度和精密度

參照文獻(xiàn)[9-10]，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，分別準(zhǔn)確稱取空白樣品0.5 g，添加一定體積的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使牛羊毛中β-受體激動(dòng)劑類藥物濃度分別為1、20和100 μg/kg，按上述樣品前處理方法處理后進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加濃度設(shè)6個(gè)平行，重復(fù)測(cè)定3 d，內(nèi)標(biāo)法定量，計(jì)算待測(cè)藥物的回收率和計(jì)算批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.10 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)(樣品組織)對(duì)待測(cè)分析物的檢測(cè)過(guò)程一般都會(huì)有干擾，會(huì)對(duì)待測(cè)分析物的離子化有很大的影響，并在一定程度上影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用基質(zhì)(牛羊毛發(fā))添加標(biāo)準(zhǔn)品方法添加，用目標(biāo)物的相對(duì)響應(yīng)值來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)(ME)，計(jì)算公式：ME=(空白樣品基質(zhì)中添加同等含量目標(biāo)分析物的響應(yīng)值/在純?nèi)軇┲心繕?biāo)分析物的響應(yīng)值)×100%。若ME<100%，則基質(zhì)呈現(xiàn)抑制效應(yīng)；若ME>100%，則基質(zhì)呈現(xiàn)增強(qiáng)效應(yīng)[11]；若ME=100%，則不存在基質(zhì)效應(yīng)。參照“1.5”方法進(jìn)行試樣制備操作，配制1、10、100 μg/L 3個(gè)添加濃度的空白樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液與對(duì)應(yīng)濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)目標(biāo)分析物響應(yīng)值的比較，計(jì)算ME值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表3可以看出，在0.1～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)3種待測(cè)藥物呈現(xiàn)出良好的線性相關(guān)性，且相關(guān)系數(shù)R2均大于0.995。

表3 牛羊毛發(fā)基質(zhì)線性標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法的靈敏度

在對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間內(nèi)，空白試樣中基質(zhì)對(duì)待測(cè)藥物無(wú)明顯干擾，響應(yīng)強(qiáng)，峰型好，母離子和子離子完全匹配。當(dāng)牛羊毛發(fā)中3種藥物添加量為0.2 μg/kg時(shí)，信噪比S/N大于3；添加量為0.5 μg/kg時(shí)，信噪比S/N大于10。3種藥物的檢測(cè)限(LOD)為0.2 μg/kg，定量限(LOQ)為0.5 μg/kg。10 μg/kg的3種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜見圖1。牛毛空白樣品和加標(biāo)樣品(添加量為10 μg/kg)離子色譜見圖2。羊毛空白樣品和加標(biāo)樣品(添加量為10 μg/kg)離子色譜見圖3。

圖1 10 μg/kg的3種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

由表4可見，在3個(gè)添加濃度下，牛毛中3種藥物的批內(nèi)和批間回收率范圍為 80.2%～110.0%；批內(nèi)變異系數(shù)為1.23%～8.00%，批間變異系數(shù)為2.13%～10.10%。羊毛中3種藥物的批內(nèi)和批間回收率范圍為79.3%～105.0%；批內(nèi)變異系數(shù)為2.04%～7.80%，批間變異系數(shù)為3.31%～12.60%。該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，回收率高，精密度符合殘留檢測(cè)的基本要求。

表4 牛羊毛發(fā)基質(zhì)添加回收率和變異系數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

按公式計(jì)算，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的ME平均值分別為 74.8%、65.7%、71.2%，證明牛羊毛發(fā)對(duì)3種β-受體激動(dòng)劑存在基質(zhì)抑制效應(yīng)?；|(zhì)抑制效應(yīng)很強(qiáng)，選則添加內(nèi)標(biāo)物消除基質(zhì)抑制效應(yīng)，有助于提高檢測(cè)的回收率。

3 討論

本研究中牛羊毛發(fā)樣品的處理，使用十二烷基磺酸鈉清洗劑可以在保證毛發(fā)清理徹底的前提下，去除毛發(fā)表面的雜質(zhì)[2]；采用酸水解方式，可以使毛發(fā)中的藥物充分釋放進(jìn)而提高藥物檢測(cè)的準(zhǔn)確性和回收率。使用酸溶液和堿溶液水解對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿溶液水解后，測(cè)得藥物回收率低，經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，堿溶液雖然能夠充分水解毛發(fā)，但極易造成藥物降解損失，需要調(diào)節(jié)pH值[12]。本研究采用鹽酸溶液提取后回收率明顯高，準(zhǔn)確度高。

對(duì)比了Captiva EMR-Lipid凈化柱、QuEChERS凈化柱、HLB和MCX固相萃取柱4種快速高效凈化方式和常規(guī)固相萃取柱方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCX固相萃取柱回收率穩(wěn)定，但同等處理?xiàng)l件下，需要試劑種類多，過(guò)程繁瑣，過(guò)柱時(shí)間長(zhǎng)，回收率明顯偏低；使用Captiva EMR-Lipid凈化柱和QuEChERS凈化柱明顯對(duì)脂質(zhì)類物質(zhì)作用效果明顯，無(wú)需活化和平衡直接過(guò)濾樣品，目標(biāo)藥物的準(zhǔn)確度和靈敏度高，線性關(guān)系好。因此本方法選用Captiva EMR-Lipid作為主要凈化物質(zhì)，該吸附劑技術(shù)可以通過(guò)尺寸排阻和吸附劑化學(xué)兩種機(jī)制有效捕獲脂質(zhì)，較好地去除脂肪、磷脂和蛋白，獲得良好的方法穩(wěn)定性[13]。針對(duì)毛發(fā)多是深色的屬性，加入石墨化炭黑可以較好地清除毛發(fā)顏色，便于觀察，同時(shí)有利于保護(hù)儀器。

