菊苣多糖對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠的影響

阿麗米熱·買買提 吾買爾江·牙合甫 王曉杰 馬雪連 夏利寧 姚剛

摘要 [目的]探究菊苣多糖對糖尿?。―M）模型小鼠肝臟氧化應(yīng)激的緩解作用。[方法]采用乙醇提取法從菊苣種子中提取多糖，采用苯酚-硫酸法測定多糖，并測試DPPH自由基清除作用。采用四氧嘧啶復(fù)制小鼠DM模型，取48只DM小鼠隨機(jī)分組為四氧嘧啶模型組（ALX）、鹽酸二甲雙胍陽性組（ALX+M）、菊苣多糖低劑量組（ALX+L）、菊苣多糖高劑量組（ALX+H），每組12只；另取12只健康小鼠作為正常對照組（NC）；每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥15 d。末次給藥后，采集血清測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血糖、肌酐以及小鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT），觀察小鼠肝、腎、胰腺、睪丸等組織病理變化。[結(jié)果]菊苣種子多糖提取率為39%，具有一定的清除DPPH自由基作用；四氧嘧啶能引起小鼠血清ALT、AST、血糖、肌酐指標(biāo)上升（P<0.01），肝臟、腎臟組織發(fā)生肝細(xì)胞排列紊亂、肝小葉結(jié)構(gòu)破壞、腎小球萎縮、間質(zhì)增大等病理變化。菊苣多糖高劑量組（ALX+H）具有明顯改善小鼠體重、臟器指數(shù)，緩解肝組織GSH、SOD、CAT水平（P<0.05），明顯改善肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，睪丸組織病理學(xué)變化趨向NC組。[結(jié)論]菊苣多糖具有一定的抗氧化應(yīng)激作用。

關(guān)鍵詞 菊苣多糖；四氧嘧啶；糖尿??；抗氧化應(yīng)激

中圖分類號 Q539 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）02-0156-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.035

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effect of Chicory Polysaceharide on Alloxan Induced Diabetes in Mice

Almira Mamat，Omar Yakup，WANG Xiao-jie et al

（College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052）

Abstract [Objective]To explore the alleviating effect of chicory polysaccharide on hepatic oxidative stress in diabetes （DM） model mice.[Method]The alcohol extraction was used to extract the polysaccharides from chicory seeds，the phenol-sulfuric acid method was used to determine the polysaccharides，and the DPPH radical-scavenging effect was tested.Using alloxan to replicate a mouse DM model，48 DM mice were randomly divided into alloxan model group （ALX），metformin hydrochloride positive group （ALX+M），chicory polysaccharide low dose group （ALX+L），chicory polysaccharide high dose group （ALX+H） with 12 mice in each group;another 12 healthy mice were taken as the normal control group （NC）;the drug was administered by gavage once a day for 15 consecutive days.After the last administration，serum was collected to measure ALT，AST，blood glucose，creatinine，as well as oxidative stress indicators such as MDA，SOD，GSH，CAT in mouse liver tissue，and the pathological changes of liver，kidney，pancreas，testis and other tissues were observed.[Result]The extraction rate of polysaccharides from chicory seeds was 39%，and DEEP radical-scavenging showed the good free radical scavenging ability.Alloxan could cause the increase of serum ALT，AST，blood glucose，creatinine in mice （P < 0.01），liver and kidney tissue to have pathological changes such as liver cell disorder，liver lobule structure destruction，glomerular atrophy，interstitial enlargement，etc.Chicory polysaccharide high dose group （ALX+H） significantly improved the weight and organ index of mice，alleviated the GSH，SOD，CAT levels of liver tissue （P<0.05），significantly improved the morphology and structure of liver tissue，and the pathological changes of testicular tissue tended to NC group.[Conclusion]The chicory polysaccharide had a certain antioxidant stress effect.

Key words Chicory polysaceharide;Alloxan;Diabetes;Anti-oxidant stress

基金項目 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（2019D01B23）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201910758026）。

作者簡介 阿麗米熱·買買提（1999—），女，維吾爾族，新疆哈密人，碩士研究生，研究方向：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。*通信作者，講師，碩士，從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究。

收稿日期 2023-02-28

菊苣（Cichorium intybus L.）主要分布于我國西北和東北各省，新疆民間全草（根、莖、葉、種子）入藥，味微苦、咸，性涼，主要應(yīng)用于肝炎、膽囊炎等疾病的治療。菊苣多糖（chicory polysaceharide，CPS）作為菊苣中重要的活性成分之一，具有降血脂、抗腫瘤、延緩衰老、抗疲勞、促進(jìn)鈣和磷吸收的作用，也是安全有效的嬰兒營養(yǎng)補(bǔ)充劑。前期研究證實，菊苣粗提物對對乙酰氨基酚的肝毒性具有一定的保護(hù)作用，對肝臟細(xì)胞色素CYP2E1酶具有良好的調(diào)節(jié)作用。目前針對糖尿病寵物（犬）緩解肝、腎臟損傷、酮癥酸中毒、胰腺炎等癥狀的中草藥復(fù)方制劑研究較少，因此尋找安全、有效的中草藥物是一項重要工作。該試驗以糖尿病小鼠為模型，探究菊苣多糖對肝組織氧化應(yīng)激的緩解作用，同時觀察腎臟、胰腺、睪丸組織病理變化，為后期研發(fā)寵物口服類安全、有效的天然藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

