基于銪離子-四環(huán)素-草甘膦熒光增強(qiáng)體系結(jié)合分子印跡固相萃取測定環(huán)境樣品中草甘膦的殘留量

袁 寧,沈曉峰,全紅花,曾 誠,李 明*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,揚(yáng)州 225127;2.揚(yáng)州海關(guān),揚(yáng)州 225100)

草甘膦(Glyp)在農(nóng)業(yè)上被廣泛用作非選擇性除草劑[1-2]。隨著Glyp的大量使用,其對環(huán)境產(chǎn)生的毒性作用逐漸被人們所熟知。Glyp在環(huán)境中主要是通過生物降解產(chǎn)生氨甲基膦酸;當(dāng)Glyp吸附到土壤上時(shí),它不再容易被生物降解,從而造成了其在土壤中殘留量的持續(xù)增加[3-4]。此外,吸附在土壤顆粒上的Glyp在被降解之前可通過懸浮在地表徑流的途徑發(fā)生遷移,因此Glyp在地表水甚至地下水中也能夠被檢測到。

由于Glyp及其相關(guān)代謝物極性高、水溶性強(qiáng)、揮發(fā)性低以及其分子結(jié)構(gòu)中缺乏生色團(tuán),檢測Glyp的常用方法主要是高效液相色譜法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、配氫火焰離子化檢測器或質(zhì)譜檢測器的氣相色譜法[7]。雖然這些方法可對實(shí)際樣品中的Glyp進(jìn)行高靈敏定量分析,但均需要使用大型儀器,分析成本較高。文獻(xiàn)[8]采用化學(xué)衍生化-光譜法測定Glyp,得到了良好的結(jié)果,然而該衍生化反應(yīng)需要加熱,操作繁瑣,并且檢出限較高。

稀土金屬離子絡(luò)合物常被作為熒光探針。四環(huán)素(Tc)是一種含有β-二酮酸的分子,可以與稀土金屬離子如Eu3+配位形成Eu3+-Tc絡(luò)合物,將其激發(fā)能轉(zhuǎn)移到Eu3+發(fā)射5D0→7F2躍遷(以615 nm為中心的強(qiáng)發(fā)射帶)[9-15]。該絡(luò)合物的特點(diǎn)是熒光量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移大、發(fā)射帶窄。然而,由于水分子的猝滅作用,Eu3+-Tc絡(luò)合物通常顯示出較弱的熒光。在一些輔助配體的作用下,其可以取代Eu3+配位球上的水分子,形成Eu3+-Tc-輔助配體三元絡(luò)合物,表現(xiàn)出熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象[16-19]。鑒于此,本工作基于Eu3+-Tc-Glyp熒光增強(qiáng)體系,建立了一種簡單、靈敏、選擇性高的測定Glyp含量的方法;同時(shí),為了準(zhǔn)確測定實(shí)際環(huán)境樣品中Glyp的殘留量,采用溶膠-凝膠法[20]制備了Glyp分子印跡固相萃取膜,以進(jìn)一步擴(kuò)大Eu3+-Tc-Glyp熒光增強(qiáng)體系在實(shí)際環(huán)境樣品中的應(yīng)用范圍。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F97XP13001型熒光分光光度計(jì);CHI800D型電化學(xué)儀;Spectra Academy SV-2100型紫外-可見分光光度計(jì);MX-S型振蕩器;LX-100型微型離心機(jī);PHS-3C型酸度計(jì)。

三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液(50 mmol·L-1,pH 8.0)：將50 mL 0.1 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷溶液與29.2 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液混合,再用水稀釋并定容至100 mL。

EuCl3的純度為99.9%;正硅酸乙酯(TEOS)的純度為98%;Tc的純度為96%;鐵氰化鉀的純度大于98%;17種氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸)混合標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99%;Glyp、草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于99.5%,氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于97%;試驗(yàn)用水為蒸餾水。

灌溉水樣品及土壤樣品采集自江蘇昆山某鎮(zhèn)農(nóng)田水溝。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Glyp分子印跡固相萃取膜的制備

將3.0 mL TEOS加入至含有2.5 mL無水乙醇和12 mL水的試劑瓶中,超聲振蕩,并用0.1 mol·L-1鹽酸溶液將其酸度調(diào)節(jié)至pH 1.0,攪拌2 h。分取1.0 mL,加入0.1 mL 1.0×10-2mol·L-1Glyp標(biāo)準(zhǔn)溶液,攪拌60 min。分取100 μL,轉(zhuǎn)移至4 mL平底試管中,將試管置于80 ℃加熱干燥60 min。向試管中加入1.0 mL水,浸泡45 min,洗脫出Glyp,得到Glyp分子印跡固相萃取膜。

