強(qiáng)直性脊柱炎患者骶髂關(guān)節(jié)MRI炎癥與外周血淋巴細(xì)胞的相關(guān)性

涂柳丹, 楊明燦, 魏秋靜, 王曉紅, 林楚榮, 古潔若

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科、廣東省免疫疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(廣東廣州 510630)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種免疫介導(dǎo)的累及骶髂關(guān)節(jié)和脊柱的慢性炎癥性疾病,其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。既往研究認(rèn)為與基因、環(huán)境因素等因素密切相關(guān),而先天性免疫和獲得性免疫失衡在AS的發(fā)病中也起到不容忽視的作用[1]。已有相關(guān)研究表明AS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群失衡是AS發(fā)病機(jī)制之一,其中Th17/Tregs細(xì)胞及Th1/Th2比例的失衡與AS的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[2],Th17細(xì)胞分泌的IL-17導(dǎo)致大量促炎癥因子的分泌,從而加重AS的炎癥反應(yīng)。隨著國際ASAS組織發(fā)布了新的中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)[3],把骶髂關(guān)節(jié)MRI骨髓水腫作為主診斷之一,實(shí)現(xiàn)了脊柱關(guān)節(jié)炎的影像學(xué)診斷從X線到MRI的跨越,使得患者的早期診斷、早期治療成為可能,極大地改善了患者的預(yù)后。炎癥作為AS的重要特點(diǎn)之一,除了表現(xiàn)為炎癥指標(biāo)的升高和MRI骨髓水腫外,可引起外周血免疫細(xì)胞的失衡。而生物制劑治療后隨著疾病癥狀、炎癥指標(biāo)及MRI骨髓水腫改善的同時(shí)伴隨著外周血淋巴細(xì)胞亞群的改變。因此,骶髂關(guān)節(jié)炎癥與外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化可能存在一定的關(guān)聯(lián),外周血淋巴細(xì)胞亞群分析在AS的疾病活動(dòng)度、炎癥及治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)可能有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前暫無研究探討AS患者骶髂關(guān)節(jié)MRI炎癥與外周血淋巴細(xì)胞亞群之間的關(guān)系。因此,本研究通過對(duì)AS患者和健康對(duì)照外周血中免疫細(xì)胞亞群的分析,并比較骶髂關(guān)節(jié)MRI炎癥與免疫細(xì)胞亞群失衡的關(guān)系,探討MRI炎癥與免疫細(xì)胞亞群之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2020—2021年期間在我院就診的AS患者42例為研究組,并選取同期在我院體檢的年齡及性別匹配的健康人群57例作為對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合1984年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn),診斷為AS;(2)年齡超過18歲,自愿參與研究并簽署知情同意書;(3)近3個(gè)月未接受任何生物制劑治療。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他免疫相關(guān)性疾病和風(fēng)濕性疾病;(2)妊娠期或哺乳期患者;(3)近3個(gè)月接種過疫苗或發(fā)生任何部位的感染。

本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(中大附三醫(yī)倫[2020]02-031-01),所有患者及健康對(duì)照均簽署知情同意書。

