地生彎頸霉C41-3產(chǎn)低溫脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化

孫蕊 蘇丹 張文浩 呂國忠

摘要 [目的]優(yōu)化地生彎頸霉C41-3產(chǎn)低溫脂肪酶發(fā)酵條件，為擴(kuò)大低溫脂肪酶的應(yīng)用提供理論依據(jù)。[方法]使用棕櫚酸對硝基苯酯（p-NPP）比色法測定脂肪酶的活性。[結(jié)果]最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為胰蛋白胨40 g/L、α-乳糖20 g/L、MnSO·HO 1 g/L、NHNO 1 g/L、乳化芥花油20 mL；最佳發(fā)酵條件為pH 5、發(fā)酵溫度15 ℃、培養(yǎng)時間4 d。優(yōu)化后，地生彎頸霉C41-3的脂肪酶活性從199.40 U/mL增加至5 700.72 U/mL，脂肪酶活性增加了約27.6倍。[結(jié)論]該新型脂肪酶具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞 低溫脂肪酶；地生彎頸霉C41-3；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號 Q949.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）02-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Optimization of Fermentation Condition of Cold-activer Lipase Producing by Tolypocladium geodes C41-3

SUN Rui，SU Dan，ZHANG Wen-hao et al

（College of Life Science and Engineering，Shenyang University，Shenyang，Liaoning 110044）

Abstract [Objective]To optimize the fermentation conditions for low-activer lipase production by Tolypocladium geodes C41-3 and provide theoretical basis for expanding the application of low-activer lipase.[Method]The lipase activity was measured by the p-nitrophenyl palmitate （p-NPP） colorimetric method.[Result]Best fermentation medium was tryptone 40 g/L，α-lactose 20 g/L，MnSO·HO 1 g/L，NHNO 1 g/L，emulsion canola oil 20 mL.Best fermentation condition was pH 5，fermentation temperature of 15 ℃，culture time of 4 days.After optimization，the lipase activity of T.geodes C41-3 could be increased from 199.40 U/mL to 5 700.72 U/mL，and the lipase activity increased by about 28.5 times， [Conclusion]The novel lipase has potential industrial applications value.

Key words Cold-active lipase;Tolypocladium geodes C41-3;Optimization of fermentation conditions

基金項目 國家自然科學(xué)基金面上項目（31770025）;遼寧省教育廳青年育苗項目（2020JYT02）;遼寧省自然科學(xué)基金指導(dǎo)計劃項目（2019-ZD-0549）；大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室開放課題（KF2021002）。

作者簡介 孫蕊（1995—），女，甘肅慶陽人，碩士研究生，研究方向：微生物。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事微生物資源與利用研究。

收稿日期 2022-10-04

脂肪酶是僅次于淀粉酶和蛋白酶的第三大類工業(yè)酶，它可以分別在脂質(zhì)-水界面和非水溶性底物界面催化脂質(zhì)水解和酯的合成。脂肪酶可以逐步將甘油三酯水解成脂肪酸和甘油，這些脂肪酶廣泛存在于各種植物、動物和微生物組織中。與動物、植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。微生物脂肪酶的酶學(xué)特性和底物特異性普遍多樣，在未來洗滌劑、化妝品等商業(yè)市場的發(fā)展中具有很大的吸引力。

大多數(shù)低溫脂肪酶來自低溫微生物。低溫脂肪酶的最佳活性一般在30～40 ℃，在0～20 ℃仍具有較高的酶活性。低溫脂肪酶具有生產(chǎn)成本低、品種多、有機溶劑穩(wěn)定性好、作用特異性強、反應(yīng)條件溫和、能耗低等優(yōu)點。因此，低溫脂肪酶比在高溫下工作的酶具有更經(jīng)濟(jì)和生態(tài)優(yōu)勢。它們在各種工業(yè)應(yīng)用如皮革加工、醫(yī)藥制劑、精細(xì)化學(xué)合成、洗滌劑添加劑、食品加工、環(huán)境生物修復(fù)、生物轉(zhuǎn)化、化妝品制備和異源宿主中的基因表達(dá)等方面具有真正的酶潛力。低溫脂肪酶通常存在于5 ℃以下存活的耐冷和嗜冷微生物中。低溫微生物大多來自北極和南極冰川以及其他寒冷地區(qū)，它們在（0±2）℃處表現(xiàn)出持續(xù)的寒冷棲息地。冷活性微生物可在0～5 ℃的溫度下生長和繁殖，最適生長溫度為25 ℃或以下，最高生長溫度約為30 ℃。