1.2.2 樣品處理和測定

采集的灌溉水樣品經(jīng)0.45 μm的尼龍膜針式過濾器過濾,并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采集距離地表0～20 cm的耕層土壤樣品,風(fēng)干后過0.850 mm篩,分取5.0 g于50 mL塑料離心管中,加入20 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鉀溶液,渦旋混勻,超聲30 min,振蕩30 min,以轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1離心5 min。取上清液,用濃度為0.5～3.0 mol·L-1的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液將其酸度調(diào)節(jié)至pH 7.0,然后加入100 μL三乙醇胺,用水定容至25.0 mL,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩lyp分子印跡固相萃取膜置于上述處理后的水樣或土壤樣品中浸泡60 min,然后將其轉(zhuǎn)移至離心管中,加入1.5 mL水浸泡45 min用于脫附Glyp。脫附后的Glyp分子印跡固相萃取膜于25 ℃干燥,保存?zhèn)溆谩?/p>

將1.5 mL脫附溶液或不同濃度的Glyp標(biāo)準(zhǔn)溶液與1.0 mL 1.5×10-2mol·L-1EuCl3溶液、1.0 mL 3.0×10-3mol·L-1Tc溶液和3.0 mL 100 mmol·L-1硼酸鹽緩沖溶液(pH 10.0)混合,用水定容至10 mL,靜置反應(yīng)3 min。設(shè)置熒光分光光度計(jì)狹縫寬度為10 nm,光電倍增管(PMT)電壓為500 V,激發(fā)波長(λex)為403 nm,測定體系在615 nm發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度增加值ΔF(ΔF=F-F0,F和F0表示添加和未添加Glyp時(shí)的體系熒光強(qiáng)度)。

1.2.3 有機(jī)磷水解酶電極的制備

參考文獻(xiàn)[21]制備有機(jī)磷水解酶(OHP)電極,用于驗(yàn)證Glyp分子印跡溶膠的性能。取500 mL聚磷菌培養(yǎng)液(106個(gè)·mL-1),以轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1離心30 min,去除上清液,沉淀中加入5 mL 0.2 mg·L-1Glyp標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃靜置1 h;以轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,加入60%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硫酸銨溶液,于4 ℃靜置2 h;以轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1離心20 min,去除上清液,將剩余沉淀溶解于10 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)中。燒杯中加入相同的Tris-HCl緩沖溶液,將上述硫酸銨析出的粗酶溶液放入透析袋(透析袋在使用前用水反復(fù)沖洗)中進(jìn)行透析。每隔12 h更換一次Tris-HCl緩沖溶液,重復(fù)3次后,將透析袋放入30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))聚乙二醇溶液中,得到OHP溶液。分取20 μL,與2 μL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白溶液和5 μL 2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊二醛溶液混合后滴加到尼龍膜表面,置于4 ℃冰箱中過夜。利用氨氣敏電極套管將尼龍膜固定在pH玻璃電極上,得到OHP電極。

取1.0 mL Glyp分子印跡溶膠洗脫液,與1.0 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0)混合,于45 ℃水浴加熱60 s,水解出Glyp,待溶液冷卻后,用OHP電極記錄電位差。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

Eu3+、Eu3+-Tc和Eu3+-Tc-Glyp體系的熒光光譜見圖1,其中Tc濃度為1.0×10-4mol·L-1,Eu3+濃度為5.0×10-4mol·L-1,Glyp濃度為5.0×10-6mol·L-1,體系酸度為pH 10.0,λex為403 nm。

1-Eu3+-Tc-Glyp;2-Eu3+-Tc;3-Eu3+圖1 不同體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of different systems

結(jié)果表明：在Eu3+溶液中加入Tc后,Eu3+與Tc形成二元絡(luò)合物,分別在590 nm和615 nm處發(fā)射熒光,對應(yīng)于Eu3+的5D0→7F1躍遷和5D0→7F2躍遷;在Eu3+-Tc體系中添加Glyp后,615 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(是Eu3+-Tc體系熒光強(qiáng)度的1.5倍),表明Glyp與Eu3+-Tc絡(luò)合物形成穩(wěn)定的Eu3+-Tc-Glyp三元絡(luò)合物,使Eu3+-Tc體系的熒光通過分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移得到增強(qiáng)。Glyp是一種高親水性的氨基酸類化合物,含有胺基、羧酸和膦酸等官能團(tuán),在堿性環(huán)境中可與金屬離子形成強(qiáng)配位的二元或三元絡(luò)合物[22-23]。Eu3+-Tc絡(luò)合物的物質(zhì)的量比為1…1,在水溶液中Eu3+的配位是不飽和的(Eu3+的配位數(shù)通常為8)[13],因此水分子容易與Eu3+-Tc絡(luò)合物的剩余空軌道配位。在堿性條件下,Glyp可以通過取代水分子配體,與Eu3+-Tc絡(luò)合物形成穩(wěn)定的雙五元環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2)。隨著水分子配體的釋放,水分子O-H振動(dòng)引起的非輻射能量損失減小,使得Eu3+-Tc-Glyp體系的熒光強(qiáng)度增大。

圖2 Eu3+-Tc-Glyp絡(luò)合物的雙五元環(huán)預(yù)測構(gòu)型Fig.2 Expected bi-five-ring configuration of Eu3+-Tc-Glyp complex

