蛋雞脂肪肝出血綜合征對(duì)肝臟及腹脂轉(zhuǎn)錄組的影響研究

易昕睿，馬金虎，王毅，王玉潔，朱枚子，李鑫宇，唐云書，薛敏，黃建珍，朱亞玲，3*

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；3. 安徽醫(yī)科大學(xué)P2級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230032)

脂肪肝出血綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome，F(xiàn)LHS)是由于蛋雞肝臟脂肪代謝紊亂導(dǎo)致脂質(zhì)異常積累而引起的一種營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病，以肝臟腫大、質(zhì)地松脆易碎、表面伴出血點(diǎn)或出血斑、大量腹脂沉積為主要臨床特征[1]。FLHS是籠養(yǎng)蛋雞死亡的主要原因，給蛋雞養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]，然而其發(fā)病機(jī)制尚不清晰。

肝臟是家禽脂代謝的主要場(chǎng)所，幾乎承擔(dān)了90%～95%的脂質(zhì)合成壓力[3-4]。Aziza等[5]闡釋脂肪酸在肝臟內(nèi)合成后與載脂蛋白結(jié)合，運(yùn)輸至血液后經(jīng)脂蛋白脂肪酶水解為脂肪酸，由腹脂組織攝取并儲(chǔ)存。而腹脂沉積過(guò)多則會(huì)反向影響肝臟功能，使得肝臟受損[6-8]。同時(shí)，郭連營(yíng)等[9]發(fā)現(xiàn)蛋雞肝臟受損，也會(huì)導(dǎo)致游離脂肪酸沉積于肝細(xì)胞中，進(jìn)一步誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成FLHS。Wang等[10]表明腹脂組織可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子如瘦素調(diào)控機(jī)體脂代謝的動(dòng)態(tài)平衡；Sun等[11]揭示腹脂組織大量分泌促炎因子如白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝臟代謝疾病的發(fā)生發(fā)展。劉春凌等[12]進(jìn)一步表明降低FLHS患雞血清中IL-6、TNF-α水平可減輕FLHS患病程度。前人研究表明肝臟和腹脂是反映脂質(zhì)代謝過(guò)程的重要組織，而針對(duì)FLHS機(jī)制的探索，前期研究多關(guān)注肝臟或腹脂單個(gè)組織，組織間調(diào)控FLHS病程進(jìn)展的互作性及差異性仍有待闡明。因此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)靶向研究肝臟和腹脂，進(jìn)一步揭示高能低蛋白日糧通過(guò)肝臟和腹脂誘發(fā)蛋雞FLHS的分子機(jī)制，為預(yù)防和治療FLHS提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料

選取30只150日齡健康依薩褐蛋雞(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室種蛋孵化)，平均體重約1.5 kg，隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組各15只。對(duì)照組給予普通飼料，試驗(yàn)組飼喂高能低蛋白日糧(表1)，自由采食和飲水，光照14～16 h/d。60 d后，采用苯巴比妥心臟麻醉，頸動(dòng)脈放血處死，保存血清測(cè)量甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)；分別取2組蛋雞同一部位新鮮肝臟稱量肝濕重，以肝濕重/體重計(jì)算肝指數(shù)，取腹部脂肪組織置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 日糧成分及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 組織病理學(xué)觀察

每只蛋雞分別取黃豆粒大小肝臟和腹脂組織固定于4%甲醛溶液中24 h，然后進(jìn)行常規(guī)脫水包埋[13]。切片厚5 μm，隨后利用蘇木精-伊紅(HE)染色，使用蔡司正置光學(xué)顯微鏡分別觀察比較肝臟和腹脂組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。切片制作及HE染色過(guò)程由武漢塞維爾生物科技有限公司完成。采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測(cè)量并統(tǒng)計(jì)每組腹脂組織切片中100個(gè)脂滴直徑。

