周氏嚙小蜂CcGSTS1基因的克隆·蛋白表達純化及酶學特征分析

覃東玉 任睿 孫美娣 李敏 潘麗娜

摘要 鑒定一個編碼周氏嚙小蜂谷胱甘肽S-轉移酶序列的全長基因CcGSTS1，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該基因與麗蠅蛹集金小蜂NvGSTS6基因具有高同源性。體外表達、純化的重組CcGSTS1可催化CDNB與GSH結合，最適反應pH為7.0。該試驗為進一步研究周氏嚙小蜂CcGSTS1基因功能奠定基礎。

關鍵詞 周氏嚙小蜂；谷胱甘肽S-轉移酶；系統(tǒng)發(fā)育分析；酶活

中圖分類號 Q965.9 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）02-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.019

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning，Expression，Purification and Enzyme Activity of CcGSTS1 from Chouioia cunea Yang

QIN Dong-yu，REN Rui，SUN Mei-di et al

（Tianjin Normal University/Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Utilization and Protection，Tianjin 300387）

Abstract In this study，we characterized a full-length gene encoding GST sequences CcGSTS1 from C.cunea.Phylogenetic analysis showed that CcGSTS1 shared the highest identity with NvGSTS6 of Nasonia vitripennis.The recombinant CcGSTS1 showed glutathione-conjugating activity toward CDNB （1-chloro-2，4-dinitrobenzene） and GSH （Glutathione）.The optimal reaction pH value is 7.0.This study provides a foundation for further study on the function of CcGSTS1 gene in C.cunea.

Key words Chouioia cunea Yang;Glutathione S-transferases;Phylogenetic analysis;Enzyme activity

基金項目 天津市教委科研計劃項目（2019KJ089）。

作者簡介 覃東玉（1997—），女，廣西來賓人，碩士研究生，研究方向：昆蟲學。*通信作者，副教授，博士，從事昆蟲學研究。

收稿日期 2023-02-06

昆蟲的宿主適應性及殺蟲劑抗性與解毒代謝相關蛋白密切相關，主要包括ABC轉運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC）、細胞色素p450（cytochrome P450s，P450s）、羧酸酯酶（carboxylesterases，CarEs）和谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione s-transferases，GSTs）。谷胱甘肽S-轉移酶催化谷胱甘肽（glutathione，GSH）與底物結合，增加代謝產物的水溶性，促進其排出體外。根據谷胱甘肽S-轉移酶在細胞內的位置，GSTs可分為3類：胞質GSTs、微粒體GSTs和線粒體GSTs。迄今為止，在昆蟲中只發(fā)現(xiàn)了胞質GSTs與微粒體GSTs，胞質GSTs通常被分為至少6類：Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta。普遍存在于原核生物和真核生物中谷胱甘肽S-轉移酶，除對內源性和外源性化合物的解毒作用以外，還參與多種細胞生理生化反應，如胞內物質運輸、激素的生物合成和抗氧化應激等。此外，谷胱甘肽S-轉移酶可作為氣味降解酶，在昆蟲嗅覺感受系統(tǒng)中降解氣味分子，如玉米象（Sitophilus zeamais）的SzeaGSTd1可能通過降解宿主揮發(fā)物中的辛醇，從而輔助定位宿主，煙草天蛾（Manduca sexta）觸角的性信息素敏感感受器中具有觸角特異性表達GST，可能通過滅活醛類氣味分子來保護嗅覺系統(tǒng)。

蛹寄生蜂周氏嚙小蜂（Chouioia cunea Yang）是楊忠岐等在我國篩選出的一種對美國白蛾具有高寄生率的天敵昆蟲，在美國白蛾的生物防治中起著關鍵作用。有關周氏嚙小蜂的室內繁育，蜂種復壯，不同溫濕度對小蜂寄生率、發(fā)育歷期、成蜂壽命的影響等方面均已有詳盡研究，但有關其對殺蟲劑的解毒代謝分子機制尚缺乏研究。Li等在周氏嚙小蜂嗅覺分子機制研究中發(fā)現(xiàn)，美國白蛾蛹揮發(fā)物1-十二烯對小蜂已交配雌性具有較強的引誘性，但其誘發(fā)周氏嚙小蜂嗅覺反應的分子機制尤其是降解機制尚不明確。筆者從周氏嚙小蜂的轉錄組數據中篩選谷胱甘肽S-轉移酶基因，分析該基因的序列保守性及系統(tǒng)進化關系，并克隆CcGSTS1基因，體外誘導、表達并純化CcGSTS1蛋白，分析該蛋白的活性，旨在為進一步分析CcGSTS1在周氏嚙小蜂解毒代謝中的作用或氣味降解中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲：周氏嚙小蜂，由河南省漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心惠贈，在實驗室接種于柞蠶蛹（Antheraea pernyi）上進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度（25±0.5）℃，相對濕度（70±10）%，光周期14 L∶10 D。