地生彎頸霉C41-3是從我國長白山自然保護(hù)區(qū)的苔原帶采集的土壤中分離得到的。地生彎頸霉（Tolypocladium geodes）是具有高海拔分布特征的耐冷真菌。地生彎頸霉屬于子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、線蟲草科（Ophiocordycipitaceae）、彎頸霉屬（Tolypocladium）。彎頸霉屬是由Gams在1971年建立的新屬，國際真菌名錄數(shù)據(jù)庫里截至目前記載的彎頸霉屬有43個種。彎頸霉屬真菌是一類非常重要的蟲生真菌，其次級代謝產(chǎn)物也相當(dāng)豐富，主要有環(huán)孢菌素（cyclosporine）、大團(tuán)囊素（ophiocordin）、線肽素（efrapeptin）、四聚胺酸素（ophiosetin）等，這些代謝產(chǎn)物都具有抗菌殺蟲、抗氧化的作用。環(huán)孢菌素作為新型免疫抑制劑，在器官移植術(shù)后抗排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、預(yù)防農(nóng)作物病蟲害、皮膚病、眼病以及牙槽炎癥等臨床上的應(yīng)用逐漸普及。截至目前，國際上不僅只對彎頸霉屬真菌次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行報道，也對彎頸霉產(chǎn)生的胞外酶進(jìn)行研究。 研究表明雪白彎頸霉（Tolypocladium inflatum）、株孢彎頸霉（Tolypocladium cylindrosporum）都是生產(chǎn)脂肪酶的高產(chǎn)菌株，同時兩者還能產(chǎn)出幾丁質(zhì)酶。但鮮見地生彎頸霉生產(chǎn)脂肪酶的相關(guān)報道。

脂肪酶的高產(chǎn)率對于低溫脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。脂肪酶的產(chǎn)生會受到幾個因素的影響，包括培養(yǎng)時間、溫度、pH、培養(yǎng)基成分和誘導(dǎo)物的存在，這些因素會影響細(xì)胞生長和脂肪酶的產(chǎn)生。因此該試驗通過對地生彎頸霉生產(chǎn)低溫脂肪酶的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，為今后更好地利用地生彎頸霉生產(chǎn)低溫脂肪酶奠定了基礎(chǔ)，也更加證明了彎頸霉屬真菌在臨床和工業(yè)生產(chǎn)方面都有重大的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株來源。菌株C41-3是從我國長白山自然保護(hù)區(qū)的苔原帶采集的土壤中分離得到的。

1.1.2 培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，水1 000 mL，pH自然。種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，水1 000 mL，pH自然。脂肪酶篩選培養(yǎng)基（甘油三丁酸酯培養(yǎng)基）：甘油三丁酸酯乳化液10 mL/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO·HO 0.5 g/L，瓊脂18 g/L，pH 自然。初始發(fā)酵培養(yǎng)基：動物蛋白胨40 g/L，蔗糖20 g/L，橄欖油乳化液20 mL/L， MgSO·7HO 1 g/L，KHPO 1 g/L，pH自然。所有培養(yǎng)基在使用前必須在121 ℃下滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選。將保藏在-20 ℃的供試菌株挑取少量菌絲，接種在PDA培養(yǎng)基平板上并置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。將甘油三丁酸酯培養(yǎng)基配制好后，于121 ℃下滅菌。然后，將培養(yǎng)基倒入90 mm培養(yǎng)皿中，冷卻后，用無菌打孔器從活化菌株的平板中取直徑約為7 mm的菌塊，用無菌的鑷子挑取菌塊倒扣于甘油三丁酸酯培養(yǎng)基上。共進(jìn)行3次平行試驗，培養(yǎng)10～15 d后，觀察菌落周圍有清晰的區(qū)域表明脂肪酶的產(chǎn)生。

