基于單細(xì)胞測(cè)序和芯片數(shù)據(jù)分析強(qiáng)直性脊柱炎合并克羅恩病的腸黏膜免疫浸潤(rùn)和炎癥微環(huán)境

羅錫慶, 古潔若

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科、廣東省免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(廣東廣州 510630)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種常見(jiàn)的以附著點(diǎn)炎癥、新骨形成為特征的主要侵犯脊柱和骨盆骶髂關(guān)節(jié)的炎癥性風(fēng)濕免疫疾病[1]。約60%的AS患者存在無(wú)癥狀的腸道炎癥,行腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)多見(jiàn)于近端結(jié)腸和回腸末端部位的微小炎性病灶存在[2],或宏基因組測(cè)序結(jié)果顯示腸道菌群失調(diào)[3],不僅對(duì)炎癥因子表達(dá)產(chǎn)生了影響,還引發(fā)腸黏膜免疫細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)產(chǎn)生改變[4],但患者無(wú)明顯胃腸道不適的主訴,處于亞臨床腸炎的狀態(tài)尚未達(dá)到炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。隨著病程的進(jìn)展,引起腸道易激惹的癥狀,如大便次數(shù)增加、腹瀉,有約7%～10%[5-6]的嚴(yán)重患者可能演變?yōu)榫哂信R床表現(xiàn)的腸炎,發(fā)展為IBD如典型的克羅恩病(Crohn′s disease, CD)或潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)[7],目前以累及回盲部的CD最為常見(jiàn)。根據(jù)在鏡下觀察的病理特點(diǎn)可以把具有臨床表現(xiàn)的腸炎進(jìn)一步分為急性和慢性兩種表型,其中,急性炎癥表型以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主;而慢性炎癥表型則以單核、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主,同時(shí)具有病理結(jié)構(gòu)破壞且類似于CD的表現(xiàn)。腸黏膜免疫細(xì)胞的變化在IBD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中是一個(gè)重要的方面,腸黏膜免疫細(xì)胞相互作用導(dǎo)致了腸道炎癥的進(jìn)一步發(fā)展和加重[8]。因此,在IBD的治療過(guò)程中,免疫調(diào)節(jié)劑、生物制劑等治療方法都致力于控制這些免疫細(xì)胞的數(shù)量和活性,從而減輕炎癥反應(yīng),控制腸道炎癥。同時(shí),腸道和外周血免疫細(xì)胞的變化也可以作為IBD的臨床診療當(dāng)中的重要參考指標(biāo)之一,通過(guò)檢測(cè)免疫細(xì)胞的類型和數(shù)量來(lái)判斷IBD的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后等信息[9]。成人和兒童IBD患者的外周血和腸黏膜中都發(fā)現(xiàn)了活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞[10]。在AS合并IBD的病理生理過(guò)程中,CD8+T細(xì)胞可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。首先,CD8+T細(xì)胞在腸道黏膜屏障的維持和病原體清除中具有重要功能[11]。在IBD中,腸道黏膜屏障受損,導(dǎo)致腸道細(xì)菌穿越黏膜進(jìn)入組織,進(jìn)一步加重炎癥。CD8+T細(xì)胞的異常激活可能導(dǎo)致腸道黏膜屏障損傷,加劇炎癥反應(yīng)[12]。其次,CD8+T細(xì)胞分泌多種炎癥性細(xì)胞因子,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和γ-干擾素(IFN-γ),參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[13]。在AS和 IBD的病理過(guò)程中,這些炎癥性細(xì)胞因子可能導(dǎo)致組織損傷和炎癥。此外,CD8+T細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞如Th17和Treg細(xì)胞以及抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[14]存在相互作用,參與AS合并IBD的病理過(guò)程。細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞和產(chǎn)生白細(xì)胞介素(IL)-17的CD8+細(xì)胞(又稱Tc17細(xì)胞)參與IBD的發(fā)病機(jī)制[14]。CD8+T細(xì)胞在AS合并 IBD的發(fā)病機(jī)制中可能扮演著重要角色。它們參與腸道黏膜屏障的損傷和修復(fù)過(guò)程、炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及與其他免疫細(xì)胞的相互作用,共同促進(jìn)炎癥反應(yīng)的持續(xù)和加重[15-18]。深入研究CD8+T細(xì)胞在這些疾病中的作用和相互關(guān)系,有助于揭示病因?qū)W,并為開(kāi)發(fā)針對(duì)特異性T細(xì)胞亞群的治療策略提供理論依據(jù)。因此,為了解析AS患者合并腸炎機(jī)制,本研究使用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的芯片數(shù)據(jù)初探AS合并亞臨床腸炎、AS合并CD的腸組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況及主要炎癥信號(hào)通路激活情況,并使用AS合并腸炎的腸黏膜及外周血的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析驗(yàn)證腸炎中的主要炎癥信號(hào)通路活性,為AS關(guān)節(jié)外并發(fā)癥監(jiān)測(cè)、后續(xù)治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 主要數(shù)據(jù) 為了獲取AS患者的腸黏膜組織的基因表達(dá)芯片、測(cè)序與其臨床數(shù)據(jù),使用關(guān)鍵詞為“脊柱關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎”和“腸炎”,在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information,NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。檢索公式具體如下: (Ankylosing spondylitis OR spondyloarhtritis OR Spondylarthropathy) AND (inflammatory bowel disease OR Crohn′s disease OR ulcerative colitis OR colitis),共獲得4個(gè)GSE數(shù)據(jù)集,分別為GSE163314、GSE92472、GSE14442、GSE10080,其中GSE92472為全血組織來(lái)源且樣本量少?zèng)]有設(shè)定生物學(xué)重復(fù),GSE10080為從健康人群中提取PBMC細(xì)胞并使用IL-23刺激相互對(duì)照的數(shù)據(jù)集,均為非腸道組織數(shù)據(jù)予以排除,GSE163314為單細(xì)胞測(cè)序包含AS的腸黏膜數(shù)據(jù),GSE14442為AS合并CD的腸黏膜芯片數(shù)據(jù)。最終納入GSE14442、GSE163314為主要研究數(shù)據(jù)。臨床數(shù)據(jù)主要通過(guò)以下方式獲得:(1)通過(guò)作者上傳的基因表達(dá)matrix文件中提取。(2)通過(guò)數(shù)據(jù)集相對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)的全文及補(bǔ)充材料獲得。見(jiàn)表1。