待測(cè)分析物的成分影響離子化的效率容易導(dǎo)致質(zhì)譜分析中出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)，因此，對(duì)色譜分離條件進(jìn)行合理的優(yōu)化，使待測(cè)目標(biāo)物和干擾物有效分離，可以在一定程度上有效改善基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響[14]。流動(dòng)相的pH值變化可影響物質(zhì)的保留時(shí)間，而且影響電離程度，本研究發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)梯度時(shí)長(zhǎng)，可改善基質(zhì)效應(yīng)的影響，待測(cè)物分離度好，保留時(shí)間居中，靈敏度高。

色譜柱的選擇也會(huì)對(duì)分離效果產(chǎn)生影響，同樣會(huì)產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應(yīng)，本研究對(duì)比使用BEH C18100 mm的長(zhǎng)色譜柱與50 mm的短色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 mm的長(zhǎng)色譜柱可以有效延長(zhǎng)待測(cè)藥物的保留時(shí)間，峰型尖銳，但實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用短色譜柱也可以收獲足夠穩(wěn)定的回收率和高靈敏度，同時(shí)極大程度上節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，因此選用BEH C1850 mm的短色譜柱。

質(zhì)譜條件的設(shè)置會(huì)影響方法的靈敏度。在儀器條件和方法合理的情況下，選擇合適的離子源，也可以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。本研究選擇ESI離子源模式，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)合分子式結(jié)構(gòu)和電噴霧信號(hào)強(qiáng)度，最終選擇ESI+掃描模式。

關(guān)于牛羊毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑類的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道，僅有部分應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢測(cè)人毛發(fā)中藥物殘留的方法[15-16]。閔佳玲等[3]的方法中，前處理采用常規(guī)的固相萃取柱操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度不夠；Zhang 等[17]的方法中，適用組織和檢測(cè)藥物種類范圍有限，靈敏度低；Font等[18]的方法中，采用堿水解方式易造成藥物損失，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性不高。無(wú)論是尿液、血液還是可食性組織，在動(dòng)物停藥一段時(shí)間后，由于新陳代謝，獸藥殘留量會(huì)低于檢測(cè)方法的檢出限，導(dǎo)致無(wú)法檢出，成為了不法養(yǎng)殖逃避監(jiān)管的漏洞[19]。本研究中的方法與現(xiàn)有的檢測(cè)動(dòng)物產(chǎn)品的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行對(duì)比[20]，前處理過(guò)程操作簡(jiǎn)單、回收率高，靈敏度相當(dāng)，完全滿足檢測(cè)需求，重要的是牛羊毛發(fā)是易于采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、貯存和提取的樣本，采集毛發(fā)樣品是非破壞性的，不會(huì)引起動(dòng)物的任何傷害和疼痛，監(jiān)測(cè)期長(zhǎng)，可有效控制養(yǎng)殖屠宰上市全過(guò)程的藥物殘留狀況，而且本研究中應(yīng)用的Captiva EMR-Lipid吸附技術(shù)可以通過(guò)尺寸排阻和吸附劑化學(xué)兩種機(jī)制有效捕獲脂質(zhì)，較好地去除脂肪、磷脂和蛋白，獲得良好的方法回收率和穩(wěn)定性[21]。

同位素內(nèi)標(biāo)法和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法是基質(zhì)效應(yīng)消除的常見方法，因此本方法研究選擇這兩種方法進(jìn)行對(duì)比。選擇樣品中一定量的純物質(zhì)作為對(duì)照物加入待測(cè)的樣品中，然后對(duì)比待測(cè)物和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物的色譜信號(hào)響應(yīng)值，對(duì)待測(cè)物含量進(jìn)行測(cè)定的方法稱為內(nèi)標(biāo)法[22]。內(nèi)標(biāo)法能夠在很大程度上消除試驗(yàn)條件變化而產(chǎn)生的誤差，確保方法精密度和準(zhǔn)確度[23]。當(dāng)樣品的基質(zhì)復(fù)雜時(shí)，可以采用此方法，但內(nèi)標(biāo)物價(jià)格比較高且不容易獲得，不適合大批量操作，但能收獲高而穩(wěn)定的回收率?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正也可以消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾，通過(guò)比較本研究中內(nèi)標(biāo)法收到了滿意的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究建立了一種以牛羊毛發(fā)為靶組織結(jié)合EMR-Lipid技術(shù)檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑藥物殘留的高效檢測(cè)方法。該方法打破了傳統(tǒng)以動(dòng)物可食用組織作為殘留檢測(cè)靶組織的常規(guī)思路，選取更能穩(wěn)定長(zhǎng)期存在并不需要破壞活體的毛發(fā)作為靶組織，前處理方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需經(jīng)過(guò)液-液萃取，采用強(qiáng)化除雜質(zhì)技術(shù)，回收率穩(wěn)定，靈敏度和準(zhǔn)確度高。本方法對(duì)牛和羊毛發(fā)中興奮劑類藥物的檢測(cè)限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，在0.1～100 ng/mL添加濃度范圍有良好的線性擬合關(guān)系，R2≥0.995。綜上，該方法具有樣品易獲取、靈敏度高、精密度好等特點(diǎn)，為牛羊毛發(fā)中β-受體激動(dòng)劑類藥物的篩查與定量檢測(cè)提供了參考，便于開展日常檢測(cè)和保障監(jiān)測(cè)。