1.3 RNA建庫(kù)測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

利用TRIzol試劑盒(Invitrogen，USA)從肝臟和腹脂中分別提取RNA，隨后將成功提取的RNA樣本送至諾禾致源公司進(jìn)行建庫(kù)，并采用HiSeq 4000(Illumina)平臺(tái)測(cè)序。獲得原始數(shù)據(jù)后，進(jìn)行基本的數(shù)據(jù)處理：去除接頭、N堿基比例超過(guò)10%及低質(zhì)量測(cè)序序列(reads)(Qphred ≤ 20 的堿基數(shù)占整個(gè)reads長(zhǎng)度的50%以上的序列)，過(guò)濾后得到高質(zhì)量測(cè)序序列(clean reads)。其次使用FastQC軟件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對(duì)clean reads進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。然后使用STAR-2.5.3a(https://github.com/alexdobin/STAR)軟件將clean reads比對(duì)到雞Gallus_gallus-5.0版本(Ensembl)基因組上[14]。使用StringTie(http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)軟件分兩步對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝：第一步為序列初組裝，第二步為轉(zhuǎn)錄本合并組裝。最后使用featureCounts軟件(http://subread.sourceforge.net/)對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量[15]。

1.4 差異表達(dá)分析

利用DESeq2 R包軟件(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)對(duì)定量后的基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，轉(zhuǎn)化為每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段(FPKM)。隨后繼續(xù)根據(jù)基因表達(dá)量的差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)利用DESeq2進(jìn)行差異分析[16]，設(shè)定篩選差異表達(dá)基因(DEGs)閾值為|log2FC|≥ 1，P<0.05。

1.5 DEGs注釋和富集分析

利用PANTHER(http://www.pantherdb.org/)和DAVID(https://david. ncifcrf. gov/summary.jsp#)對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體(GO)功能注釋、京都基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，利用基因集富集分析(GSEA)軟件對(duì)DEGs進(jìn)行分析。

1.6 RT-PCR驗(yàn)證

利用Molony小鼠白血病病毒轉(zhuǎn)錄酶(Promega，USA)和Oligo(dT)(TaKaRa，Japan)將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，使用LightCycler 480儀器和LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(Roche，USA)進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。隨后根據(jù)2-ΔΔCt算法計(jì)算靶基因相對(duì)管家基因β-actin的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟解剖學(xué)、組織病理學(xué)和血清變化

利用正常和高能低蛋白日糧分別喂養(yǎng)對(duì)照組和試驗(yàn)組蛋雞。結(jié)果顯示，對(duì)照組肝臟未見異常變化，呈正常棕紅色，表面光滑、質(zhì)地緊密、大小正常，肝臟下有不明顯脂肪墊(圖1A)；而試驗(yàn)組肝臟呈土黃色，表面油潤(rùn)腫大，邊緣厚鈍，質(zhì)地松脆易碎，肝臟下可見厚脂肪墊且肝臟表面有針尖狀大小出血點(diǎn)(圖1B)。HE染色顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組蛋雞肝臟組織有較多脂質(zhì)空泡(圖1D)，腹脂細(xì)胞腫脹明顯(圖1F)且腹脂細(xì)胞脂滴直徑明顯高于對(duì)照組(圖1G)。同時(shí)，試驗(yàn)組肝指數(shù)、血清TG和TC的濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.01，表2)。該結(jié)果表明高能低蛋白日糧可成功誘發(fā)蛋雞FLHS。

A.對(duì)照組肝臟大體觀；B. 試驗(yàn)組肝臟大體觀，箭頭指示出血點(diǎn)和肝下厚脂肪墊；C. 對(duì)照組肝臟組織HE染色；D. 試驗(yàn)組肝臟組織HE染色，箭頭指示脂質(zhì)空泡；E. 對(duì)照組腹脂組織HE染色；F. 試驗(yàn)組腹脂組織HE染色；G. 對(duì)照組與試驗(yàn)組的腹脂細(xì)胞脂滴直徑比較(**表示P<0.01)。