1.2 芯片數(shù)據(jù)處理分析流程

1.2.1 芯片數(shù)據(jù)處理 從GEO平臺(tái)下載雙色芯片GSE14442 表達(dá)矩陣,該數(shù)據(jù)為CD患者和包括AS的脊椎關(guān)節(jié)炎患者腸道活檢中的基因芯片數(shù)據(jù)。根據(jù)作者數(shù)據(jù)處理說(shuō)明,選擇Channel 1熒光標(biāo)記為Cy5作為背景矯正,Channel 2熒光標(biāo)記為Cy3作為檢測(cè)值并進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理后獲取表達(dá)矩陣,通過(guò)提供的平臺(tái)文件將基因探針注釋為基因官方名。

1.2.2 免疫細(xì)胞的評(píng)估 CIBERSORT是一種基于去卷積的工具,它使用支持向量回歸方法來(lái)分析基因表達(dá)數(shù)據(jù),以推斷混合細(xì)胞類型樣本中每種細(xì)胞類型的比例。該工具基于標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù),能夠評(píng)估22種類型免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的比例。利用CIBERSORT 算法評(píng)估浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的類型及豐度,選擇 CIBERSORT中P≤0.05的結(jié)果進(jìn)行下一步分析。

1.2.3 基因集富集分析驗(yàn)證炎癥相關(guān)通路 使用基因集富集分析GSEA揭示AS合并CD組與AS組之間的基因集在INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、INFLAMMATORY_RESPONSE、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB等的AS炎癥相關(guān)的基因數(shù)據(jù)集中富集情況。

