大豆卵磷脂對湖羊精液4 ℃保存效果的影響

江才雨，康言，王旭洋，李擁軍

(揚州大學動物科學與技術學院/江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

人工授精技術可以提高優(yōu)良公畜種質資源的利用率，防止精液的浪費，提高繁殖效率[1]。精液保存則是人工授精技術中的重要環(huán)節(jié)，精液保存方法分為液態(tài)保存與冷凍保存。冷凍保存技術可使優(yōu)質公畜的精液得到長期保存，但與豬和牛相比，綿羊精液解凍后的精子活力、活率分別下降到30%和40%[2]。這是由于綿羊精液對超低溫耐受能力更差，對溫度變化更加敏感。相對于精液冷凍保存技術，液態(tài)(4 ℃)保存方法在溫度上對精液造成的損害較小，可逐漸減弱精子代謝機能和活動力，從而延長精子存活時間[3]。因此，采用4 ℃保存方法進行人工授精是一種較為直接、有效的方法。

為確保在低溫環(huán)境下精子能夠存活更久，在稀釋液中添加抗凍保護劑可以延長精子的存活時間并維持其較好的受精能力[3]。大豆卵磷脂(SL)是磷脂酰膽堿(PC)和幾種脂肪酸的天然混合物，可以替代卵黃中的高密度脂蛋白和磷脂，還可以預防或改善精液在冷藏和冷凍保存過程中精子質膜的損害[4]。有研究表明，在常規(guī)精液稀釋液中添加SL能夠在4 ℃有效提高豬精子的活力、有效存活時間、總存活時間和質膜完整性，其中0.6 g/L SL的添加效果最優(yōu)[5]。然而，目前有關SL在湖羊精液4 ℃保存的研究鮮見報道。因此，本文通過研究在湖羊精液基礎稀釋液中添加不同濃度的SL，檢測精子活率、活力、質膜完整率和頂體完整率等指標，分析SL對湖羊精液4 ℃保存效果的影響，以期篩選出適宜濃度的SL，為今后湖羊精液低溫保存技術在實際生產中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所選用的3只健康成年湖羊來源于揚州大學實驗羊場，年齡為2～3歲，體格健壯，無任何疾病且繁殖性能優(yōu)良。每日飼喂2次精飼料和草料。圈養(yǎng)，自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

檸檬酸鈉(純度≥99.5%，貨號為S11111)，青霉素鈉(貨號為S17030)和鏈霉素硫酸鹽(貨號為S17085)，均購自上海源葉生物科技公司；SL(純度≥60%，貨號為A510030-0100)，考馬斯亮藍G-250(貨號為C8420)，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；4%多聚甲醛(貨號為E672002)，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；85%磷酸(貨號為10015418)，95%酒精(貨號為10009218)，均購自國藥集團化學試劑有限公司；邁郎精子全自動分析系統(tǒng)(CASA)(型號為ML-608JZII)，購自南寧松景天倫生物科技有限公司。

1.3 稀釋液配制

使用電子天平準確稱量果糖0.5 g，檸檬酸鈉2.4 g，青霉素鈉0.031 2 g和鏈霉素硫酸鹽 0.069 4 g，充分溶于100 mL超純水，用0.22 μm過濾器過濾除菌，配制成基礎稀釋液。在基礎稀釋液中添加不同濃度(0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)的SL，然后放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，于采精? h放入恒溫水浴鍋中預熱。

1.4 精液采集與稀釋

采用假陰道法采集公羊精液，將精液置于37 ℃保溫杯中，并在30 min內帶回實驗室進行精液質量檢查，要求氣味略帶腥味，顏色為乳白色，密度適中，且精子活率達到80%以上則可用于試驗。將檢測合格的精液混合并與不同濃度SL的稀釋液按1∶9的比例進行等溫稀釋，用多層脫脂棉包裹置于4 ℃冰箱。在精液保存期間每隔24 h檢測精子活率、活力、運動性能、質膜完整率和頂體完整率等指標。

1.5 精液品質檢測

1.5.1 精子活率、活力及運動性能測定

精液置37 ℃水浴鍋中孵育3 min，緩慢混勻，抽取1.8 μL精液滴在精子計數(shù)板上，采用CASA隨機采集5個視野，對精子活力、活率、直線速率、曲線速率和路徑速率等運動參數(shù)進行檢測。

1.5.2 質膜完整性檢測

低滲腫脹試驗(HOST試驗)用于評估精子膜的質膜完整性。當精子在低滲環(huán)境中，水分子會通過精子質膜進入膜內而導致精子尾部體積變大而膨脹彎曲，這是精子質膜完整的標志[6]。低滲溶液的配制：稱取0.49 g檸檬酸鈉，0.9 g果糖，用100 mL滅菌超純水充分溶解。檢測時，取10 μL精液與100 μL低滲透溶液在離心管中均勻混合，放置37 ℃水浴鍋中孵育30 min后，取1 μL處理過的精液滴于計數(shù)板上，在油鏡下用Smart數(shù)字成像系統(tǒng)進行觀察，采集10個不同視野下的圖像，每個視野至少計數(shù)200個精子，計算彎尾精子百分率，即質膜完整率。

