卵巢儲備功能減退和卵巢早衰模型小鼠的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

李曉榮, 仲佳雯, 秦嶺, 高婷, 羅玉雪, 馬小紅△

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心(寧夏銀川 750004); 2寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院(寧夏銀川 750004); 3寧夏醫(yī)科大學(xué)銀川市中醫(yī)醫(yī)院(750003)

卵巢儲備功能減退(decrease ovarian reserve, DOR)以及卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)都屬于卵巢功能下降。DOR是指卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)量減少和(或)質(zhì)量下降,同時伴有抗苗勒管激素水平降低、竇卵泡數(shù)減少、FSH水平升高[1],患者生育能力受損,嚴(yán)重者可進(jìn)一步發(fā)展為卵巢早衰。卵巢早衰是是指40歲之前的女性,由于遺傳、醫(yī)源性、自身免疫、環(huán)境等因素,卵泡發(fā)育停止或過早卵巢功能不全,導(dǎo)致卵巢功能喪失[2]。根據(jù)調(diào)查顯示,POF作為一種常見的婦科疾病,在我國的發(fā)病率為1%～3%[3],而且每年都在增加。POF患者會出現(xiàn)不孕、更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松、心腦血管、神經(jīng)等系統(tǒng)疾病和增加的死亡風(fēng)險[4],嚴(yán)重影響女性的身心健康。如今人口老齡化趨勢日漸嚴(yán)重,出生率日漸降低,國家大力推廣“三胎政策”提高生育需求,但是女性生殖能力較前卻有所下降且呈現(xiàn)年輕化趨勢。因此,生育需求與生育能力的矛盾日漸突出。DOR和POF是引起生育能力降低的重要因素,二者病因比較復(fù)雜而且發(fā)病機(jī)制尚不清楚。蛋白質(zhì)的改變是生命功能障礙的直接因素。因此,蛋白質(zhì)是一系列生理病理發(fā)生的最終執(zhí)行者,那么對相關(guān)疾病進(jìn)行蛋白質(zhì)層面的研究,有助于揭示其發(fā)病的機(jī)制并為治療提供相應(yīng)的分子靶點(diǎn)。目前蛋白組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個學(xué)科中,2019年6—10月我們從蛋白質(zhì)組學(xué)方面來找到與疾病相關(guān)的關(guān)鍵因素,進(jìn)一步研究其病理機(jī)制,揭示關(guān)鍵因素的調(diào)控機(jī)制,全面了解疾病的發(fā)生和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 環(huán)磷酰胺、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、三乙基碳酸氫銨(Sigma);白消安(APExBIO);蛋白酶抑制劑(Calbiochem);胰酶(Promega);乙腈、超純水(Fisher Chemical);三氟乙酸(Sigma-Aldrich);甲酸(Fluka);BCA試劑盒(碧云天);TMT標(biāo)記試劑盒(Thermo);雙目正置熒光顯微鏡(德國徠卡)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 選取SPF級6周齡動情周期正常的C57BL/6雌性小鼠36 只,體重18～25 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供(實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SCXK(京)2016-0011)。在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心動物屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會審查同意倫理編號為(IACUC-NYLAC-2022-038)。

1.3 模型構(gòu)建 所有小鼠均經(jīng)過一周的適應(yīng)性飼養(yǎng),然后通過陰道涂片法觀察其動情周期,選取具有正常動情周期的36只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組12只(A組)、DOR組12 只(D組)、POF組12只(B1組)。POF組采用一次性腹腔注射120 mg/kg的環(huán)磷酰胺+12 mg/kg的白消安,DOR組一次性腹腔注射60 mg/kg的環(huán)磷酰胺+6 mg/kg白消安,對照組給予同等劑量的生理鹽水,給藥后持續(xù)觀察動情周期7 d,以動情周期紊亂為造模成功。陰道涂片方法參考文獻(xiàn)[5]。小鼠的動情周期包括動情前期、動情期、動情后期和間期,正常周期為4、5 d,各期判斷標(biāo)準(zhǔn):動情前期:大量橢圓形的有核上皮細(xì)胞;動情期:大量片狀無核角化上皮細(xì)胞;動情后期:可見白細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和無核角化上皮細(xì)胞;動情間期:出現(xiàn)大量白細(xì)胞,體積相對較小。具體見圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下小鼠動情周期變化(×20)

