飼糧添加蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能的影響

馬龍飛，周斌斌，劉春雨，陳順，王恬，王超

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

仔豬早期斷奶易產(chǎn)生斷奶應(yīng)激[1]，常見采食量降低，腸道黏膜及屏障功能受損[2]等。研究發(fā)現(xiàn)斷奶可導(dǎo)致小腸絨毛萎縮、隱窩深度增加，從而抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和利用[3]。此外，仔豬斷奶可引起促炎因子表達(dá)量增加，機(jī)體免疫力下降，影響腸道緊密連接功能，導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加，影響機(jī)體健康[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)斷奶可導(dǎo)致腸道活性氧(ROS)增加，引起氧化應(yīng)激，這可能是潛在的調(diào)控仔豬早期斷奶應(yīng)激的重要靶點(diǎn)，已受到廣泛關(guān)注[6]。

蘆丁是廣泛存在于植物中的類黃酮物質(zhì)，又名蕓香苷[7]，是由黃酮苷元槲皮素和二糖蕓香糖組成的糖苷，具有抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種生物學(xué)功能，有調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道功能的潛力[8]。研究表明，飼糧中添加500 mg/kg蘆丁可改善肉雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障功能[9]，提高分泌性免疫球蛋白A(sIgA)含量，降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平和相應(yīng)炎性因子基因表達(dá)量，增強(qiáng)腸道免疫，發(fā)揮抗炎作用[10]。Gautam 等[11]通發(fā)現(xiàn)蘆丁可通過(guò)提高抗氧化酶的活性，清除自由基，保護(hù)大鼠腸道免受氧化應(yīng)激的影響，增強(qiáng)腸道抗氧化能力。腸道功能的提高對(duì)斷奶仔豬抗腹瀉能力和改善飼料轉(zhuǎn)化率方面起重要作用，但蘆丁對(duì)斷奶仔豬腸道功能的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)系統(tǒng)研究飼糧添加蘆丁對(duì)斷奶仔豬腸道免疫、抗氧化和屏障功能的影響，以期為生產(chǎn)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

選擇16頭28 d斷奶，體重在(8.98±0.30)kg“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交公豬，隨機(jī)分為2組(每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬)，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)(蘆丁)組在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg蘆丁，試驗(yàn)期14 d。基礎(chǔ)飼糧參照美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)(NRC，2012)頒布的營(yíng)養(yǎng)需求標(biāo)準(zhǔn)，相應(yīng)成分和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 飼養(yǎng)管理

仔豬飼養(yǎng)于帶有漏縫地板的不銹鋼圍欄中，溫度為26～30 ℃，濕度為50%～60%，自由采食和飲水。定期檢查豬舍環(huán)境和仔豬身體健康狀況，按常規(guī)程序免疫。

1.3 樣品采集與處理

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)仔豬禁食12 h，電擊屠宰取樣。選取仔豬的回腸(約2.0 cm)于4%多聚甲醛溶液固定并制備切片。載玻片刮取回腸黏膜樣品于凍存管，置液氮冷凍后于-80 ℃低溫冰柜儲(chǔ)存待測(cè)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 腸組織形態(tài)觀察

將回腸組織于4%多聚甲醛中固定48 h后，通過(guò)酒精、二甲苯處理，石蠟包埋、切片，再用伊紅和蘇木精染色后置于顯微鏡(尼康H5500L，東京，日本)下觀察。用Image Pro Plus軟件測(cè)量腸絨毛高度、絨毛寬度和隱窩深度，計(jì)算絨毛面積、絨毛高度和隱窩深度比值。

1.4.2 抗氧化酶活相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

取回腸黏膜樣品(約100 mg)與生理鹽水按1∶9的比例勻漿，在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，取上清液采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定丙二醛(MDA)含量，總抗氧化能力(T-AOC)，以及總超氧化物歧化酶(T-SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所，測(cè)定步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。使用BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海，中國(guó))測(cè)定樣品蛋白濃度，指標(biāo)按每mg或每g蛋白計(jì)算。