1.5.3 頂體完整性檢測

使用考馬斯亮藍G250染色法評估精子頂體完整性。取50 μL精液置離心管中，加入1 mL 4%多聚甲醛固定液吹打混勻，固定10 min，在離心機中2 000 r/min離心5 min，棄上清液，緩慢吹打剩余沉淀，取10 μL處理過的精液滴加到載玻片上制成抹片，晾干，用考馬斯亮藍染液染色30 min，水洗，風干。在油鏡下用Smart數(shù)字成像系統(tǒng)進行觀察，采集15個不同視野下的圖像，每個視野至少計數(shù)200個精子，統(tǒng)計頂體完整率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2021軟件整理試驗數(shù)據(jù)，然后運用SPSS 26.0軟件對所得試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。結果均以“平均值±標準差”表示。每組數(shù)據(jù)設3次重復，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 低溫保存下不同濃度SL對湖羊精子活率和活力的影響

由表1和表2可知，精子活率、活力隨著精液保存時間的延長均呈緩慢下降的趨勢。與其他SL處理組相比，0.1% SL組的下降趨勢最為緩慢。保存1 d，0.1%、0.2% SL組的精子活率、活力均顯著高于其他組(P<0.05)；保存2、5、6 d，0.1% SL組的精子活率、活力均顯著高于其他4組(P<0.05)；保存4 d，0.1%、0.2%和0.3% SL組的精子活率和活力均顯著高于其他2組(P<0.05)。

表1 不同濃度SL對低溫保存湖羊精子活率的影響 %

表2 不同濃度SL對低溫保存湖羊精子活力的影響 %

2.2 低溫保存下不同濃度SL對湖羊精子運動性能的影響

由表3可知，在4 ℃時，隨著保存時間的延長，精子的直線速率、曲線速率和路徑速率均呈逐漸下降趨勢，其中0.1% SL組下降較為平緩。保存1、2 d，0.1%、0.2% SL組以及對照組的精子直線速率顯著高于其他2組(P<0.05)；保存3 d，0.1% SL組的精子直線速率顯著高于其他組(P<0.05)；保存4 d，0.4% SL組的精子直線速率顯著低于其他4組(P<0.05)；保存5 d，0.4% SL組與對照組的精子直線速率顯著低于其他3組(P<0.05)。保存1 d，0.3%、0.4% SL組的精子曲線速率顯著低于其他組(P<0.05)，0.4% SL組最低；保存4 d，SL各組的精子曲線速率和路徑速率顯著高于對照組(P<0.05)；保存5、6 d，對照組的精子曲線速率和路徑速率顯著低于其他組(P<0.05)。

表3 不同濃度SL對低溫保存湖羊精子運動性能的影響 μm/s

2.3 低溫保存下不同濃度SL對湖羊精子質膜完整率的影響

由圖1和表4可知，隨著精液低溫保存時間的延長，每組精子質膜完整率呈不斷下降的趨勢，其中采用0.1% SL保存的精子質膜完整率下降較為平緩。保存1、5 d，0.1% SL組的精子質膜完整率顯著高于其他組(P<0.05)；保存2、3 d時，0.1%、0.2% SL組的精子質膜完整率顯著高于其他各組(P<0.05)；保存4、6 d，0.3% SL組的精子質膜完整率顯著低于其他組(P<0.05)。

A、B.尾部發(fā)生彎曲、腫脹，為質膜完整的精子；C.尾部呈直線狀，為質膜不完整的精子。

表4 不同濃度SL對低溫保存湖羊精子質膜完整率的影響 %

2.4 低溫保存下不同濃度SL對湖羊精子頂體完整率的影響

由圖2和表5可知，隨著精液低溫保存時間的延長，每組精子頂體完整率呈不斷下降的趨勢，其中采用0.1% SL保存的精子頂體完整率下降最為緩慢。保存1、2、5和6 d，SL各處理組的精子頂體完整率顯著高于對照組(P<0.05)，0.1% SL組最高；保存2、6 d，0.1% SL組的精子頂體完整率顯著高于其他組(P<0.05)；保存3 d，0.4% SL組與對照組的精子頂體完整率顯著低于其他組(P<0.05)，對照組最低。