1.1.1 實驗動物及飼料。清潔級昆明小鼠，雄性，體重18～25 g，飼料為鼠固態(tài)顆粒飼料，均購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號為SYXK（新）2013-0002]。受試動物置于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院實驗動物中心進(jìn)行飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)條件為飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度55%～60%，12 h晝夜交替，飼養(yǎng)清潔，自由飲水。

1.1.2 藥品和試劑。菊苣種子均采購自新疆哈密阿薩爾生物科技有限公司；生理鹽水（恒寧醫(yī)療器械有限公司）；四氧嘧啶（ALX）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）購自上海源葉生物科技有限公司；鹽酸二甲雙胍（山東博山制藥有限公司）；血糖、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及蛋白試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析液。

1.1.3 儀器。TDL-40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；V1900紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；傅立葉變換紅外儀（北京安洲科技有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HTX多功能微孔板檢測儀（美國伯騰儀器有限公司）；三諾安穩(wěn)血糖測試儀（長沙三諾生物有限公司）；常規(guī)耗材由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)新疆草食動物新藥研究與創(chuàng)制重點實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取菊苣多糖及紅外光譜分析。菊苣種子粉碎，精準(zhǔn)稱取100 g，與蒸餾水以1∶15比例混勻，70 ℃冷凝回流2 h，真空抽濾，收集濾液；藥渣按料液比1∶10比例混勻，70 ℃冷凝回流1.5 h，真空抽濾，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液至1 g/mL，采用Sevage法脫蛋白，凍干備用。采用苯酚-硫酸顯色法測定菊苣多糖含量，使用紫外分光光度計在490 nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X）、吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。多糖的紅外測試采用KBr壓片法進(jìn)行制樣，將純化的多糖置于瑪瑙研缽中與KBr混合均勻后壓成薄片，利用DTGS KBr檢測器分別在中紅外、近紅外和遠(yuǎn)紅外進(jìn)行掃描。

1.2.2 菊苣多糖對DPPH自由基的清除試驗。參照文獻(xiàn)[2]精確稱取DPPH 0.007 9 g于100 mL甲醇定容，將NAC、檢測樣品配制成不同梯度的待測樣品液，517 nm波長測定吸光度并記錄，計算IC值。

1.2.3 糖尿病模型和驗證。參照文獻(xiàn)[6]腹腔注射四氧嘧啶100 mg/kg，72 h后血糖儀測量空腹血糖，如其值＞11.10 mmol/L可判定造模成功。為防止出現(xiàn)偶然性高血糖癥狀，繼續(xù)飼養(yǎng)14 d，末日采血前12 h禁食不禁水，給藥2 h后麻醉小鼠，心臟采血，摘取腎臟、肝臟等組織進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.4 試驗設(shè)計。試驗共分為5組，包括NC（正常對照組）、ALX（四氧嘧啶模型組）、ALX+M（鹽酸二甲雙胍陽性組，125 mg/kg）、ALX+L（菊苣多糖低劑量組，150 mg/kg）、ALX+H（菊苣多糖高劑量組，300 mg/kg）；各組小鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水；每日定時給藥1次，連續(xù)飼養(yǎng)15 d，每隔3 d稱重并記錄。

1.2.5 血清生化指標(biāo)測定。2%戊巴比妥鈉腹腔注射（1 mL/kg）麻醉小鼠，眼球采血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，參照試劑盒說明書操作方法測定ALT、AST、血糖、肌酐指標(biāo)。

1.2.6 肝臟生化指標(biāo)測定。參照試劑盒說明書操作方法測定MDA、SOD、GSH、CAT和蛋白質(zhì)的含量。

1.2.7 組織病理學(xué)檢查。肝臟、胰腺、腎臟、睪丸等組織進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.3 統(tǒng)計分析 試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Origin 19軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊苣多糖含量測定和紅外光譜分析 如圖1所示，經(jīng)計算菊苣種子多糖提取率為39%。采用紅外光譜進(jìn)行掃描，波形3 379～3 383 cm出現(xiàn)吸收峰，其為O—H的伸縮振動峰，波形1 606～1 616 cm出現(xiàn)CO伸縮振動峰，波形601～602和1 033～1 102 cm出現(xiàn)喃型糖的特征吸收峰。