1.4.3 抗氧化、屏障功能、炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

取腸道黏膜組織樣品(約0.1 g)，使用TRIzol試劑(TaKaRa，大連，中國(guó))提取總RNA，然后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國(guó))將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過(guò)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，具體操作根據(jù)先前研究進(jìn)行[12-13]。引物序列見表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4.4 回腸黏膜緊密連接蛋白相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)方法[14]測(cè)定回腸黏膜緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)量。試驗(yàn)取腸黏膜樣品裂解勻漿，將等量變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，經(jīng)室溫封閉，4 ℃下一抗孵育過(guò)夜，室溫二抗孵育 1.5 h后，置超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國(guó))反應(yīng)，再用ChemiDoc MP成像系統(tǒng)(BIO-RAD，Hercules，CA，USA)觀察并使用 ImageJ軟件(Media Cybernetics Inc.，Bethesda，MD，USA)分析蛋白密度。抗體Occludin(1∶5 000)、Claudin-1(1∶4 000)和β-actin(1∶1 000)由Proteintech Group公司提供。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析對(duì)照組和蘆丁組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有差異趨勢(shì)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸組織形態(tài)的影響

如圖1及表3所示，與對(duì)照組相比，飼糧添加500 mg/kg蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸的絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、絨毛面積和絨毛高度/隱窩深度均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

A.對(duì)照組；B.蘆丁組。

表3 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸組織形態(tài)的影響(n=6)

2.2 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化指標(biāo)的影響

如表4所示，飼糧添加500 mg/kg蘆丁顯著提高了斷奶仔豬回腸黏膜中CAT活性(P<0.05)，并有降低MDA含量的趨勢(shì)(P=0.06)，但對(duì)T-AOC、GSH和T-SOD活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化指標(biāo)的影響(n=8)

2.3 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜增殖與凋亡基因表達(dá)的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，飼糧添加500 mg/kg蘆丁顯著提高了回腸黏膜中Bcl-2 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，但對(duì)P53、CAS3、CAS9和Bax mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

同一指標(biāo)組間相比，*表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.4 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白基因和蛋白表達(dá)的影響

如圖3和圖4所示，與對(duì)照組相比，飼糧添加500 mg/kg蘆丁顯著提高了回腸黏膜中ZO-1和Occludin mRNA表達(dá)量以及Occludin的蛋白表達(dá)量(P<0.05)，但對(duì)Claudin-1 mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

圖3 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響(n=8)

圖4 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)的影響(n=4)

2.5 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，飼糧添加500 mg/kg蘆丁顯著降低了斷奶仔豬回腸黏膜TNF-α 和IL-6 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，但對(duì)NF-κB、IFN-γ、IL-1β、IL-4和IL-10 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

圖5 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=8)

2.6 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，飼糧添加500 mg/kg 蘆丁顯著提高了回腸黏膜SOD1和SOD2 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，但對(duì)Nrf2、Keap1、GCLC、GCLM、HO-1和GSH-Px mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

圖6 蘆丁對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=8)

3 討論

腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收中發(fā)揮重要作用，仔豬早期斷奶可導(dǎo)致腸道絨毛高度下降、腸道結(jié)構(gòu)完整性受損等，影響腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[15]。在飼糧中添加生物活性物質(zhì)是一種潛在的有效調(diào)控仔豬腸道健康、緩解早期斷奶應(yīng)激的方式。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加番石榴葉提取物可提高斷奶仔豬空腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度，改善腸道損傷[16]；Chen等[17]通過(guò)對(duì)斷奶仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)研究還發(fā)現(xiàn)飼糧添加白藜蘆醇可降低其隱窩深度并提高絨毛高度，維護(hù)腸道健康。但本研究結(jié)果表明，添加500 mg/kg蘆丁對(duì)仔豬回腸絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、絨毛面積等未產(chǎn)生顯著影響，提示飼糧添加蘆丁未能顯著改善回腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)。而500 mg/kg蘆丁顯著增加了斷奶仔豬回腸黏膜中Bcl-2 mRNA的表達(dá)量。Bcl-2有抗凋亡效果，是改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要蛋白之一[18]。本試驗(yàn)中回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)顯著變化的原因可能是蘆丁作用時(shí)間(試驗(yàn)期僅14 d)或劑量不足，后期有待進(jìn)一步探討其適宜添加劑量與時(shí)間。