1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.4.1 蛋白提取、酶解 從-80℃中取樣,將組織樣本置于預(yù)冷的液氮研缽中,加入液氮充分研磨至粉末狀,加入四倍體積的粉狀裂解緩沖液超聲波裂解。4℃,12 000g離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中,最后使用BCA試劑盒測定蛋白含量。將二硫蘇糖醇加入蛋白質(zhì)溶劑中,調(diào)節(jié)至5 mmol/L的最終含量,并在56℃下還原30 min,然后加入碘乙酰胺,調(diào)節(jié)至11 mmol/L的最終含量,并在室溫下避光孵育15 min,最后,將樣品種的尿素含量稀釋至2 mol/L以下。將胰蛋白酶與蛋白質(zhì)按1∶50的配比混勻,在37℃的溫度下酶解一晚。接著,將胰蛋白酶與蛋白質(zhì)按1∶100的配比混勻,繼續(xù)酶解4 h。

1.4.2 TMT標(biāo)記、HPLC分級 經(jīng)StrataXC18(Phenomenex)脫鹽后,將胰蛋白酶溶解的肽放在0.5 mol/L TEAB中,并根據(jù)TMT操作說明進(jìn)行標(biāo)記。采用Agilent300ExtendC18色譜柱,其粒徑為5 μm,內(nèi)徑為4.6 mm,長度為250 mm,通過pH反向HPLC技術(shù)對肽段進(jìn)行分級。

1.4.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 使用EASY-nLC1000超高性能液相系統(tǒng)分離肽。肽段經(jīng)超高性能液相系統(tǒng)分離后注入NSI離子源,電離后進(jìn)入QExactivePlus質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。使用高分辨率Orbitrap檢測和分析肽母離子及其二級碎片。使用DDA程序進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.4.4 數(shù)據(jù)庫搜索及生物信息學(xué)分析 使用Maxquant(v1.5.2.8)獲取二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)為Mouse_swissprot _10090,并使用反庫運(yùn)算來減少隨意配對導(dǎo)致的假陽性率。此外,還需要在數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中增加常見污染文庫,以減少蛋白質(zhì)鑒別數(shù)據(jù)受到的干擾。利用費(fèi)歇爾精確雙端檢驗(yàn)方式,我們可以對差異表達(dá)基因的GO和KEGG通路進(jìn)行富集研究,如果P值低于0.05,則表明該蛋白表達(dá)差異是顯著的。

2 結(jié)果

2.1 模型評價 造模后DOR組和POF組小鼠與對照組相比,精神相對萎靡,食欲減退,皮毛光澤度下降,體質(zhì)量減輕,且POF組體質(zhì)量下降較DOR組明顯;DOR組和POF組小鼠的動動情周期規(guī)律;顯微鏡下觀察到DOR組小鼠卵巢組織中較多閉鎖卵泡,黃體較多,情周期不規(guī)律,動情間期和后期持續(xù),很少有動情前期和動情期。對照組小鼠原始卵泡和各級卵泡均少見,POF組中可見閉鎖卵泡較DOR組更多,對照組中見少量閉鎖卵泡,黃體存在,可見原始卵泡,次級卵泡和成熟卵泡數(shù)量較DOR組和POF組多。見圖2。

注:箭頭所指為閉鎖卵泡

DOR組和POF組小鼠血清中E2和AMH水平低于對照組(P<0.05),FSH水平高于對照組(P<0.05);POF組小鼠血清中E2和AMH水平低于DOR組(P<0.05),FSH水平高于DOR組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 小鼠血清激素水平比較(n=7)

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜分析 在本實(shí)驗(yàn)中通過質(zhì)譜分析共得到779 205.0張二級譜圖。利用蛋白質(zhì)理論數(shù)據(jù)檢索質(zhì)譜二次譜后,有效譜數(shù)為225 650,共鑒定出7 485.0個蛋白,其中6 621.0個蛋白包含定量信息。以1.2倍為差異表達(dá)變化閾值,以t檢驗(yàn)P值<0.05為顯著性閾值,發(fā)現(xiàn)DOR組與對照組相比有149個顯著差異的蛋白,其中77個蛋白表達(dá)上調(diào),72個蛋白質(zhì)下調(diào);與對照組相比,POF組發(fā)現(xiàn)了148個顯著差異的蛋白質(zhì),其中60個蛋白質(zhì)上調(diào),88個蛋白質(zhì)下調(diào)。將這些顯著差異蛋白制成火山圖如圖3,部分差異蛋白信息如表2、3,二者重疊的表達(dá)差異蛋白有23個:D2HGDH、PHF24、BCR、ATP9A、TPD52、PODXL、TRIM24、MATN2、BICD1、GPX7、PDXK、MOCS2、RSRP1、H2AFY、HIST1H1E、RPL18、PIP5K1A、CD9、EPN3、ENO2、CTSA、HIST1H1C、PON1。