1.3 單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析流程

1.3.1 使用Seurat對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控預(yù)處理 通過(guò)read10X加載GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載的基因表達(dá)數(shù)據(jù),創(chuàng)建Seurat對(duì)象。每個(gè)單細(xì)胞中檢測(cè)到的不同基因的數(shù)量設(shè)定>200且<4 000,單細(xì)胞中所有基因的表達(dá)量之和設(shè)定為<10 000以選擇非零表達(dá)基因的細(xì)胞,并對(duì)線粒體基因比例>10%的細(xì)胞進(jìn)行去除,以獲得可靠穩(wěn)健的分析結(jié)果。隨后對(duì)全部的數(shù)據(jù)表達(dá)量進(jìn)行NormalizeData標(biāo)準(zhǔn)化、ScaleData歸一化。使用FindIntegrationAnchors進(jìn)行多個(gè)樣本整合,并去除干擾因素。

1.3.2 細(xì)胞降維以及聚類 Findmarkers 方法用于計(jì)算每個(gè)樣本中最顯著的2 000個(gè)高度可變基因,將其視為關(guān)鍵基因,以便在后續(xù)的主成分分析(principal component analysis,PCA)中進(jìn)行降維處理。在此過(guò)程中,主成分的數(shù)量設(shè)定為30個(gè),同時(shí)為每個(gè)測(cè)試數(shù)據(jù)集生成彎頭圖。根據(jù)彎頭圖的結(jié)果,綜合判斷采用前20個(gè)主成分對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類和聚類預(yù)測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞聚類的二維平面可視化,采用了 t-SNE 和 UMAP降維算法直觀地展示細(xì)胞聚類的結(jié)果。

1.3.3 使用參考標(biāo)記基因進(jìn)行重新聚類并細(xì)胞類型注釋 使用singleR注釋工具的免疫細(xì)胞參考數(shù)據(jù)集MonacoImmuneData進(jìn)行初步的細(xì)胞亞群分類,并參照Cellmarker數(shù)據(jù)庫(kù)中不同細(xì)胞類型的標(biāo)志性基因,分析其在聚類結(jié)果的表達(dá)來(lái)進(jìn)行手動(dòng)細(xì)胞類型注釋。

1.3.4 差異基因計(jì)算 通過(guò)應(yīng)用 Seurat 軟件包中的FindAllMarkers函數(shù),計(jì)算各種細(xì)胞類型之間的差異表達(dá)基因(logfc.threshold=0.25, min.pct=0.1)。

1.3.5 單細(xì)胞基因集打分 單細(xì)胞基因集打分(single-cell gene set scoring)是一種專門(mén)針對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的分析方法,旨在量化特定基因集在單細(xì)胞層面上的表達(dá)水平或活性。這一策略利用一組預(yù)先確定的基因集,與特定的生物過(guò)程、信號(hào)傳導(dǎo)途徑或細(xì)胞功能緊密相關(guān),進(jìn)而對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。借助單細(xì)胞基因集打分,能夠在單細(xì)胞分辨率上深入探討各種細(xì)胞亞群之間在功能上的差異,揭示細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)演變以及在疾病進(jìn)展過(guò)程中所發(fā)揮的分子機(jī)制,有助于解析細(xì)胞間的異質(zhì)性以及病理生理過(guò)程。本研究使用irGSEA(integrated rank-based gene set enrichment analysis)整合性方法對(duì)標(biāo)記好細(xì)胞類型的亞群利用基于單個(gè)樣本的基因表達(dá)排名的基因集分析方法 “AUCell”“UCell”“singscore”“ssgsea”四種算法進(jìn)行基因集打分,從而在降低批次效應(yīng)影響的同時(shí),計(jì)算每個(gè)細(xì)胞在基因集上的表達(dá)水平、活性評(píng)分,更為有效地挖掘穩(wěn)定可靠的基因集。隨后綜合全部算法的結(jié)果并進(jìn)行可視化分析,揭示細(xì)胞之間在功能水平上的差異和相關(guān)性。

1.3.6 炎癥信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)情況 從分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)(Molecular Signatures Database,MSigDB)中獲取相關(guān)炎癥信號(hào)通路的gmt文件制作炎癥信號(hào)通路相關(guān)基因表格。使用FindMarkers函數(shù)對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的AS合并CD組以及AS不合并CD組進(jìn)行差異基因分析獲取差異基因列表。對(duì)炎癥信號(hào)通路相關(guān)基因表格以及差異基因列表進(jìn)行合并查看相關(guān)炎癥信號(hào)通路中主要基因的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