腸屏障可阻止病原體透過(guò)腸黏膜組織進(jìn)入機(jī)體，有效保證機(jī)體健康。細(xì)胞間的緊密連接是腸屏障功能發(fā)揮的決定因素之一[19]。ZO-1是一種緊密連接蛋白，Occludin則是一種跨膜蛋白，其蛋白表達(dá)水平降低或蛋白結(jié)構(gòu)被破壞后，黏膜通透性增加，腸屏障功能下降，腹瀉率增加[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蘆丁可顯著提高ZO-1和Occludin mRNA表達(dá)量，并顯著提高了Occludin 蛋白表達(dá)量，提示蘆丁具有改善仔豬腸屏障的作用，進(jìn)而減少仔豬腹瀉。本試驗(yàn)結(jié)果與Wang等[21]的結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)飼糧添加藤黃酚補(bǔ)充劑可顯著提高腸道黏膜ZO-1和Occludin mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量，改善斷奶仔豬腸屏障功能，降低仔豬腹瀉。此外，添加大豆異黃酮也可增加ZO-1和Occludin mRNA表達(dá)量，緩解LPS引起的仔豬腸道屏障功能受損，緩解LPS誘導(dǎo)的仔豬腹瀉[22]。

腸道中TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子過(guò)量表達(dá)可引起腸道炎癥、損傷，嚴(yán)重影響畜禽健康與生長(zhǎng)[23-25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明飼糧添加500 mg/kg蘆丁可顯著降低斷奶仔豬腸道TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平，提示蘆丁具有緩解斷奶仔豬腸道炎癥的潛力。與本試驗(yàn)結(jié)果相似，Qiu等[26]也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可降低TNF-α和IL-6等促炎因子的基因表達(dá)量，緩解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇引起的仔豬腸道炎癥。此外，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-6的表達(dá)水平過(guò)高可導(dǎo)致腸道通透性增加、屏障功能受損[26]。本試驗(yàn)中飼糧添加蘆丁顯著降低腸黏膜中TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)的結(jié)果，與蘆丁可顯著增強(qiáng)仔豬黏膜屏障功能的結(jié)果一致。

仔豬早期斷奶會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體ROS大量產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起組織氧化損傷，甚至影響整個(gè)機(jī)體的功能[27]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可破壞腸道黏膜，引起腸道損傷，導(dǎo)致腸道屏障功能障礙，而提高腸道抗氧化可有效增強(qiáng)腸道屏障功能[28-29]，因此緩解氧化應(yīng)激可能是改善仔豬斷奶應(yīng)激的重要靶點(diǎn)。CAT是機(jī)體主要的抗氧化酶之一，MDA是評(píng)價(jià)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的重要指標(biāo)[30-31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明蘆丁顯著提高了回腸黏膜上CAT活性，并有降低MDA含量的趨勢(shì)，提示蘆丁具有提高腸道抗氧化能力，緩解斷奶仔豬氧化應(yīng)激的效果。 SOD1和SOD2在消除過(guò)量ROS的防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[32]。Zhang等[33]研究發(fā)現(xiàn)提高仔豬腸黏膜SOD mRNA水平可有效緩解腸道氧化應(yīng)激。與其結(jié)果相似，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼糧添加蘆丁顯著提高了回腸黏膜SOD1與SOD2 mRNA水平，這與蘆丁有降低MDA含量趨勢(shì)的結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激同樣與細(xì)胞凋亡水平關(guān)系密切，體內(nèi)大量產(chǎn)生的超氧陰離子、羥自由基等氧自由基可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[34]。而SOD可通過(guò)去除超氧陰離子抑制細(xì)胞凋亡[35]。與其結(jié)果相似，本試驗(yàn)中蘆丁在增強(qiáng)腸道抗氧化能力、緩解仔豬氧化應(yīng)激的同時(shí)顯著增加了抗凋亡基因(Bcl-2 mRNA)的表達(dá)水平。但飼糧添加蘆丁對(duì)仔豬回腸黏膜中Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平未產(chǎn)生顯著影響，提示飼糧添加蘆丁可能通過(guò)其他信號(hào)通路增強(qiáng)仔豬回腸抗氧化功能，但具體信號(hào)通路仍需要進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

飼糧添加500 mg/kg蘆丁可降低炎癥反應(yīng)(TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平下降)，改善斷奶仔豬腸道屏障(緊密連接蛋白與基因水平表達(dá)增強(qiáng))，這可能與抗氧化能力增加密切相關(guān)。此外，斷奶仔豬飼糧添加500 mg/kg蘆丁雖然顯著增加了回腸黏膜中Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平，但未對(duì)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯效果。