2.2 菊苣多糖對DPPH自由基的清除作用 從圖2可以看出，隨著菊苣多糖濃度增加其清除DPPH自由基能力逐漸增強(qiáng)；菊苣多糖達(dá)到最大清除率70%時，濃度為1.0 mg/mL，而NAC為1.0 mg/mL時，清除率為97%，表明菊苣多糖具有一定的清除DPPH自由基作用。

2.3 小鼠糖尿病模型的建立和驗證

2.3.1 模型小鼠的建立和血清生化指標(biāo)。如表1所示，與對照組（NC）相比，模型組試驗小鼠血糖（22.00 mmoI/L）、肌酐（17.63 μmol/L）、AST（156.33 U/L）、ALT（122.41 U/L）差異極顯著（P<0.01）。

2.3.2 模型小鼠肝臟、腎臟病理組織學(xué)變化。

如圖3所示，試驗小鼠病理組織學(xué)變化中ALX模型組肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞胞漿疏松呈空泡樣，細(xì)胞核染色加深；腎臟腎小球萎縮，間質(zhì)增大，提示炎癥反應(yīng)，表明該模型建立有效。

2.4 菊苣多糖對糖尿病模型小鼠體重的影響 從圖4可以看出，NC組小鼠體重隨灌胃天數(shù)的增加出現(xiàn)上升趨勢，末次體重為（28.92±5.27）g，體重增量提示正常，但與ALX[（17.75±5.56） g]、ALX+M[（22.20±1.64） g]差異顯著（P<0.05）；與NC組相比，ALX小鼠體重呈下降趨勢，其中第7天變化最明顯；ALX+M與ALX+L、ALX差異顯著（P<0.05）。從圖5可以看出，小鼠肝臟稱重變化中NC組與ALX、ALX+L組差異顯著（P<0.05），但與ALX+M、ALX+H組差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 菊苣多糖對肝組織抗氧化指標(biāo)的影響 從表2可以看出，與NC組相比，ALX組血清中CAT、SOD、GSH活性以及MDA含量差異顯著（P<0.05），表明四氧嘧啶能引起小鼠肝組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。與ALX組相比，ALX+M組血清中GSH、CAT、SOD活性以及MDA含量差異顯著（P<0.05）；ALX+M組與ALX+H組血清中GSH、CAT、SOD活性差異不顯著（P＞0.05），表明菊苣多糖在一定劑量范圍內(nèi)具有明顯的抗氧化應(yīng)激作用。

2.6 組織病理變化 如圖6所示，對照組（NC）肝臟、胰腺、腎臟和睪丸組織無異常變化，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊；肝臟病理組織中ALX+L組肝小葉變大、中央靜脈增大，而ALX+H組肝組織巨噬細(xì)胞增多，形態(tài)較規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)趨向于對照組。胰腺病理組織中ALX組胰腺出現(xiàn)少量的炎性細(xì)胞，形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞排列緊密。ALX+L、ALX+H組胰腺腺泡出現(xiàn)炎性浸潤現(xiàn)象，胰島形狀不規(guī)則、模糊、萎縮現(xiàn)象，該結(jié)果提示菊苣多糖150、300 mg/kg對胰島細(xì)胞作用不明顯。腎臟病理組織變化中，ALX+L、ALX+H組近曲小管、腎小球發(fā)生萎縮現(xiàn)象，輪廓不清晰。睪丸病理組織變化中，ALX組睪丸組織精子細(xì)胞數(shù)量少；ALX+L組睪丸細(xì)胞排列紊亂，曲細(xì)精管間隙增大；ALX+H組間質(zhì)組織改善，趨向?qū)φ战M形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3 討論與結(jié)論