A.頭部頂體區(qū)未著色，為頂體受損的精子；B.頭部頂體區(qū)著色，為頂體完整的精子。

表5 不同濃度SL對低溫保存湖羊精子頂體完整率的影響 %

3 討論

卵黃是精子低溫保存過程中最常用的一種冷凍保護劑。研究表明，精子稀釋液中添加卵黃主要是利用其磷脂成分尤其是卵磷脂為精子在保存期間提供能量，降低精子細胞在降溫過程中受到的損傷[7]。雖然卵黃有利于精液低溫保存，但其含有動物源性成分，容易受到微生物污染(如沙門菌)，增加病原傳播的風險[8]。除此之外，卵黃含有的顆粒成分也影響了精液品質。針對卵黃存在的多種缺點，需要開發(fā)一種既可以替代卵黃，又能在低溫下保持理想精液質量的抗凍劑。SL是從大豆中提取的產物，是一種植物原料，成分確定、效果穩(wěn)定且易于標準化生產操作[9]。此外，SL還具有與卵黃相似的組成成分(低密度脂蛋白)，可以保護精子免受低溫打擊。Sun等[10]應用含有2% SL稀釋劑或含有20%卵黃稀釋劑進行山羊精液冷凍保存，提高了超氧化物歧化酶(SOD)活性，抑制了活性氧(ROS)以及降低了丙二醛(MDA)含量，表明SL與卵黃能夠起到相同的保護作用。Forouzanfar等[11]在冷凍保存綿羊精液試驗中，發(fā)現(xiàn)向稀釋液中添加SL比添加卵黃能夠取得更高的精子活力、活率。因此，SL可作為卵黃的一種有效替代抗凍保護劑。

在本試驗中，精液低溫保存6 d效果最差，隨著保存時間的延長湖羊精液檢測的各項保存指標均呈下降趨勢。這可能是因為精液保存時間越長，代謝產物就越多，稀釋液就容易被污染，從而影響精液品質。精子活率、活力的高低直接影響了人工授精的成功率。SL可以作為抗氧化劑消除自由基造成的損害，從而提高低溫保存后的活率和活力[12]。本試驗結果顯示，在低溫保存精液6 d后，0.1% SL組的精子活率、活力分別從12.8%和8.33%顯著提高到82.01%和72.7%，這可能由于SL含有的磷脂成分在細胞膜中起代謝與運輸功能，支持細胞代謝，使卵磷脂在低溫過程中進入精子細胞膜，補充受損的磷脂結構，降低細胞質溶液冰點，減少細胞中冰晶形成，降低冰晶對精子的損傷；而0.4% SL組的精子活率、活力卻降低，這可能是由于加入的SL濃度達到一定程度時，精液稀釋液的黏度增加，對精子運動產生較大阻力，消耗更多ATP能量，從而降低精液質量[13]。關于SL保護精子的機理尚不清楚，還需進一步深入研究。汪俊躍等[14]研究發(fā)現(xiàn)添加5% SL對豬精液保存效果最優(yōu)。此前也有報道，山羊精液稀釋液中添加SL的最適添加量為2%[10]。這些研究結果與本研究SL最適添加量均有所不同，這可能由于使用的SL純度、研究物種或保存方式不同所致。物種特異性差異可能與精子質膜和精漿組成的差異有關[10]。此外，直線速率、曲線速率和路徑速率與精子活率、活力呈正相關[15]。本研究中，在稀釋液中添加0.1% SL可以延緩直線速率、曲線速率和路徑速率的下降速度。據(jù)報道，在山羊精液稀釋液中添加2% SL具有更高的運動性能(52.14%)，而添加3% SL顯著降低了精子運動性能(38.61%)[10]；在犬精液稀釋液中添加2% SL引起精子的運動性能降低[16]。上述研究均與本試驗結果相似。因此，推測較低濃度SL可能提高精子運動性能，從而也顯著提高精液保存效果，而較高濃度的SL具有毒性，對4 ℃保存的精液質量產生負面影響。

當溫度降低產生冷應激時，會導致精子頂體和質膜破損以及出現(xiàn)解體的現(xiàn)象，而精子質膜以及頂體的完整性對精子的代謝、受精等活動都有十分重要的意義[17]。SL在低溫保存過程中具有保護磷脂完整性的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，0.1% SL組在保存1 d時精子質膜完整率和頂體完整率分別在82.81%和87.94%，優(yōu)于6 d保存的質膜完整率(61.13%)和頂體完整率(69.04%)。宋望成[18]報道，1.0% SL保存24 h精子的質膜完整率和頂體完整率分別為46.8%和47.6%，而保存144 h又分別降低到23.4%和27.6%，這與本研究的精子質膜完整率和頂體完整率的下降速度一致。另外，本試驗0.1% SL對精子質膜和頂體的保護效果最好。劉文江等[19]研究顯示，山羊精液稀釋液添加1 g/L SL，精子質膜完整性顯著提高，精液的保存時間也顯著延長，但精子頂體完整率未發(fā)生顯著變化，這與本研究結果不一致，這可能是由于SL對精子頂體保護作用因研究對象而異。

4 結論

本研究發(fā)現(xiàn)，在湖羊精液稀釋液中添加SL能夠提高低溫保存后的精子活率、活力、曲線速率、直線速率、路徑速率、質膜完整率和頂體完整率，其中添加0.1% SL的作用效果最佳。