1.2 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下用肝素鈉抗凝管采集患者及健康對(duì)照者外周血5 mL用于淋巴細(xì)胞檢測(cè)。用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行外周血40種免疫細(xì)胞的免疫表型檢測(cè),包括28種T淋巴細(xì)胞和12種B淋巴細(xì)胞。根據(jù)說明書將全血加入熒光標(biāo)記抗體(CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-APC-H7、CD8-BV510、CD127-BV421、CD25 L-PE、CD45RAL-FITC、CCR7-AF647、CD28-PE-Cy7、CD3-APCH7、CD4-PE-Cy7、CD8-PerCP-Cy5.5、CD183-Alexa488、CD196-BV510、CD185-Alexa647、CD194-BV421和CD279-PE用于T細(xì)胞亞群檢測(cè);CD24L-PE和CD21-PE-Cy7用于B細(xì)胞亞群檢測(cè)) 的面板中進(jìn)行孵育,室溫黑暗條件下孵育15 min。待紅細(xì)胞溶解并離心后,用磷酸鹽緩沖鹽水懸浮液進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.3 AS患者骶髂關(guān)節(jié)MRI的炎癥評(píng)分 由2名獨(dú)立的放射科醫(yī)生進(jìn)行影像學(xué)評(píng)分,放射科醫(yī)生對(duì)臨床資料設(shè)盲,取平均分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用加拿大脊柱關(guān)節(jié)炎研究聯(lián)盟(Spondyloarthritis Research Consortium of Canada, SPARCC)炎癥評(píng)分進(jìn)行評(píng)估。選取骶髂關(guān)節(jié)MRI中T2加權(quán)序列和STIR序列進(jìn)行評(píng)估,以椎骨中心的骨髓信號(hào)作為正常信號(hào)的參考。最大總評(píng)分為72: 出現(xiàn)“骨髓水腫”=48,出現(xiàn)“強(qiáng)水腫”=12,出現(xiàn)“深水腫”=12。評(píng)分方法分為以下步驟:(1)所有評(píng)分分成兩種:有或無。(2)僅選擇6個(gè)連續(xù)斜冠狀層進(jìn)行評(píng)分,第4～9層面通常能顯現(xiàn)骶髂關(guān)節(jié)最大的滑膜部分。第2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分層面水平盡量與第1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相同,通常選擇4～9、3～8或5～10層。(3)僅對(duì)STIR序列中的異常進(jìn)行評(píng)分。T1SE圖像作為解剖學(xué)參考。(4)對(duì)髂骨的所有病變進(jìn)行評(píng)分。在骶骨側(cè),一般對(duì)遠(yuǎn)離骶骨骶前孔的側(cè)邊的病變?cè)u(píng)分。(5)以骶骨椎前孔間的骨髓信號(hào)作為正常信號(hào)的參考。(6)每側(cè)骶髂關(guān)節(jié)按關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)面的垂直線分成4個(gè)象限:上骶骨側(cè)、下骶骨側(cè)、上髂骨側(cè)、下髂骨側(cè)。記錄每個(gè)象限的信號(hào)增加情況。每個(gè)冠狀層面的兩側(cè)骶髂關(guān)節(jié)的最大評(píng)分是8。6個(gè)層面的最大評(píng)分是48。(7)對(duì)每層每側(cè)骶髂關(guān)節(jié)進(jìn)行“強(qiáng)度”評(píng)分。在對(duì)骨病變進(jìn)行“強(qiáng)度”評(píng)分時(shí)以骶骨旁靜脈里緩慢流動(dòng)的靜脈血的高信號(hào)為參考。如果在每側(cè)骶髂關(guān)節(jié)的任何象限中觀察到“強(qiáng)”信號(hào),評(píng)1分。每個(gè)層面的最大評(píng)分為2,6個(gè)層面的最大評(píng)分為12。(8)對(duì)每層每側(cè)骶髂關(guān)節(jié)進(jìn)行“深度”評(píng)分。如果距關(guān)節(jié)表面至少1 cm的深度內(nèi)出現(xiàn)均勻的明確的信號(hào)增加,則病變分級(jí)為“深”。如果在單層一側(cè)骶髂關(guān)節(jié)的任何象限中觀察到“深”信號(hào),評(píng)分為1。每個(gè)層面的最大評(píng)分為2,6個(gè)層面的最大評(píng)分為12。