2.1.1 芯片數(shù)據(jù)分組 在分析中,首先對(duì)患者進(jìn)行篩選,選擇具有臨床表現(xiàn)的SpA樣本,根據(jù)臨床信息中組織學(xué)檢查包括正常腸黏膜、急性炎癥、慢性炎癥以及CD特征性的病理特點(diǎn)如狹窄(stricturing)、潰瘍(penetrating)分為脊柱關(guān)節(jié)炎不合并腸炎(SpA)、脊柱關(guān)節(jié)炎合并亞臨床腸炎(SpA-subCD)、脊柱關(guān)節(jié)炎合并臨床腸炎CD(SpA&CD),其中脊柱關(guān)節(jié)炎不合并腸炎根據(jù)是否累及中軸關(guān)節(jié)分為中軸型SpA(SpA-A)和外周型SpA(SpA-P)兩種情況。見(jiàn)表2。

表2 納入分析芯片數(shù)據(jù)基本信息表

2.1.2 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分組情況 從GEO數(shù)據(jù)集GSE163314中選取SpA(該研究中全部為中軸型,即AS)有無(wú)合并CD的樣本,包括外周血和腸黏膜的數(shù)據(jù),共有4例患者,其中2例為SpA合并CD定義為SpA&CD,兩例為SpA不合并CD定義為SpA,具體分組如表3所示。

分區(qū)裝表計(jì)量法（District Meter Area，簡(jiǎn)稱DMA），其工作原理是將檢測(cè)管網(wǎng)分成多個(gè)區(qū)域，利用每個(gè)區(qū)段安裝的水表計(jì)量區(qū)段用水量，在夜間無(wú)居民用水或用水量非常少時(shí)，這個(gè)時(shí)候的用水量可以作為該區(qū)段的漏水量。通過(guò)關(guān)閉區(qū)段內(nèi)的閥門(mén)，對(duì)比用水量變化即可確定漏水管段。當(dāng)漏水管段確定后再用聽(tīng)音法即可確定漏水具體位置。

表3 納入分析單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)基本信息表

2.2 芯片數(shù)據(jù)分析 采用 CIBERSORT 反卷積法進(jìn)行計(jì)算,輸出每個(gè)樣本中不同免疫細(xì)胞亞群的百分比,圖1展示了22種免疫細(xì)胞在各個(gè)樣本中的含量豐度。以P<0.05為篩選條件對(duì)芯片進(jìn)行篩選,CD8+T淋巴細(xì)胞、未活化的記憶 CD4+T細(xì)胞、靜息狀態(tài)下CD4+T記憶細(xì)胞含量在AS腸黏膜組織中不同程度增加。見(jiàn)圖2。

通過(guò)箱線圖(圖3)直觀地比較SpA患者發(fā)生亞臨床腸炎、臨床腸炎的腸組織免疫細(xì)胞亞群的差異。中軸型及外周型SpA患者CD4+、CD8+T淋巴亞群在未發(fā)生腸炎時(shí),CD4+、CD8+T淋巴亞群占比較低。但當(dāng)發(fā)生腸炎時(shí),隨著病情的進(jìn)展,未活化的記憶 CD4+T細(xì)胞、靜息狀態(tài)下CD4+T記憶細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞含量逐漸增加。在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞亞群中無(wú)明顯差異變化。

使用GSEA算法驗(yàn)證在AS合并CD的患者以及AS腸黏膜芯片基因表達(dá)矩陣中INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、INFLAMMATORY_RESPONSE、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB這三個(gè)與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路的富集情況(圖4)發(fā)現(xiàn), INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、INFLAMMATORY_RESPONSE、TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB均能在GSEA分析中明顯富集(矯正后P<0.05),而IL17-PATHWAY則無(wú)明顯富集(矯正后P>0.05)。

圖1 22種免疫細(xì)胞在SpA合并腸炎的芯片數(shù)據(jù)中的浸潤(rùn)豐度情況

圖2 AS腸黏膜組織芯片中T淋巴細(xì)胞異常浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的類型