表2 FLHS對(duì)蛋雞肝指數(shù)、血清TG和TC濃度的影響

2.2 蛋雞肝臟和腹脂RNA-Seq數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量控制

RNA-Seq序列進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾后，從肝臟和腹脂樣本中分別平均得到4 620萬(wàn)個(gè)和4 010萬(wàn)個(gè) clean reads，利用STAR-2.5.3a(https://github.com/alexdobin/STAR)軟件將clean reads比對(duì)到雞Gallus_gallus-5.0基因組，分別鑒別到4 260萬(wàn)個(gè)和3 620萬(wàn)個(gè)唯一匹配reads，唯一匹配率高達(dá)92.4%和90.2%，表明該數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可用于進(jìn)一步分析。

2.3 RNA-Seq挖掘FLHS蛋雞肝臟和腹脂的關(guān)鍵DEGs

進(jìn)一步利用RNA-Seq分析在肝臟和腹脂中分別鑒定出443個(gè)和526個(gè)DEGs(|log2FC|≥1，P<0.05)。其中，在試驗(yàn)組蛋雞肝臟中，DEGs有151個(gè)表達(dá)上調(diào)，292個(gè)表達(dá)下調(diào)(圖2A)；而在腹脂中，DEGs有409個(gè)表達(dá)上調(diào)，117個(gè)表達(dá)下調(diào)(圖2B)。ENSGALG00000048882等為肝臟相關(guān)的差異顯著性前20的DEGs(圖2C)，IL-6等為腹脂相關(guān)的差異顯著性前20的DEGs(圖2D)。

肝臟前10個(gè)極顯著上調(diào)基因(表3)與氨基酸的代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)、膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，表明高能低蛋白日糧可能通過(guò)影響肝臟中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)FLHS發(fā)生發(fā)展；而腹脂前10個(gè)極顯著上調(diào)基因(表4)則與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及B細(xì)胞的成熟等過(guò)程密切相關(guān)，揭示了患雞腹脂組織可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)影響FLHS發(fā)生發(fā)展。

A. 對(duì)照組(n=151)和試驗(yàn)組(n=292)肝臟DEGs火山圖；B. 對(duì)照組(n=295)和試驗(yàn)組(n=203)腹脂DEGs火山圖(|log2FC| ≥1，P<0.05)；C.前20個(gè)肝臟極顯著DEGs熱圖；D.前20個(gè)腹脂極顯著DEGs熱圖(|log2FC| ≥ 1，P<0.05)。黃色和綠色點(diǎn)分別表示上調(diào)基因和下調(diào)基因。

表3 FLHS蛋雞肝臟組織RNA-Seq中前10個(gè)極顯著DEGs

表4 FLHS蛋雞腹脂組織RNA-Seq中前10個(gè)極顯著DEGs

2.4 FLHS蛋雞肝臟及腹脂DEGs的富集分析

為進(jìn)一步探究肝臟及腹脂DEGs影響的生物學(xué)功能，對(duì)2個(gè)組織DEGs進(jìn)行GO功能注釋。結(jié)果顯示肝臟DEGs顯著富集于代謝過(guò)程(GO：0008152)，腹脂DEGs顯著富集于免疫系統(tǒng)過(guò)程(GO：0002376)。該結(jié)果提示試驗(yàn)組蛋雞肝臟DEGs可能通過(guò)影響代謝過(guò)程，腹脂組織DEGs可能通過(guò)影響免疫系統(tǒng)過(guò)程，共同參與蛋雞FLHS的發(fā)生發(fā)展(圖3)。