1.4 病情活動(dòng)度的評(píng)估 采用Bath強(qiáng)直性脊柱炎活動(dòng)性指數(shù)(BASDAI)評(píng)估AS患者的疾病活動(dòng)度,總分為0～10分,分?jǐn)?shù)越高表示病情越活動(dòng)。采用Bath強(qiáng)直性脊柱炎功能指數(shù)(BASFI)評(píng)估AS患者的綜合功能狀況,總分為0～10分,分?jǐn)?shù)越高表示功能越差。AS疾病活動(dòng)度評(píng)分(ASDAS)是ASAS推薦的復(fù)合評(píng)分系統(tǒng),綜合患者的主觀評(píng)價(jià)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),ASDAS-CRP的計(jì)算公式為0.121×腰背痛(BASDAI第2項(xiàng))+0.058×晨僵時(shí)間(BASDAI第6項(xiàng))+0.11×患者總體評(píng)價(jià)+0.073×外周關(guān)節(jié)疼痛或腫脹(BASDAI第3項(xiàng))+0.579×Ln(CRP+1)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),同組治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25,P75)]表示,采用秩和檢驗(yàn)比較兩組差異;計(jì)數(shù)資料采用百分比表示,采用2檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均采用STATA 16.0軟件分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者及對(duì)照組的人口學(xué)特點(diǎn)及病情特點(diǎn) 本研究共納入42例AS患者和年齡及性別匹配的健康對(duì)照57例。AS患者年齡為(32.09±1.72)歲,其中男35例(83.33%),病程(8.86±8.09)年,BASDAI及ASDAS-CRP均值分別為3.11±1.72和2.45±0.91。對(duì)照組男性占比為70.18%,年齡為(35.61±1.39)歲,兩組的年齡及性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 研究組與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞百分比差異 與對(duì)照相比,研究組的殺傷T細(xì)胞(Tc)比例升高,而雙陽性T細(xì)胞比例下降,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。不同亞類的CD4+T細(xì)胞比例在研究組和對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在CD8+T細(xì)胞中,AS患者外周血初始化CD8+T細(xì)胞(CD3+CD8+CD45RA+CCR7+)及持續(xù)表達(dá)病毒特異性CD8+T細(xì)胞比例較健康對(duì)照升高,而終末分化CD8+T細(xì)胞和非活躍期特異性終末分化CD8+T細(xì)胞比例較健康對(duì)照降低(P<0.05)。在T輔助細(xì)胞(Th)中和濾泡輔助T細(xì)胞(Tfh)中,AS患者的Th17細(xì)胞、Tfh17細(xì)胞及Th17/Th2比例顯著高于健康對(duì)照,Th1和Tfh1細(xì)胞低于健康對(duì)照(P<0.05)。

表1 強(qiáng)直性脊柱炎患者與健康對(duì)照不同T細(xì)胞比例的差異 M(P25,P75)

2.3 研究組與對(duì)照組B淋巴細(xì)胞百分比差異 研究組患者的B細(xì)胞比例與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在不同B淋巴細(xì)胞亞型中,研究組患者的經(jīng)典轉(zhuǎn)換性B細(xì)胞比例高于對(duì)照組,而幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞、未成熟的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及轉(zhuǎn)換B細(xì)胞的比例顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 強(qiáng)直性脊柱炎與對(duì)照組不同B細(xì)胞比例的差異 M(P25,P75)

2.4 AS患者骶髂關(guān)節(jié)炎癥與外周血淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系 通過SPARCC評(píng)分評(píng)估AS患者的骶髂關(guān)節(jié)MRI炎癥水平,將SPARCC≥2作為定義炎癥的分界點(diǎn),分為炎癥組和無炎癥組。炎癥組患者的年齡及病程顯著低于無炎癥組,C反應(yīng)蛋白(CRP)和ASDAS水平高于無炎癥組,兩組在BASDAI、BASFI方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。兩組患者的B淋巴細(xì)胞亞群和CD8+T細(xì)胞亞群差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在CD4+T細(xì)胞亞群中,炎癥組患者的幼稚CD4+T細(xì)胞比例高于無炎癥組,而衰竭CD4+T細(xì)胞、功能性CD4+T細(xì)胞和效應(yīng)性記憶CD4+T細(xì)胞低于無炎癥組(圖1)。

表3 AS患者骶髂關(guān)節(jié)MRI炎癥 M(P25,P75)