注:A:DOR組;B:POF組。橫軸為Log2對數(shù)變換后的蛋白質(zhì)相對定量值的值,縱軸為-Log10對數(shù)變換后顯著性檢驗(yàn)的P值。紅點(diǎn)表示顯著差異表達(dá)的上調(diào)蛋白,藍(lán)點(diǎn)表示顯著差異表達(dá)的下調(diào)蛋白

表2 DOR組與對照組部分差異表達(dá)蛋白

2.3 差異蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果 使用Wolfpsort軟件分析差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位,兩組不同蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果如下(圖4)。兩組差異蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位按百分比大小依次排列均為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外,其次是線粒體和質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),除此之外DOR組還有兩個差異蛋白定位在其他細(xì)胞器。

表3 POF組與對照組部分差異表達(dá)蛋白

注:A和B分別代表DOR組和POF組差異表達(dá)蛋白的定位,餅圖中的數(shù)字代表顯著差異表達(dá)蛋白的數(shù)量,百分比代表結(jié)構(gòu)中差異表達(dá)蛋白的數(shù)量占總差異表達(dá)蛋白的百分比

2.4 差異表達(dá)蛋白的GO功能注釋 Gene Ontology(GO)是一個重要的生物信息學(xué)分析方法和工具,用于表述基因和基因產(chǎn)物的各種屬性。 GO注釋分為3個大類:生物進(jìn)程(biological process,BP),細(xì)胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)[6]。針對BP、CC、MF中涉及的GO節(jié)點(diǎn)列出對應(yīng)的蛋白數(shù)量,對差異表達(dá)蛋白在GO二級注釋中的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖5)。在生物學(xué)過程這一類別中DOR組和POF組差異表達(dá)蛋白占比最多的都是細(xì)胞過程,其次是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程;在細(xì)胞組分這一類別中,均是細(xì)胞的數(shù)量最多,其次是細(xì)胞器;參與分子功能的差異表達(dá)蛋白中,其中結(jié)合與催化活性二者最多。在所有亞類中,細(xì)胞過程、細(xì)胞、細(xì)胞器和結(jié)合注釋的差異蛋白數(shù)量最多。與此同時,對其差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析(圖6),發(fā)現(xiàn)DOR組GO富集分析顯示差異蛋白主要參與了維生素B6代謝過程、磷酸吡哆醛生物合成過程、磷酸吡哆醛代謝過程、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物組裝、膽固醇穩(wěn)態(tài)的正調(diào)節(jié)、對氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)等生物過程;POF組GO富集分析顯示差異蛋白主要參與了細(xì)胞脂質(zhì)分解代謝過程、甘油脂分解代謝過程、前列腺素反應(yīng)、微絨毛組織的調(diào)節(jié)、輔基代謝過程、白細(xì)胞介素6生產(chǎn)的調(diào)節(jié)、對抗原刺激的炎癥反應(yīng)等生物進(jìn)程。

2.5 差異蛋白KEGG通路富集分析 KEGG是關(guān)于通路的公共數(shù)據(jù)庫,為了進(jìn)一步探究差異蛋白發(fā)生作用的通路,將其具有顯著差異的蛋白納入KEGG數(shù)據(jù)庫檢索,得出差異表達(dá)蛋白在KEGG通路中富集分布?xì)馀輬D,見圖7。DOR組中的差異蛋白主要與維生素B6代謝、α-亞麻酸代謝、PPAR信號通路相關(guān),其中最顯著相關(guān)的是維生素B6代謝通路,富集蛋白最多的通路是PPAR信號通路;POF組中的差異蛋白主要與同源重組、錯配修復(fù)、鞘糖脂生物合成、花生四烯酸代謝、核糖體、糖鞘脂生物合成-神經(jīng)節(jié)系列、DNA復(fù)制等通路顯著相關(guān),其中與與同源重組、錯配修復(fù)通路最顯著相關(guān),富集蛋白最多的一條信號通路是核糖體通路。P值最小的前5條通路具體見表4、5。