1.2.2 菌株鑒定。將低溫脂肪酶產(chǎn)生菌株C41-3在 PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲取菌絲體采用CTAB法提取真菌基因組 DNA，使用通用引物 ITS1 /ITS4 進(jìn)行 rDNA-ITS 區(qū)段擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括10×Buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，Taq DNA酶 0.5 μL，ITS 1.0 μL，ITS4 1.0 μL，DNA樣品2.0 μL，超純水36.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性 10 min;94 ℃ 變性 30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增序列送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將菌株C41-3的 rDNA-ITS 序列與GenBank 中相關(guān)序列進(jìn)行相似度比較，并用MEGA 6.0軟件基于鄰接法（ neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 脂肪酶生產(chǎn)。將配制好的種子培養(yǎng)基分裝于若干個250 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶裝種子培養(yǎng)基100 mL，121 ℃滅菌30 min，然后冷卻。將3個7 mm直徑的菌塊放入含有100 mL種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，并放于搖床培養(yǎng)。溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)4 d后獲得發(fā)酵種子液。

取配制好的30%的初始發(fā)酵培養(yǎng)基加至250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min，冷卻到室溫；在10%的接種量下，將7.5 mL發(fā)酵種子液體加入含有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中。發(fā)酵溫度為25 ℃，pH自然，轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)4 d。取出發(fā)酵液，用高速冷凍離心機在4 ℃下以10 000 r/min離心發(fā)酵液10 min，收集上清液獲得粗酶液。

1.2.4 脂肪酶活性測定。根據(jù)Alami等的研究，用棕櫚酸對硝基苯酯（p-nitrophenyl palmitate，p-NPP）作為底物，測定其低溫脂肪酶活性。溶液A：0.015 g p-NPP溶于5 mL異丙醇中； 溶液B：在45 mL的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中加入0.05 g阿拉伯樹膠和0.2 mL Triton X-100。使用p-NPP為底物，將5 mL溶液A與45 mL溶液B均勻混合，將一種酶樣品分成4個試管，每個試管加入1.8 mL的混合液，并在37 ℃預(yù)熱5 min。其中3個試管加入200 μL酶樣品溶液，另外1個試管加入200 μL經(jīng)煮沸變性（100 ℃，10 min）的酶樣品溶液作為對照，混合均勻。試管在37 ℃水浴反應(yīng)15 min，取出后于波長410 nm的分光光度計下測定吸光度。脂肪酶活性單位定義為在測量條件下釋放1.0 μmol/min對硝基苯酚（ p-NP）所需的酶量。

1.2.5 發(fā)酵時間對脂肪酶生產(chǎn)的影響。優(yōu)化脂肪酶生產(chǎn)中的培養(yǎng)時間并確定最高脂肪酶活性的最佳時間。將發(fā)酵的種子液接種到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在25 ℃和150 r/min的搖床中發(fā)酵。從發(fā)酵的第2天開始，每天采取發(fā)酵液并測定脂肪酶活性以確定最佳的發(fā)酵時間。

1.2.6 培養(yǎng)基成分對脂肪酶生產(chǎn)的影響。改變發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分，在不同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行脂肪酶的優(yōu)化生產(chǎn)。培養(yǎng)基成分優(yōu)化試驗，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中加入等量的葡萄糖、蔗糖、D-果糖、可溶性淀粉、糊精、α-乳糖和D（+）-麥芽糖進(jìn)行發(fā)酵，然后測定酶活性，確定最佳的碳源。根據(jù)確定的最佳碳源，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入等量的有機氮源（動物蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨）和無機氮源[（NH）SO、NHCl、NHNO和尿素]。然后將等量的Fe、Cu、Zn、Ca、Mg、Mn的硫酸鹽以及無任何金屬離子加入最佳碳源和氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中；最后向最佳碳源、氮源和金屬離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入20 mL的大豆油、芝麻油、橄欖油、芥花油、花生油的乳化液，發(fā)酵培養(yǎng)后測定酶活以確定最佳的油脂。

1.2.7 發(fā)酵溫度對脂肪酶生產(chǎn)的影響。研究培養(yǎng)基發(fā)酵溫度與脂肪酶產(chǎn)量的關(guān)系。根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組分和初始pH，為脂肪酶生產(chǎn)設(shè)置了6個發(fā)酵溫度梯度，分別為5、10、15、20、25、30 ℃。