圖1 AS患者骶髂關(guān)節(jié)MRI炎癥與CD4+T細(xì)胞亞群的關(guān)系

3 討論

既往研究表明AS的發(fā)病與HLA-B27、細(xì)胞免疫、腸道微生物等密切相關(guān),其中IL-17/IL-23軸的異?；罨cAS特異性肌腱端炎相關(guān)[4],在一定程度上可以解釋AS炎癥、異常骨化和骨質(zhì)丟失[5]。IL-17/IL-23軸的異?；罨婕岸喾N免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的相互作用。幼稚CD4+T細(xì)胞在不同的條件下可分化為Th細(xì)胞、Treg細(xì)胞等,IL-23對(duì)Th細(xì)胞分化為Th17表型至關(guān)重要,而Th17細(xì)胞可分泌IL-17、IL-22、GM-CSF和TNF等細(xì)胞因子[6]。其中IL-17A是一種強(qiáng)力促炎細(xì)胞因子,可通過介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生RANKL和促進(jìn)破骨細(xì)胞表面的RANK的表達(dá)介導(dǎo)骨侵蝕。Th17細(xì)胞比例及促進(jìn)Th17細(xì)胞增殖及分化的細(xì)胞因子在AS患者中均顯著升高,靶向IL-17A的拮抗劑在AS的治療中起到良好的治療效果,從另一方面驗(yàn)證了Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在AS發(fā)病中的重要性。HLA-B27基因被認(rèn)為與AS發(fā)病關(guān)聯(lián)最密切的基因,人群中AS的發(fā)病率與HLA-B27陽性率相關(guān)。HLA-B27陽性與陰性AS患者淋巴細(xì)胞亞群比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而HLA-B2705型AS患者T%、Th%、Th/Ts顯著升高,B1%、NK%顯著低于HLA-B2704型患者[7]。因此,T淋巴細(xì)胞異?；罨?、淋巴細(xì)胞亞群比例失衡及細(xì)胞免疫功能異常在AS的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)AS患者外周血和關(guān)節(jié)中致病性Th17、Th22細(xì)胞和分泌IL-17的γδ細(xì)胞異常升高。最近的一項(xiàng)Meta分析納入4 020例AS患者和3 065例健康對(duì)照,發(fā)現(xiàn)AS患者的T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞與健康對(duì)照無明顯差異,而B細(xì)胞顯著高于健康對(duì)照。在T細(xì)胞亞群中,CD4+T細(xì)胞、Th17細(xì)胞、T輔助細(xì)胞及Th1/Th2比例顯著升高,而Treg細(xì)胞比例下降[9]。Treg細(xì)胞有負(fù)性調(diào)節(jié)作用,通過抑制效應(yīng)性T細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)外周免疫耐受,有研究顯示AS患者外周血Th17/Treg比例升高,而經(jīng)TNFi有反應(yīng)的患者中,觀察到Th17細(xì)胞比例下降,Treg比例升高[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)AS患者CD8+T細(xì)胞亞群和B淋巴細(xì)胞亞群與健康對(duì)照存在差異,提示AS患者免疫功能存在一定程度的紊亂,包括細(xì)胞免疫和體液免疫功能失衡,可能在AS的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。此外,T輔助細(xì)胞中,AS患者Th17比例升高,Th1比例下降,與既往研究[11]相符,同時(shí)也驗(yàn)證了Th17細(xì)胞在AS發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