注:A、B分別代表DOR組和POF組差異表達(dá)蛋白在GO二級分類中的統(tǒng)計(jì)分布

注:A、B分別為DOR組和POF組BP、CC、MF三類差異蛋白富集分析,C、D分別為DOR、POF組BP的富集氣泡圖

注:A為DOR組,B為POF組。橫坐標(biāo)為P值的-Log10 轉(zhuǎn)換值,縱坐標(biāo)為通路的名稱,圓圈大小代表富集該通路的差異蛋白數(shù)目,顏色代表P值的大小

表4 DOR組差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集結(jié)果(top 5)

表5 POF組差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集結(jié)果(top 5)

3 討論

DOR是卵巢衰老或衰竭的前期,這是由于卵巢中可募集的卵泡數(shù)量減少或卵母細(xì)胞受精能力下降所致,發(fā)生率約10%,是月經(jīng)過少的常見原因[7],若不重視后期會發(fā)展為POF。POF是指在40歲之前失去正常的卵巢功能,這種情況影響約1%的40歲以下女性和0.1%的30歲以下女性。它的生化特征是閉經(jīng)伴有低雌激素和高促性腺激素性疾病,在某些情況下會導(dǎo)致生育能力喪失[8]。卵巢早衰通病因大多未確定[9],Fraison等[10]認(rèn)為,POF是由潛在機(jī)制引起的,例如早期卵泡耗竭,卵泡成熟受阻或卵母細(xì)胞庫破壞以及抵抗性卵巢綜合征,可能涉及這些機(jī)制的POF的已確定原因分為兩類:遺傳和非遺傳原因。遺傳原因涉及各種遺傳異常,而非遺傳原因包括自身免疫和代謝紊亂、感染、環(huán)境因素和醫(yī)源性程序[11]。目前已經(jīng)采用了各種方法來治療POF,但效果不顯。

蛋白質(zhì)組學(xué)通過比較生物體或組織中所有蛋白質(zhì)的差異表達(dá)[12],揭示了蛋白質(zhì)分子水平的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制。在此實(shí)驗(yàn)中,采用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行TMT標(biāo)記,進(jìn)行鑒定和量化,通過生物信息學(xué)技術(shù)對差異蛋白進(jìn)行分析來探究DOR、POF可能的靶點(diǎn)和通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DOR組小鼠卵巢有148個顯著表達(dá)蛋白,POF組小鼠卵巢有149個顯著差異表達(dá)蛋白,二者差異表達(dá)蛋白重疊有23個,其中HIST1H1C、RPL18、HIST1H1E、D2HGDH等蛋白在兩組中都呈現(xiàn)顯著高表達(dá),二者重疊蛋白差異倍數(shù)趨勢一致。在DOR組中CA3、FABP4、RETN等蛋白顯著高表達(dá),POF組D2HGDH、CYP4F3等蛋白顯著高表達(dá),這些表達(dá)差異倍數(shù)較大的蛋白可能在疾病發(fā)展過程中起關(guān)鍵的作用。

差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位表明,占比最多的是細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和胞外,其次是線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。線粒體是多功能細(xì)胞器,其主要功能包括以ATP形式產(chǎn)生細(xì)胞能量,維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),活性氧(ROS)形成,細(xì)胞凋亡,脂肪酸氧化和類固醇合成。線粒體功能障礙是衰老的標(biāo)志之一,線粒體功能障礙可由多種途徑引起,如線粒體DNA異?；蛑饾u累積損傷、氧化應(yīng)激、Ca2+直接損傷線粒體,導(dǎo)致卵子發(fā)育潛力下降,誘導(dǎo)卵子凋亡,引起卵巢儲備功能下降,進(jìn)而發(fā)展為卵巢早衰[13]。目前普遍認(rèn)為氧化是導(dǎo)致衰老的重要因素,而線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)的氧化折疊機(jī)制是自由基的兩大來源[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能導(dǎo)致鈣和氧化還原穩(wěn)態(tài)受損,引起氧化應(yīng)激,從而影響線粒體功能。從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣增加了線粒體活性氧(ROS)的產(chǎn)生,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)ROS的毒性積累會干擾基本的細(xì)胞器功能。持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能引發(fā)炎癥反應(yīng),通過炎癥或線粒體功能障礙產(chǎn)生的ROS可能會加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙[15]。D2HGDH、ATP9A、MRPl16、MTMR14、FAM162A等蛋白的功能與線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)系密切,可見,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是關(guān)于DOR、POF疾病發(fā)生的重要細(xì)胞器,另外DOR組中有兩個差異蛋白定位在其他細(xì)胞器中,具體信息尚不清楚,仍需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