氧化應(yīng)激是指當(dāng)機(jī)體受到各種有害刺激時，體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧自由基（ROS）、活性氮自由基（RNS）及活性氯物質(zhì)（RCS）等高活性分子，抗氧化能力不能滿足對機(jī)體氧化物的清除，氧化能力與抗氧化能力失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。糖尿病能引起肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激損傷并誘導(dǎo)發(fā)生消化系統(tǒng)疾病，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，糖原、脂質(zhì)在肝臟堆積，胰島素抵抗伴有低度慢性炎癥產(chǎn)生，最終肝微血管病變形成脂肪肝，嚴(yán)重形成肝硬化。此外，糖尿病可間接引起腎組織氧化應(yīng)激損傷，抑制局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性，影響血管緊張素 Ⅱ（Angiotensin Ⅱ）水平。自由基又稱“游離基”，其在機(jī)體中處于動態(tài)平衡，正常情況下于機(jī)體有益，過量則會引起正常細(xì)胞的氧化損傷、代謝異常等，進(jìn)而引起多種疾病，如心臟病、肝硬化、癌癥等。篩選某一種活性物質(zhì)是否具有抗氧化應(yīng)激方面的研究價值，可在體外模型中初步篩查。目前研究自由基清除的方法主要有體內(nèi)和體外2種模型，而DPPH法是目前體外模型中最常用的方法。該試驗研究表明菊苣多糖具有一定的自由基清除能力，清除能力隨濃度上升而增強(qiáng)。四氧嘧啶在動物體內(nèi)可產(chǎn)生自由基，破壞胰腺β細(xì)胞，降低胰島素水平，發(fā)生酶促或非酶促分解產(chǎn)生自由基，自由基作用于肝臟，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞膜、線粒體受損，此外還可引起腎小管損傷，最終造成肝、腎等組織出現(xiàn)中毒性病變，因此，四氧嘧啶用于肝損傷模型藥物。該試驗采用腹腔注射四氧嘧啶法建立模型，結(jié)果顯示，與NC組相比，ALX小鼠血液血糖、肌酐、ALT、AST顯著變化（P<0.01），指標(biāo)均接近標(biāo)準(zhǔn)模型水平，肝、腎組織出現(xiàn)明顯的病理變化。

在生理情況下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基的氧化系統(tǒng)和清除自由基的抗氧化系統(tǒng)處于穩(wěn)態(tài)，保持相對平衡。在病理情況下，氧化能力增強(qiáng)，自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)增強(qiáng)，產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致機(jī)體生物膜脂質(zhì)過氧化、DNA氧化損傷、蛋白質(zhì)變性并引起機(jī)體組織損傷。高血糖引起氧自由基增多，造成肝臟、肌肉、脂肪對胰島素產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致膀島素分泌不足，外周組織對葡萄糖利用率下降，嚴(yán)重者可引起繼發(fā)癥。目前將一氧化氮、一氧化氮合酶、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶認(rèn)定為氧化應(yīng)激的參考指標(biāo)，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的參考作用。付愛葉等報道顯示菊苣多糖具有很強(qiáng)的抗氧化能力和抗疲勞作用。許芳研究發(fā)現(xiàn)菊苣多糖具有明顯的降脂保肝作用。蘇丹等研究證實菊苣多糖可降低糖尿病大鼠的自由進(jìn)食血糖、空腹血糖，具有明顯的抗糖尿病作用，對糖尿病大鼠心肌缺血再灌注具有一定的保護(hù)作用。王喜民研究發(fā)現(xiàn)菊苣多糖可通過抗過氧化作用，抑制血漿內(nèi)皮素（ET-1）、C反應(yīng)蛋白（CRP）水平，緩解糖尿病腎病大鼠微血管病變的發(fā)生。吳雨龍等研究報道菊苣多糖能明顯提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力以及血清溶血素含量，具有增強(qiáng)免疫活性作用。該試驗結(jié)果顯示，小鼠體重變化中ALX組與NC、ALX+L、ALX+H組差異顯著（P<0.05）；肝臟重量變化中NC組與ALX組差異顯著（P<0.05），與ALX+M、ALX+H組無差異顯著（P＞0.05）。ALX組CAT、SOD、GSH水平降低（P<0.05），MDA含量明顯增高（P<0.05），提示糖尿病導(dǎo)致小鼠肝臟抗氧化能力受損，器官處于氧化脅迫狀態(tài)。ALX+H組對肝臟具有明顯的抗氧化能力（P＞0.05）。研究證實四氧嘧啶能降低肝、腎功能，引起糖代謝異常、糖原堆積、組織炎性改變和纖維化，甚至引起肝細(xì)胞壞死，該試驗中ALX+H能明顯改善肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。高血糖引起腎閾值上升，改變腎臟血流動力學(xué)，紊亂引致腎臟損害。該試驗觀察了腎、胰腺、睪丸等組織病理變化，結(jié)果表明，ALX組腎小球、近曲小管萎縮，輪廓不清晰等，與腎病損傷等級對比ALX組已達(dá)到腎損傷 Ⅱ 級水平，但ALX+M、ALX+L、ALX+H組無明顯保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，四氧嘧啶對睪丸產(chǎn)生一定的毒性反應(yīng)，導(dǎo)致糖基化增強(qiáng)，體內(nèi)動態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，造成睪丸組織損傷；糖尿病導(dǎo)致男性睪酮水平下降、生精障礙，女性下丘腦-垂體卵巢軸受損。該試驗研究表明ALX+H組睪丸組織病理變化趨向NC組，可能抑制氧自由基反應(yīng)，改善睪丸組織；菊苣多糖對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠能起到一定的抗氧化作用，有待進(jìn)一步研究作用機(jī)制。此外，該研究結(jié)果為后期研發(fā)寵物口服類安全、有效、無毒副作用的中草藥制劑提供了科學(xué)理論依據(jù)。

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