主要試劑和工具酶：總RNA 提取試劑（RNA isolater Total RNA Extraction Reagent）、反轉錄試劑盒（HiScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA凝膠回收試劑盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）、質粒提取試劑盒（FastPure Plasmid Mini Kit）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性內切酶、PCR 所需 ExTaq primix 酶購自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成；其他如氯仿、異丙醇等試劑均為國產或進口分析純試劑。

菌種及質粒：大腸桿菌Transetta （DE3） Chemically Competent Cell、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent cell 購自北京全式金生物有限公司；原核表達載體pGEXKG1為實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建。

周氏嚙小蜂谷胱甘肽S-轉移酶1（CcGSTS1）堿基序列由筆者所在課題組早期全長轉錄組測序獲得。氨基酸序列由BioEdit軟件（Isis Pharmaceuticals，Carlsbad，CA）生成。應用在線服務器（http：//www.detaibio.com/sms2/protein_iep.html）計算成熟蛋白質的分子量及等電點。采用Signalp-5.0服務器（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）對信號肽進行預測。通過SMART服務器（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對CcGSTS1的保守結構域進行分析。應用MEGA 7.0軟件align by clustalW程序，選擇默認參數進行序列對齊，采用p-distance模型對間隙進行刪除，phylogency程序構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成。

取周氏嚙小蜂成蟲稱重100 mg，用液氮研磨后，按照 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent說明書提取總 RNA，經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應獲得單鏈 cDNA。

1.2.3 重組表達質粒構建。

根據CcGSTS1的基因序列，利用 Primer 5.0設計特異性引物（sense：CGCGGATCCATGCCTATGGAGCAGATGC，antisense： CCGCTCGAGAAATTGGGTTTTGGGTCGT）。以周氏嚙小蜂單鏈 cDNA 為模板，進行 PCR 擴增，將回收的DNA片段連接在克隆載體pMD 19-T，陽性克隆送測序驗證。用BamH Ⅰ/Xho Ⅰ 雙酶切并連接表達載體pGEX-KG，將連接產物轉化至大腸桿菌E.coli 菌株（Trans1-T1）感受態(tài)細胞。挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后利用質粒提取試劑盒進行質粒提取。對抽提出的質粒進行雙酶切鑒定和測序驗證。

1.2.4 重組蛋白原核表達與純化。

應用重組質粒pGEX-KG-GSTS1轉化E.coli Rosetta（DE3） 表達菌株感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行擴大培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液OD為0.8～1.0，加入IPTG 至終濃度為0.4 mmol/L 進行誘導表達，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h。收集誘導表達菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，超聲波破碎后于4 ℃下10 000 r/min 離心15 min。收集上清，與谷胱甘肽樹脂，于4 ℃層析柜結合，隨后將結合液于4 ℃下 1 200 rcf離心5 min，棄掉上清液，用PBS緩沖液進行洗滌3次，然后加入Thronbim酶，于4 ℃酶切除GST標簽，最后加入PBS緩沖液洗脫，收集上清即為純化的蛋白，在4 ℃ 用透析袋透析去鹽（透析液 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4） 2次，每次4 h。純化后采用 BCA 法對蛋白質進行定量。然后將10 μL純化蛋白用 SDS-PAGE 檢測，最后存至冰上放至4 ℃冰箱保存，用于酶活性檢測分析。

1.2.5 谷胱甘肽S-轉移酶活力測定。

CcGSTS1活性測定：反應體系包括100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.5） ，1 μg CcGSTS1蛋白，GSH 終濃度為 1 mmol/L，CDNB 終濃度為2 mmol/L，在25 ℃條件下檢測 340 nm 處的吸光值，以PBS 緩沖液作為對照。每處理重復3次，每1 min 測定1次，共測定 9 min。將所得數值經過整理帶入公式求出酶活力。CcGSTS1活力計算公式如下：