1.2.8 初始pH對脂肪酶生產(chǎn)的影響。研究培養(yǎng)基的初始pH與脂肪酶產(chǎn)量之間的關(guān)系。根據(jù)最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分，為脂肪酶生產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)置了7個pH梯度，分別為4、5、6、7、8、9、10。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株C41-3的鑒定 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）顯示，菌株C41-3與地生彎頸霉的序列具有極高相似性，與地生彎頸霉的相似度為100%。因此，菌株C41-3可鑒定為地生彎頸霉的一員。

2.2 發(fā)酵時間對脂肪酶活性的影響 從圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，脂肪酶活性也會增加，在第4天觀察到活性最高（199.40 U/mL）。

2.3 碳源對脂肪酶活性的影響 碳源是提供能量和維持細(xì)胞正常生活活動和代謝的重要因素之一。從圖3可以看出，當(dāng)以葡萄糖、α-乳糖作為脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時，脂肪酶活性相對較高，而α-乳糖作為碳源時的脂肪酶活性最高（1 268.66 U/mL）。

2.4 氮源對脂肪酶活性的影響 氮源是微生物生長和酶生產(chǎn)的基本物質(zhì)，也是助于微生物細(xì)胞代謝和原生質(zhì)組成的關(guān)鍵。從圖4可以看出，當(dāng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加有機氮源作為氮源時，使用胰蛋白胨作為氮源可以提高脂肪酶活性（1 860.25 U/mL）。當(dāng)以無機氮源作為氮源時，以（NH）SO、NHCl、NHNO作為氮源，地生彎頸霉C41-3的脂肪酶活性均相對較高，其中，NHNO作為氮源脂肪酶活性最高（5 052.35 U/mL）。

2.5 金屬離子對脂肪酶活性的影響 向脂肪酶培養(yǎng)基中添加0.1%不同的金屬離子，以不添加金屬離子作為對照，比較不同金屬離子對脂肪酶活性的影響。結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，Ca、Cu、Mn和Fe對脂肪酶的生成具有顯著的催化作用，Mn對脂肪酶活性的影響最大，達(dá)到5 455.05 U/mL。

2.6 誘導(dǎo)劑對脂肪酶活性的影響 從圖6可以看出，地生彎頸霉C41-3在使用的所有油脂中都能使脂肪酶活性升高。使用芥花油作為油脂誘導(dǎo)劑時，脂肪酶活性最高，達(dá)到4 839.33 U/mL。

2.7 發(fā)酵溫度對脂肪酶活性的影響 從圖7可以看出，地生彎頸霉C41-3發(fā)酵4 d，在發(fā)酵溫度為15、20和25 ℃時，脂肪酶活性均較高，15 ℃時脂肪酶活性最高（4 648.09 U/mL）。

2.8 初始pH對脂肪酶活性的影響 從圖8可以看出，地生彎頸霉C41-3在所有pH下均能促進(jìn)脂肪酶活性升高。其中，脂肪酶活性在pH為5時最高（5 700.72 U/mL），在pH為6～10時脂肪酶活性降低，但仍保持較高的脂肪酶活性。

3 結(jié)論

該研究對地生彎頸霉C41-3產(chǎn)脂肪酶的試驗進(jìn)行優(yōu)化。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和條件：胰蛋白胨40 g/L、乳糖20 g/L、MnSO·HO 1 g/L、NHNO 1 g/L、乳化芥花油20 mL，初始pH 5，發(fā)酵溫度15 ℃，發(fā)酵時間4 d。該培養(yǎng)基將脂肪酶活性從199.40 U/mL提高至5 700.72 U/mL，脂肪酶活性提高了約27.6倍。與2 171 U/mL的黑曲霉脂肪酶活性相比，地生彎頸霉C41-3的脂肪酶活性提高了3 529.72 U/mL；與念珠菌W 3.8脂肪酶活性（2357.3U/mL）相比，地生彎頸霉C41-3的脂肪酶活性提高了3 343.42 U/mL。因此，地生彎頸霉C41-3具有巨大的工業(yè)潛力，可以為生產(chǎn)冷活性脂肪酶提供新的真菌來源。

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