圖3 肝臟(A)和腹脂(B)中DEGs的GO功能注釋結(jié)果

此外，DEGs的KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，肝臟中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK1)、載脂蛋白a-1(APOA1)等基因顯著富集于PPAR信號(hào)通路(圖4A、4C)；而腹脂中IL-6、細(xì)胞因子信號(hào)通路抑制因子3(SOCS3)等基因顯著富集于JAK-STAT信號(hào)通路(圖4B、4D)。該結(jié)果提示，肝臟PCK1、APOA1等DEGs與腹脂IL-6、SOCS3等DEGs可能分別通過(guò)PPAR信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路影響蛋雞FLHS的發(fā)生發(fā)展。為進(jìn)一步確定蛋雞FLHS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵通路，本研究對(duì)肝臟和腹脂組織DEGs進(jìn)行了GSEA富集分析。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組蛋雞肝臟中PPAR信號(hào)通路活性和腹脂中JAK-STAT信號(hào)通路活性均顯著上調(diào)(圖5E、5F)。該結(jié)果與KEGG富集分析結(jié)果一致，進(jìn)一步提示試驗(yàn)組蛋雞肝臟和腹脂組織分別上調(diào)PPAR信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路活性共同參與FLHS的發(fā)生發(fā)展。

A. 肝臟DEGs顯著富集的信號(hào)通路；B.腹脂DEGs顯著富集的信號(hào)通路；C. 肝臟DEGs極顯著富集的信號(hào)通路及其相關(guān)基因；D.腹脂DEGs極顯著富集的信號(hào)通路及其相關(guān)基因；E. GSEA富集分析提示試驗(yàn)組蛋雞肝臟中PPAR信號(hào)通路的活性改變；F. GSEA富集分析提示試驗(yàn)組蛋雞腹脂中JAK-STAT信號(hào)通路的活性改變。

A. PCK1、APOA1基因在肝臟樣本RNA-Seq數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)水平；B. IL-6、SOCS3基因在腹脂樣本RNA-Seq數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)水平；C. 肝臟PCK1 mRNA表達(dá)水平；D. 肝臟APOA1 mRNA表達(dá)水平；E. 腹脂IL-6 mRNA表達(dá)水平；F. 腹脂SOCS3 mRNA表達(dá)水平。*表示P<0.05，**表示P<0.01，n=3。

2.5 關(guān)鍵基因差異表達(dá)水平的驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)分析的DEGs及富集分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取肝臟中脂質(zhì)代謝關(guān)鍵DEGs(PCK1、APOA1)和腹脂中炎癥反應(yīng)關(guān)鍵DEGs(IL-6、SOCS3)利用RNA-Seq數(shù)據(jù)和RT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。患雞肝臟PCK1、APOA1基因表達(dá)水平和腹脂IL-6、SOCS3基因表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(圖5A、5B)；RT-PCR結(jié)果也與RNA-Seq結(jié)果保持高度一致(圖5C、5D、5E和5F)。上述數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)前期結(jié)果的可靠性。

3 討論

FLHS是由多重因素相互作用導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病，好發(fā)于產(chǎn)蛋高峰期的籠養(yǎng)蛋雞，嚴(yán)重?fù)p害了蛋雞的生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失[2，17]。FLHS主要表現(xiàn)為肝臟脂肪變性，家禽體內(nèi)90%～95%的脂類來(lái)源于肝臟脂肪酸的從頭合成[18]，在機(jī)體中，少量的腹脂能夠保護(hù)肝臟，但過(guò)多的腹脂堆積則會(huì)反向影響肝臟功能[19]，從而誘發(fā)FLHS。因此，肝臟和腹脂是反映脂質(zhì)代謝的重要組織。前期針對(duì)FLHS的研究忽略了肝臟和腹脂重要的相互作用，往往造成其應(yīng)用及治療效果不佳。本研究針對(duì)肝臟和腹脂組織，在轉(zhuǎn)錄水平上系統(tǒng)性揭示了2種組織參與高能低蛋白日糧所致蛋雞FLHS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因及其潛在分子機(jī)制。