GO富集分析結(jié)果顯示DOR、POF疾病的發(fā)生、發(fā)展涉及氧化應(yīng)激、炎癥等多種生物學(xué)過程。氧化應(yīng)激指機(jī)體在受到各種有害刺激時,產(chǎn)生過多的自由基,且氧化物清除能力下降,體內(nèi)氧化與抗氧化之間的不平衡[16],是導(dǎo)致衰老的重要因素。ROS主要是線粒體氧化磷酸化的副產(chǎn)物,當(dāng)機(jī)體受到某些疾病或外源性物質(zhì)攻擊時,導(dǎo)致組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,于是細(xì)胞利用多種抗氧化機(jī)制阻斷ROS的形成或中和其代謝過程中產(chǎn)生的ROS。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過細(xì)胞的排泄能力時,細(xì)胞因ROS的過度積累而引起異常的炎癥反應(yīng)[17]。Bauer等[18]實(shí)驗(yàn)證明,氧化應(yīng)激是卵巢衰老過程的主要驅(qū)動力,并有助于與卵巢衰老相關(guān)的其他病因的發(fā)展,如端?？s短、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡和炎癥。衰老器官中血清炎癥因子(如IL-6、IL-8、TNF-α)水平顯著升高,說明衰老與炎癥相關(guān)[19]。

GPX7是谷胱甘肽過氧化物酶家族(抗氧化)的成員,可有效控制過氧化物氫酶(H2O2)和通過還原谷胱甘肽的有機(jī)過氧化氫,它的主要作用是參與機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持[20]。TRIM家族,是一類具有E3泛素連接酶活性的蛋白質(zhì),其功能廣泛,能夠影響細(xì)胞增殖、分化、先天免疫、凋亡調(diào)控等,其中TRIM24是炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)劑。GPX7在兩組中的蛋白表達(dá)較空白對照組相比均有所下降,TRIM24在兩組中的蛋白表達(dá)均有所上升,說明兩組小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)較均有所增加。越來越多的證據(jù)表明,接頭組蛋白HIST1H1C(H1.2)在多個細(xì)胞過程中具有重要功能,包括細(xì)胞凋亡、自噬、基因轉(zhuǎn)錄等[21]。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)組蛋白H1.2的過表達(dá)上可以導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白的上調(diào),從而促進(jìn)自噬,炎癥和病變形成。H1.2蛋白在兩組結(jié)果中都顯著高表達(dá),說明其在兩種疾病中都發(fā)揮重要作用。D2HGDH是一種依賴FAD的線粒體酶,D2-羥基戊二酸(D2-HG)被認(rèn)為是細(xì)胞代謝的不需要的副產(chǎn)物,D2HGDH介導(dǎo)D2-HG向α-酮戊二酸(α-KG)的轉(zhuǎn)化,研究表明D2HGDH表達(dá)的增加會提高細(xì)胞內(nèi)α-KG的水平[23]。α-KG不僅是三羧酸(TCA)循環(huán)中的重要代謝產(chǎn)物,它可以抑制ATP合成酶,減少細(xì)胞耗氧量從而延緩衰老,此外其在脂質(zhì)合成、氧化應(yīng)激、細(xì)胞死亡等生理過程中也具有重要的調(diào)控作用。蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)D2HGDH在DOR、POF組中都呈現(xiàn)高表達(dá),說明細(xì)胞內(nèi)α-KG升高,機(jī)體抗氧化能力升高,尤其在POF組中作用更加顯著。CA3是碳酸酐酶基因家族中的一員,在體內(nèi)主要參與氧化代謝和離子交換等生理過程,其通過二硫鍵可逆結(jié)合到谷胱甘肽,可避免細(xì)胞受到氧化應(yīng)激的傷害[24]。FABP4作為脂肪酸結(jié)合蛋白家族成員,在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要的作用[25],可以直接促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放和ROS的產(chǎn)生[26]。CA3和FABP4在DOR組中顯著高表達(dá)說明CA3、FABP4可能是DOR發(fā)生過程中的關(guān)鍵蛋白。