比活力[μmol/（min·mg）]=（ △OD×V）（ ε×T×L×E）

式中：△OD為單位時間內吸光度的變化值，V為酶促反應體積（200 μL） ，ε 為產物的消光系數（ 9.6 mmol/cm），T 為反應時間（1 min） ，L 表示光程 （1 cm），E為加入酶量（1 μg）。

pH對CcGSTS1催化活性的影響：反應體系包括終濃度分別為2 mmol/L CDNB 和1 mmol/L GSH，1 μg目的蛋白，100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，同時將反應體系中的100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（ pH 7.5） 替換成不同pH 梯度緩沖鹽溶液（pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的100 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 8.5、9.0、10.0、11.0、12.0的100 mmol /L Tris-HCl 緩沖液），反應在25 ℃下進行。每處理進行3次重復。檢測在340 nm 處的吸光值，分別于1 min 和6 min各測定1次，按照上述方法測定酶活力。

2 結果與分析

2.1 CcGSTS1蛋白序列

試驗前期全長轉錄組測序獲得CcGSTS1基因，該基因全長474 bp，編碼157個氨基酸。應用Signalp-5.0在線服務器分析發(fā)現(xiàn)，該基因N端無信號肽，說明CcGSTS1是一種非分泌性蛋白，其成熟多肽的計算分子量為18.27 kD，理論pI為6.55。CcGSTS1 蛋白由一個短鏈接序列 （Lys69-Thr70-Lys71-Leu72-Leu73-Glu74-Leu75-Ala76-Lys77-Glu78-Lys79-Thr80） 連接其N端與C端結構域（圖1）。

2.2 CcGSTS1與其他昆蟲GST序列比對及系統(tǒng)發(fā)育

將CcGSTS1與23種近緣昆蟲的110條GST異構體進行多重序列比對，結果表明，CcGSTS1具有較高的序列一致性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，CcGSTS1在Neighbor-joining樹中聚為Sigma分支，bootstrap值較高，表明CcGSTS1屬于胞質谷胱甘肽S-轉移酶的Sigma亞家族（圖2）。CcGSTS1與麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的NvGSTS6和多胚跳小蜂（Copidosoma floridanum）的CfGST同源性最高（分別為65%和66%），與斑痣懸繭蜂（Meteorus pulchricornis）的MpGST1和MpGST2，二化螟盤絨繭

蜂（Cotesia chilonis）的CchiGSTS2等煙蚜繭蜂（Aphidius gifuensis 的AgGST2和AgGST3，短翅蚜小蜂Aphelinus asychis的AaGST3等Sigma家族谷胱甘肽S-轉移酶均具有較高相似性。

注：Aa.Aphelinus asychis短翅蚜小蜂；Ag.Aphidius gifuensis煙蚜繭蜂；Bk.Belonocnema kinseyi癭蜂；Cs.Ceratosolen solmsi marchali 榕小蜂；Ci.Chelonus insularis 甲腹繭蜂；Cf.Copidosoma floridanum多胚跳小蜂；Cchi.Cotesia chilonis二化螟盤絨繭蜂；Cg.Cotesia glomerata 菜粉蝶盤絨繭蜂；Da.Diachasma alloeum胡蜂；Fa.Fopius arisanus 阿里山潛蠅繭蜂；Lb.Leptopilina boulardi布拉迪小環(huán)腹癭蜂；Lh.Leptopilina heterotoma 果蠅寄生蜂；Mp.Meteorus pulchricornis斑痣懸繭蜂；Md.Microplitis demolitor毀側溝繭蜂；Nv.Nasonia vitripennis麗蠅蛹集金小蜂；Pc.Polistes canadensis 紅紙黃蜂；Pd.Polistes dominula 造紙胡蜂；Pf.Polistes fuscatus 紙巢胡蜂；Tp.Trichogramma pretiosum短管赤眼蜂；Vc.Venturia canescens倉蛾姬蜂；Vcra.Vespa crabro 黃邊胡蜂；Vv.Vespa velutina黃腳胡蜂；Vp.Vespula pensylvanica 西方黃胡蜂；Vm.Vespa mandarinia 金環(huán)胡蜂。