炎癥及異常骨化是AS病程中兩個(gè)重要的過程,且炎癥與骨化有一定的關(guān)聯(lián),炎癥可通過多種信號(hào)通路促進(jìn)骨化。炎癥指標(biāo)如CRP和紅細(xì)胞沉降率可作為AS進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子,而脊柱MRI椎角炎癥較無炎癥椎體更容易產(chǎn)生新發(fā)骨贅。既往研究表明慢性系統(tǒng)性炎癥可引起血細(xì)胞水平變化,AS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的失衡被認(rèn)為與疾病活動(dòng)度顯著相關(guān)[12-13]。一項(xiàng)在早期脊柱關(guān)節(jié)炎患者進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn),CT引導(dǎo)下骶髂關(guān)節(jié)穿刺的組織病理學(xué)提示T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是活動(dòng)性骶髂關(guān)節(jié)炎中最常見的細(xì)胞,提示T細(xì)胞浸潤在AS骶髂關(guān)節(jié)炎中起到重要作用[14]。然而MRI骨髓水腫與組織病理學(xué)炎癥并非完全一致,有研究[15]探討脊柱組織病理學(xué)間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤和骨髓水腫的關(guān)系,病理發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞及CD20+B細(xì)胞在局部組織浸潤,但8例患者中僅3例的關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)組織病理學(xué)炎癥與MRI骨髓水腫相符。另一項(xiàng)研究采用髖關(guān)節(jié)Bath強(qiáng)直性脊柱炎放射學(xué)指數(shù)和強(qiáng)直性脊柱炎脊柱放射學(xué)評(píng)分來評(píng)估新骨形成,發(fā)現(xiàn)AS患者中新骨形成與MRI炎癥呈反比,新骨形成患者中Th17比例和Treg比例高于無新骨形成患者,Th17/Treg比例低于無新骨形成患者[16]。這提示MRI炎癥、新骨形成伴隨著外周血淋巴細(xì)胞亞群比例失衡。已有充分的數(shù)據(jù)證明TNFi治療能有效改善AS患者骶髂關(guān)節(jié)MRI炎癥[17]。兩項(xiàng)研究表明AS患者經(jīng)TNFi或IL-17A抗體治療后,在改善炎癥指數(shù)的同時(shí),外周血淋巴細(xì)胞亞群失衡得以改善[10, 18]。本研究發(fā)現(xiàn)MRI炎癥與外周血B淋巴細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞亞群比例無關(guān),而炎癥組患者的幼稚CD4+T細(xì)胞比例高于無炎癥組,衰竭CD4+T細(xì)胞、功能性CD4+T細(xì)胞和效應(yīng)性記憶CD4+T細(xì)胞低于無炎癥組。這提示MRI炎癥與外周血淋巴細(xì)胞亞群存在一定的關(guān)聯(lián),而靶向腫瘤壞死因子-α或IL-17A的治療能否同時(shí)改善MRI炎癥和淋巴細(xì)胞失衡,需要后續(xù)研究來進(jìn)一步揭示MRI炎癥與淋巴細(xì)胞亞群失衡之間更進(jìn)一步的關(guān)系。

綜上所述,AS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分布異常,存在細(xì)胞免疫和體液免疫功能紊亂,伴骶髂關(guān)節(jié)MRI炎癥的患者CD4+T細(xì)胞比例與無炎癥的患者存在差異,這提示炎癥在不同的層面上參與到AS的發(fā)病中。

利益相關(guān)聲明:所有作者聲明無可能影響研究結(jié)果的非財(cái)務(wù)沖突關(guān)系,或可能影響本文研究結(jié)果和討論的競爭利益。

作者貢獻(xiàn)說明:涂柳丹直接參與本論文的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究實(shí)施、數(shù)據(jù)采集、統(tǒng)計(jì)分析,論文起草、研究經(jīng)費(fèi)的獲得和批評(píng)性審閱;楊明燦參與試驗(yàn)設(shè)計(jì)、患者隨訪、數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)分析及論文起草及修改;魏秋靜參與患者隨訪、數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)分析及論文起草及修改;王曉紅參與閱片、統(tǒng)計(jì)分析及論文起草及修改;林楚榮參與閱片、統(tǒng)計(jì)分析及論文起草及修改;古潔若提供技術(shù)支持,對(duì)論文的內(nèi)容進(jìn)行批評(píng)性審閱,對(duì)論文進(jìn)行指導(dǎo)和支持。