圖3 箱線圖比較不同類型SpA發(fā)生腸炎的腸黏膜細(xì)胞浸潤(rùn)比例

2.3 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析 通過(guò)對(duì)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控,獲得了外周血數(shù)據(jù)集有18 404個(gè)免疫細(xì)胞,腸黏膜有4 412個(gè)免疫細(xì)胞,共22 816個(gè)高質(zhì)量免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和聚類,得到可視化腸黏膜、外周血免疫細(xì)胞的 t-SNE聚類圖和UMAP聚類圖(圖5、6),可見(jiàn)細(xì)胞總共分為若干Cluster細(xì)胞亞群,腸黏膜數(shù)據(jù)被分為7群細(xì)胞,而外周血數(shù)據(jù)被分為10群細(xì)胞。腸黏膜數(shù)據(jù)每一個(gè)Cluster的細(xì)胞數(shù)量分別為1453(0)、822(1)、643(2)、616(3)、416(4)、385(5)、75(6)。外周血數(shù)據(jù)每一個(gè)Cluster的細(xì)胞數(shù)量分別為3727(0)、3080(1)、2890(2)、2637(3)、1809(4)、1763(5)、934(6)、732(7)、675(8)、157(9)。

注:A-綠色:INTERFERON_GAMMA_RESPONSE;A-紅色:INFLAMMATORY_RESPONSE;A-藍(lán)色:TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB;B-黑色:IL17-PATHWAY

使用SingleR中的MonacoImmuneData作為對(duì)比參考數(shù)據(jù),結(jié)合淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)記物在數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況(圖7、8),腸黏膜的單細(xì)胞數(shù)據(jù)的Cluster1、Cluster5高表達(dá)CD3E、CD8A,鑒定為腸黏膜CD8+的T淋巴細(xì)胞亞群并進(jìn)行提取標(biāo)記用于后續(xù)單細(xì)胞基因集打分。同理,對(duì)比圖5、6,外周血的單細(xì)胞數(shù)據(jù)的Cluster2、Cluster8同時(shí)高表達(dá)CD3E、CD8A,鑒定為外周血CD8+的T淋巴細(xì)胞亞群并進(jìn)行提取標(biāo)記用于后續(xù)單細(xì)胞基因集打分。

注:A:使用t-SNE降維后的細(xì)胞分布圖;B:根據(jù)樣品分組的細(xì)胞分布圖;C:使用UMAP降維后的細(xì)胞分布圖;D:根據(jù)樣品分組的細(xì)胞分布圖。圖例中,0～6表示聚類的7個(gè)亞群,C表示腸黏膜樣本

注:A:使用t-SNE降維后的細(xì)胞分布圖; B:根據(jù)樣品分組的細(xì)胞分布圖;C:使用UMAP降維后的細(xì)胞分布圖;D:根據(jù)樣品分組的細(xì)胞分布圖。圖例中,0～9表示聚類的10個(gè)亞群,B表示外周血樣本

對(duì)提取CD8+T細(xì)胞的外周血、腸黏膜不同疾病組(SpA、SpA&CD)中進(jìn)行CD8+T細(xì)胞的占比情況分析。發(fā)現(xiàn)在外周血中CD8+T細(xì)胞中SpA&CD的平均占比為21%,高于SpA平均占比18%;而在腸黏膜中CD8+T細(xì)胞SpA的平均占比為30%,高于SpA&CD平均占比23%,鑒于該數(shù)據(jù)的腸黏膜提取免疫細(xì)胞獲取的細(xì)胞數(shù)較外周血樣本明顯較少,仍有待更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證:腸黏膜SpA01 為359個(gè)免疫細(xì)胞,SpA02 為2 964個(gè)免疫細(xì)胞,SpA&CD01為846個(gè)免疫細(xì)胞,SpA&CD02為1 482個(gè)免疫細(xì)胞;外周血SpA01 為6 098個(gè)免疫細(xì)胞,SpA02 為6 041個(gè)免疫細(xì)胞,SpA&CD01為4 988個(gè)免疫細(xì)胞,SpA&CD02為3 974個(gè)免疫細(xì)胞。