2.3 CcGSTS1的原核表達、純化

為進一步研究周氏嚙小蜂CcGSTS1基因功能，抽提1日齡周氏嚙小蜂總RNA，反轉錄為cDNA作模板，應用CcGSTS1基因特異性引物進行PCR擴增，采用限制性內切酶BamH Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切，構建pGEXKG-CcGSTS1重組質粒。如圖3所示，隨機挑取6個單菌落，經質粒小量提取，雙酶切驗證，可切出471 bp外接片段，即上述質粒構建成功。挑選菌落1送蘇州金唯智生物科技有限公司測序正確，可用于后續(xù)蛋白表達純化。

將重組表達質粒pGEXKG-GSTS1 轉化至 E.coli Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，加入終濃度為0.4 mmol/L 的 IPTG 后，在37 ℃ 條件下誘導表達4 h。收集菌體，如圖4泳道1和泳道2所示，pGEXKG空質粒轉化菌經IPTG誘導后，在25 kD 處有特異條帶（載體GST蛋白標簽），而pGEXKG-GST轉化菌在45 kD處有特異性條帶，說明融合蛋白成功表達（載體GST標簽與周氏嚙小蜂GSTS1融合蛋白）。收集菌體經超聲波破碎，高速離心15 min后，上清液顯示，45 kD處有特異性條帶，說明該融合蛋白是可溶性蛋白（圖4泳道3）。收集的上清液與瓊脂糖凝膠樹脂4B結合，應用PBS 磷酸鹽緩沖液進行洗滌去雜蛋白，如圖4泳道4、5、6所示，誘導的融合蛋白過量，超出瓊脂糖凝膠樹脂4B的結合能力。進一步加入thrombin 凝血酶切除標簽，利用PBS 磷酸鹽緩沖液進行洗脫可獲得不含標簽的CcGSTS1蛋白（圖4泳道7）。進一步將純化的CCGSTS蛋白進行透析，并用于后續(xù)CcGSTS1活性分析試驗。

2.4 CcGSTS1 的酶學特性

谷胱甘肽S-轉移酶催化谷胱甘肽（GSH）與底物（CDNB）結合，其結合產物的光吸收峰為340 nm，酶標儀于 25 ℃條件下，每1 min 測定一次340 nm 處的吸光值，以分析CcGSTS1酶促活性變化。如圖5所示， CcGSTS1蛋白活性較穩(wěn)定，隨時間推移，1 min反應產物量與前1 min差異不大。為進一步研究該蛋白的最適反應條件，設置一系列pH梯度，結果顯示，酸性pH和堿性pH環(huán)境均不利于CcGSTS1蛋白活性，在pH 7.0時，其酶活性達峰值（圖6）。說明該蛋白酶促反應活性最適pH為7.0，應用該蛋白進行體外氣味分子降解試驗時可采用該條件。

3 討論

谷胱甘肽S-轉移酶在昆蟲環(huán)境適應性、解毒代謝及嗅覺感受系統(tǒng)中都起著重要作用，昆蟲的胞質谷胱甘肽S-轉移酶可分成6個亞家族Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta。筆者所在實驗室早期轉錄組測序發(fā)現(xiàn)32個周氏嚙小蜂GSTs基因轉錄本，其中5個具有全長CDS。筆者選擇具有全長CDS的一個Sigma亞家族蛋白CcGSTS1進行序列及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，其與Sigma家族的麗蠅蛹集金小蜂NvGSTS6、斑痣懸繭蜂MpGSTS1/MpGSTS2、二化螟盤絨繭蜂CchiGSTS2等相似性較高。

為研究CcGSTS1是否能夠降解氣味，或發(fā)揮解毒作用，構建pGEXKG-GSTS1表達質粒，在體外表達、純化CcGSTS1蛋白，并以CDNB為底物對重組CcGSTS1酶活性進行檢測，結果表明，重組CcGSTS1可催化GSH與CDNB結合，其結合產物在340 nm有明顯光吸收。每隔1 min連續(xù)測量發(fā)現(xiàn)，9 min內CcGSTS1酶活性無明顯衰減?？稍诿阜磻w系中加入氣味分子或毒性物質，檢測該氣味分子或毒性物質是否對CDNB產生競爭性抑制作用，從而明確CcGSTS1是否對該氣味分子或毒性物質具有結合降解作用。該研究建立了CcGSTs體外功能研究體系，為進一步研究周氏嚙小蜂谷胱甘肽S-轉移酶功能奠定基礎。

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