基于肝臟RNA-Seq數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)FLHS患病蛋雞肝臟中PCK1、APOA1等基因出現(xiàn)明顯組織特異性表達(dá)上調(diào)。PCK1基因所編碼的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶是糖異生的限速酶[20]，前人研究在高脂日糧喂養(yǎng)的肥胖小鼠中，PCK1水平顯著提高，與脂質(zhì)合成與代謝密切相關(guān)[21]；APOA1是高密度脂蛋白中主要的載脂蛋白，逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)外周組織膽固醇含量，同時(shí)可以激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的運(yùn)出、酯化和轉(zhuǎn)移[22]；同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，PCK1、APOA1等基因明顯富集于PPAR信號(hào)通路，該通路被廣泛認(rèn)為調(diào)控脂質(zhì)代謝，通過(guò)干預(yù)脂肪酸穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，參與脂肪性肝病的發(fā)生[23]。該結(jié)果提示高能低蛋白日糧可能通過(guò)影響載脂蛋白合成、糖異生等途徑來(lái)影響蛋雞肝臟脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，造成TG過(guò)度蓄積進(jìn)而造成肝臟脂肪變性；因載脂蛋白合成被影響，導(dǎo)致肝外游離脂肪酸增多，易被腹脂攝取造成腹脂沉積。在腹脂組織中，本研究鑒定出關(guān)鍵組織特異性DEGs，IL-6、SOCS3等。IL-6，由脂肪細(xì)胞分泌的重要炎性因子，其表達(dá)水平在一定程度上與脂肪組織炎癥反應(yīng)正相關(guān)[24]，同時(shí)高表達(dá)的IL-6可以協(xié)同STAT3促進(jìn)肝臟脂質(zhì)合成[25]；而SOCS3已被證明是IL-6/JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與炎癥性疾病密切相關(guān)[26]；同時(shí)，IL-6、SOCS3高度富集的信號(hào)通路JAK-STAT信號(hào)通路已被廣泛報(bào)道參與炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程，其活性失調(diào)可加重肝臟脂質(zhì)代謝紊亂[27-28]。有意思的是，PPAR與JAK-STAT信號(hào)通路均可參與脂質(zhì)代謝相關(guān)過(guò)程，提示高能低蛋白日糧同時(shí)作用肝臟及腹脂，分別通過(guò)PPAR及JAK-STAT信號(hào)通路導(dǎo)致肝臟及腹脂代謝紊亂，加重脂質(zhì)蓄積造成肝細(xì)胞損傷。此外，PPAR與JAK-STAT信號(hào)通路的失調(diào)不僅影響肝臟脂質(zhì)代謝過(guò)程，也可誘發(fā)腹脂組織分泌炎性因子，反向引起肝細(xì)胞氧化應(yīng)激從而對(duì)肝細(xì)胞造成更大損傷，進(jìn)一步表明脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)在FLHS病程中發(fā)揮重要作用。

綜上，上述結(jié)果揭示高能低蛋白日糧所致FLHS蛋雞轉(zhuǎn)錄譜特征與正常蛋雞間存在顯著差異，患雞肝臟可通過(guò)特異性高表達(dá)APOA1、PCK1等基因上調(diào)PPAR信號(hào)通路活性，加重肝臟脂質(zhì)沉積；腹脂可通過(guò)特異性高表達(dá)IL-6、SOCS3等基因，上調(diào)JAK-STAT信號(hào)通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。肝臟和腹脂協(xié)同促進(jìn)高能低蛋白日糧所致蛋雞FLHS的發(fā)生發(fā)展。因此，APOA1、PCK1、IL-6、SOCS3等基因可能是蛋雞FLHS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶基因，PPAR及JAK-STAT信號(hào)通路作為調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路，提供靶向肝臟和腹脂聯(lián)合用藥的新思路，為優(yōu)化FLHS的預(yù)防和治療提供更為有效精準(zhǔn)的新方法。