圖7 小提琴圖展示常見(jiàn)免疫細(xì)胞特征表達(dá)標(biāo)記物在腸黏膜樣本中不同Cluster中的表達(dá)情況

圖8 小提琴圖展示常見(jiàn)免疫細(xì)胞特征表達(dá)標(biāo)記物在外周血樣本中不同Cluster中的表達(dá)情況

對(duì)提取的腸黏膜和外周血的CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞基因集富集評(píng)分(圖9),綜合四種算法的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)TNF-α信號(hào)通路、IFN-γ信號(hào)通路、以及炎癥反應(yīng)信號(hào)通路在AS合并CD的患者中較AS無(wú) CD的患者的通路活性均有不同程度的升高,其中在腸黏膜的分布更加明顯。然而,IL-17信號(hào)通路在腸黏膜中無(wú)明顯升高,而在外周血中則與TNF-α信號(hào)通路、IFN-γ信號(hào)通路類似具有升高的趨勢(shì),提示TNF-α信號(hào)通路、IFN-γ信號(hào)通路、IL-17A信號(hào)通路在外周血CD8+T細(xì)胞中活躍。而在腸黏膜中,主要是TNF-α信號(hào)通路、IFN-γ信號(hào)通路可能參與了AS合并腸炎的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。

注:縱坐標(biāo)表示富集的分?jǐn)?shù),圖例中不同的顏色表示P值,富集程度越高顏色越紅

表4 腸黏膜單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中相關(guān)炎癥信號(hào)通路中差異基因

表5 外周血單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中相關(guān)炎癥信號(hào)通路中差異基因

3 討論

AS作為一種常見(jiàn)的自身免疫病,其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。其中,多種免疫細(xì)胞的功能紊亂和數(shù)量比例異常是AS發(fā)生關(guān)節(jié)外并發(fā)癥如腸炎的發(fā)病重要因素[19-20]。既往研究大多集中在骶髂關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)炎癥部位,且主要基于RNA測(cè)序或基因芯片技術(shù),研究AS關(guān)節(jié)組織整體基因表達(dá)模式改變,極少對(duì)關(guān)節(jié)外并發(fā)癥之一的腸炎的腸組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行闡述。在細(xì)胞亞群研究方面,既往研究多關(guān)注于AS外周血免疫細(xì)胞比例及功能,而對(duì)腸黏膜中免疫細(xì)胞的研究較少。Yang等[21]發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組相比,活動(dòng)期AS的免疫細(xì)胞的中央記憶和幼稚CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例增加,并且給予TNF-α拮抗劑治療后,可以負(fù)調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞比例,但對(duì)CD8+T細(xì)胞無(wú)明顯改善。Jiang等[22]研究發(fā)現(xiàn)AS患者的免疫細(xì)胞外周血分布中,在CD4+T亞群中,幼稚CD4+T細(xì)胞、中樞記憶CD4+T淋巴細(xì)胞和衰竭CD4+T細(xì)胞核的比例顯著增加,但終末分化CD4+T和效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞的水平在AS中顯著降低;AS患者的幼稚CD8+T細(xì)胞、中樞記憶性CD8+T淋巴細(xì)胞、效應(yīng)記憶性CD8+T細(xì)胞和耗盡的CD8+T細(xì)胞水平升高,但相對(duì)而言,終末分化的CD8+T細(xì)胞水平降低。Hanson等[23]對(duì)外周血的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞受體免疫測(cè)序,發(fā)現(xiàn)AS患者相對(duì)于健康對(duì)照組的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞具有更高的TCR多樣性。Komech等[24]具有特征性T細(xì)胞受體β鏈基序的CD8+T細(xì)胞在AS患者的血液和滑膜液中存在,并在滑膜液中擴(kuò)增。Qaiyum等[18]也發(fā)現(xiàn)成熟的CD8+T細(xì)胞在AS滑膜液中富集,具有表達(dá)整合素相關(guān)基因β7、CD103、CD29、CD49a。Gracey等[16]研究AS患者中CD8+T細(xì)胞的毒性特征發(fā)現(xiàn),在AS患者的外周血中相對(duì)于健康對(duì)照組,CD8+T細(xì)胞比例下降卻在關(guān)節(jié)滑膜液中比例增加,在刺激情況下會(huì)釋放更多的細(xì)胞毒素,包括Perforin、Granzyme B和Granulysin,對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)提示CD8+T細(xì)胞亞群可能在AS的病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Xu等[25]通過(guò)單細(xì)胞RNA-seq和ATAC-seq分析發(fā)現(xiàn)參與AS進(jìn)展的致病基因NF-κB起源于CD8+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞中的NF-κB、FOS、JUN和JUNB在AS組中存在差異。