KEGG通路富集結(jié)果顯示DOR和POF疾病的發(fā)生發(fā)展是通過多條通路進(jìn)行協(xié)同調(diào)控的,而不能單以一條通路來概括。目前我們課題組比較關(guān)注的通路是α-亞麻酸信號通路和花生四烯酸代謝通路。α-亞麻酸(ALA)和花生四烯酸(AA)都是多不飽和脂肪酸,多不飽和脂肪酸目前分為n-3、n-6、n-7和n-9這四個家族,其中ALA屬于n-3家族,AA屬于n-6家族。張怡等[27]研究發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸可影響卵巢脂肪酸含量、卵泡線粒體功能和卵泡氧化應(yīng)激。n-3和n-6多不飽和脂肪酸可以調(diào)節(jié)生殖功能,因?yàn)樗鼈儠绊懬傲邢偎睾铣珊皖惞檀忌蒣28]。另外有研究[29]表示ALA能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化還原平衡。Wakefield等[30]研究發(fā)現(xiàn)在卵巢成熟過程中,卵母細(xì)胞暴露于富含n-3多不飽和脂肪酸的環(huán)境中會導(dǎo)致線粒體分布和鈣水平改變,并增加活性氧的產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)n-3 可以增加受精卵數(shù)量并能提高卵泡的線粒體功能和氧含量。Wathes等[28]認(rèn)為卵母細(xì)胞的多不飽和脂肪酸含量會影響成熟、冷凍保存和隨后的發(fā)育能力。ALA與卵母細(xì)胞生長和分化、調(diào)節(jié)生發(fā)囊泡階段的減數(shù)分裂停滯以及防止生發(fā)囊泡破裂有關(guān)。近期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALA可以抑制顆粒細(xì)胞的凋亡,可以通過抑制顆粒細(xì)胞中膽固醇的合成從而抑制類固醇激素的合成,導(dǎo)致E2分泌降低[31]。服用ALA后,體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性升高,自由基代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)的生成減少,揭示ALA有抗衰老作用。由此可見,ALA與氧化、炎癥、衰老關(guān)系密切,因此,認(rèn)為α-亞麻酸信號通路是DOR疾病發(fā)展中的一條重要通路。

AA是細(xì)胞膜脂質(zhì)的主要成分,它能進(jìn)一步被環(huán)氧合酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和細(xì)胞色素P450(CYP450)酶三種酶催化代謝,基于這三種代謝途徑,AA可以轉(zhuǎn)化為引發(fā)不同炎癥反應(yīng)的各種代謝物[32]。AA是促炎前列腺素的前體,可介導(dǎo)卵泡成熟和排卵過程[33]。張金銘等[34]發(fā)現(xiàn),AA會損害人卵巢顆粒腫瘤細(xì)胞系的分泌和線粒體功能,能有效地誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,然后發(fā)揮促凋亡作用,長期食用AA會使小鼠卵巢閉鎖卵泡增多。這些研究都輔助說明了花生四烯酸代謝通路是POF疾病發(fā)生中的一條重要通路。據(jù)報(bào)道,CYP4F亞家族成員主要參與花生四烯酸和異生素的代謝。CYP4F3是脂肪酸環(huán)氧化物氧化的主要催化劑,參與重要細(xì)胞介質(zhì)的氧化[35]。CYP4F3過表達(dá)可誘導(dǎo)花生四烯酸增加,ROS積累和脂質(zhì)過氧化,最終引起鐵死亡[36]。蛋白組學(xué)結(jié)果顯示POF組中CYP4F3顯著上調(diào),導(dǎo)致ROS積累和AA代謝途徑激活,可見CYP4F3在花生四烯酸代謝通路中的重要作用。

綜上所述,通過對DOR組和POF組小鼠的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這兩種疾病是多蛋白、多生物學(xué)過程、多通路協(xié)同調(diào)控的。二者的發(fā)生都涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程;α-亞麻酸信號通路可能是參與DOR發(fā)生的一條重要通路,HIST1H1C、CA3、FABP4可能是其發(fā)生的關(guān)鍵靶點(diǎn);花生四烯酸代謝信號通路可能是參與POF發(fā)生的一條重要通路,HIST1H1C、D2HGDH、CYP4F3可能是POF發(fā)生的重要靶點(diǎn);本研究是基于多個數(shù)據(jù)模型得出的生物信息學(xué)假設(shè),其具體發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:李曉榮研究方案設(shè)計(jì)、論文修改指導(dǎo);仲佳雯、高婷撰寫論文、實(shí)驗(yàn)操作、統(tǒng)計(jì)分析;秦嶺、羅玉雪文獻(xiàn)檢索、原始結(jié)果的整理與分析;馬小紅負(fù)責(zé)方案可行性分析、論文修改、研究指導(dǎo)。