在GEO公共數(shù)據(jù)的GSE163314原研究中,作者研究了外周血中表達(dá)顆粒酶B的成熟T細(xì)胞在識(shí)別AS合并CD、AS和CD之間的差異性。研究中的顆粒酶B是一種由NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞釋放的具有毒性作用的分子,在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)患者血液樣本進(jìn)行分析,作者發(fā)現(xiàn)AS合并CD患者中循環(huán)顆粒酶B陽(yáng)性的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的數(shù)量明顯高于AS和CD患者。此外,與研究中的健康對(duì)照組相比,作者發(fā)現(xiàn)所有疾病組中CD4和CD8譜系的PD-1+T細(xì)胞都有增加的趨勢(shì),有一部分個(gè)體的終末耗竭T細(xì)胞增加,提出CD4+和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞都可能參與AS合并 CD的發(fā)病機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)提示循環(huán)顆粒酶B+T細(xì)胞水平可作為一種潛在的生物標(biāo)志物,有助于區(qū)別AS合并CD與 AS和 CD。該研究還探索了IFN-γ信號(hào)通路在CD8+T細(xì)胞中富集情況,但尚未對(duì)與AS發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的TNF-α信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路的活性進(jìn)行研究。

為了驗(yàn)證CD8+T細(xì)胞數(shù)量比例在監(jiān)測(cè)、診斷AS合并腸炎的作用。本研究選取了具有臨床信息的腸黏膜芯片數(shù)據(jù),使用了CIBERSORT的反卷積算法進(jìn)行腸黏膜免疫細(xì)胞的“數(shù)字流式”分析。通過(guò)免疫浸潤(rùn)中的細(xì)胞比例對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞在腸黏膜中浸潤(rùn)是 SpA合并CD最顯著特征。并且在腸炎的炎癥程度方面與免疫浸潤(rùn)的程度相關(guān)。我們從初步的比例分析發(fā)現(xiàn)了SpA合并CD 多種免疫細(xì)胞類型的改變,包括CD4+記憶T淋巴細(xì)胞的亞群、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群。在正常的機(jī)體內(nèi),記憶性T細(xì)胞對(duì)抵抗病原微生物再次入侵、發(fā)生高效迅速的免疫應(yīng)答具有重要作用,如記憶CD4+T淋巴細(xì)胞在體內(nèi)呈現(xiàn)緩慢逐步的減少,而CD8+記憶T淋巴細(xì)胞則能在體內(nèi)保持穩(wěn)定的數(shù)目。推測(cè)在AS合并腸炎中,CD4+的記憶T細(xì)胞可能會(huì)受到腸道菌群紊亂、失衡,組織內(nèi)慢性炎癥的影響而出現(xiàn)數(shù)量的異常[26]。而在激活的CD4+記憶T細(xì)胞亞群的數(shù)量則呈現(xiàn)緩慢減少的趨勢(shì)。而AS患者組織中如腸黏膜、葡萄膜等部位的CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)分布及激活炎癥信號(hào)通路活性的目前研究較少。在IBD的研究中發(fā)現(xiàn),結(jié)腸固有層含有大量組織駐留的CD8+T細(xì)胞,這些細(xì)胞可能導(dǎo)致IBD的組織損傷[12]。Rosati等[27]發(fā)現(xiàn)一類新型非常規(guī)T細(xì)胞亞群在CD患者的腸道組織中顯著增加,表現(xiàn)出與CD8+T細(xì)胞的亞群有關(guān)的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄特征,提示這些細(xì)胞可能在CD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。

隨后,本研究使用芯片數(shù)據(jù)在AS合并CD以及AS之間進(jìn)行GSEA分析發(fā)現(xiàn)TNF-α信號(hào)通路、IFN-γ信號(hào)通路相關(guān)通路在AS合并CD的腸黏膜組織中均明顯富集,IL-17A信號(hào)通路則無(wú)明顯富集。單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的基因集活性評(píng)分發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的TNF-α信號(hào)通路、IFN-γ信號(hào)通路、IL-17A信號(hào)通路的通路活性在AS合并CD的患者中較AS無(wú)合并 CD的患者在外周血中均有不同程度的升高。而在腸黏膜中IL-17A信號(hào)通路激活并不明顯。單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的基因集活性評(píng)分驗(yàn)證了芯片數(shù)據(jù)中GSEA評(píng)分的結(jié)果。 TNF-α信號(hào)通路、IFN-γ信號(hào)通路參與了AS合并腸炎的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程,而IL-17A作為腸黏膜屏障的保護(hù)性因子僅起到輔助作用。隨后我們對(duì)炎癥信號(hào)通路中主要基因進(jìn)行差異分析,發(fā)現(xiàn)一些參與抗原結(jié)合呈遞的人類白細(xì)胞抗原(HLA)如HLA-DQA1、HLA-DRB1、HLA-DMA等基因在腸黏膜中上調(diào),提示腸黏膜中可能存在了抗原性物質(zhì)如自身抗原導(dǎo)致T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫識(shí)別和活化;參與信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的分子如CD74、CD83、IRF8、REL、NR4A1、DUSP2等基因在腸黏膜中上調(diào),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子與細(xì)胞功能。參與化學(xué)趨化性和細(xì)胞遷移的分子如SELL在腸黏膜中上調(diào), CCR7基因在外周血中表達(dá)上調(diào)與白細(xì)胞的定向運(yùn)動(dòng)和組織定位有關(guān)。其中,BANK1在AS合并CD組較AS無(wú)合并CD組中腸黏膜與外周血免疫細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。BANK1是一種參與B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì),影響B(tài)細(xì)胞的活化、分化、抗體產(chǎn)生和記憶細(xì)胞形成,調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng),研究發(fā)現(xiàn)BANK1的基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)[28]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)[29]和干燥綜合征(SS)[30-31]等疾病的遺傳易感性有關(guān)。然而,有研究對(duì)BANK1的三個(gè)易感SNP包括rs10516487、rs17266594、rs3733197進(jìn)行炎癥性腸病的關(guān)聯(lián)分析,但未觀察到 BANK1基因具有顯著關(guān)聯(lián)[32]。但AS合并CD的發(fā)病機(jī)制與典型的CD之間目前認(rèn)為不完全相同,仍需更多的研究對(duì)BANK1基因與AS合并CD的關(guān)系進(jìn)行深入研究。

然而,本研究存在以下不足:(1)用于數(shù)據(jù)分析的AS合并腸炎的相關(guān)數(shù)據(jù)集數(shù)量及樣本量較少;(2)沒(méi)有收集臨床樣本對(duì)CD8+T細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞亞群數(shù)量及功能驗(yàn)證。未來(lái)研究將會(huì)通過(guò)腸鏡檢查納入AS合并腸炎和AS無(wú)腸炎的患者進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)T細(xì)胞分群,對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分選后鑒定相關(guān)炎癥通路的核心基因、蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

總的來(lái)說(shuō),CD8+T細(xì)胞增多作為判斷AS合并CD的參考指標(biāo)值得進(jìn)一步研究,或許可用于評(píng)估AS患者腸道病變的情況?；蚣钚源蚍址治鲲@示在AS合并CD的患者中腸黏膜組織中TNF-α信號(hào)通路、IFN-γ信號(hào)通路活性升高,但在IL-17信號(hào)通路激活并不明顯。

利益相關(guān)聲明:所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明:羅錫慶負(fù)責(zé)完成數(shù)據(jù)分析、論文撰寫(xiě);古潔若為項(xiàng)目構(gòu)思、指導(dǎo)論文修改。