2.2 測定條件的優(yōu)化

2.2.1 體系酸度

為考察Eu3+-Tc-Glyp體系的最佳反應(yīng)酸度,使用酸度分別為pH 7.0,8.0,10.0,11.0的緩沖溶液[24]測定了體系的ΔF值,結(jié)果見圖3。

圖3 酸度對體系ΔF值的影響Fig.3 Effect of acidity on ΔF value of the system

結(jié)果表明：在pH 7.0,8.0條件下,體系的ΔF值較小,可能是Glyp部分解離,只能與Eu3+-Tc絡(luò)合物形成一元或二元絡(luò)合物,因此不能有效阻止非輻射能量損失;在pH 9.0,10.0條件下,體系的ΔF值明顯增強(qiáng),這是因?yàn)樵谳^強(qiáng)堿性條件下Glyp分子全部解離生成陰離子(Glyp的pKa3=10.25)[4],從而能夠形成穩(wěn)定的雙五元環(huán)構(gòu)型絡(luò)合物,有效地減少了非輻射能量損失,使熒光強(qiáng)度得到增強(qiáng);隨著pH繼續(xù)增大,ΔF值開始下降,這是因?yàn)槿芤褐械腛H-產(chǎn)生競爭性配位。因此,試驗(yàn)選擇的體系酸度為pH 10.0。

2.2.2 Eu3+與Tc的物質(zhì)的量比

固定Glyp濃度為1.0×10-5mol·L-1,考察了Eu3+與Tc的物質(zhì)的量比分別為0.1…1,2…1,4…1,6…1,8…1,10…1,20…1時(shí)對體系ΔF值的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 Eu3+與Tc的物質(zhì)的量比對體系ΔF值的影響Fig.4 Effect of molar ratio of Eu3+ to Tc on ΔF value of the system

結(jié)果表明：當(dāng)Eu3+與Tc物質(zhì)的量比為0.1…1～6…1時(shí),體系的ΔF值先增大后基本保持不變;當(dāng)Eu3+與Tc物質(zhì)的量比大于6…1時(shí),體系的ΔF值降低。試驗(yàn)選擇Eu3+與Tc物質(zhì)的量比為5…1,進(jìn)一步對Eu3+和Tc濃度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Tc濃度過高,易發(fā)生PMT飽和;Tc濃度過低,體系熒光強(qiáng)度較低,導(dǎo)致ΔF值變化不明顯,影響測定靈敏度。因此,試驗(yàn)最終選擇的Eu3+濃度為1.5×10-2mol·L-1,Tc濃度為3.0×10-3mol·L-1。

2.3 干擾試驗(yàn)

為考察灌溉水中可能存在的干擾物,如草銨膦、氨甲基膦酸、結(jié)構(gòu)類似的氨基酸以及水環(huán)境中常見的金屬離子和陰離子對Glyp測定的影響,在上述最佳測定條件下,向若干組1.0×10-6mol·L-1Glyp標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入了不同濃度的干擾物,測定了加入后體系熒光強(qiáng)度與加入前體系熒光強(qiáng)度的比值(相對熒光強(qiáng)度),結(jié)果見表1。

表1 干擾物對體系相對熒光強(qiáng)度的影響

2.4 Glyp分子印跡固相萃取膜制備條件的優(yōu)化

用0.1 mol·L-1鹽酸溶液將TEOS、無水乙醇和水的混合溶液酸度調(diào)節(jié)至pH 1.0,2.0,3.0,得到不同酸度的Glyp分子印跡溶膠,同時(shí)考察了洗脫時(shí)間分別為0,15,30,45,60 min時(shí)Glyp分子印跡溶膠的電位變化,結(jié)果如圖5所示。

圖5 酸度和洗脫時(shí)間對電位差的影響Fig.5 Effects of acidity and elution time on the potential difference

結(jié)果表明：隨著pH的減小和洗脫時(shí)間的延長,電位差逐漸增大;在pH 1.0條件下洗脫不小于45 min,電位差較大且基本保持穩(wěn)定。因此,試驗(yàn)選擇制備Glyp分子印跡溶膠的酸度為pH 1.0,洗脫時(shí)間為45 min。

2.5 Glyp分子印跡固相萃取膜的重復(fù)性和穩(wěn)定性

用1.0×10-5mol·L-1Glyp標(biāo)準(zhǔn)溶液浸泡45 min Glyp分子印跡固相萃取膜,利用OHP電極測定浸泡液的電位差;然后將Glyp分子印跡固相萃取膜脫附并干燥處理后,再次浸泡在Glyp標(biāo)準(zhǔn)溶液中,重復(fù)上述過程5次,計(jì)算電位差的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示,電位差的RSD為3.2%,表明Glyp與分子印跡固相萃取膜上的空穴的結(jié)合是一個(gè)可逆過程,Glyp分子印跡固相萃取膜可以重復(fù)多次使用。

按照同樣的方法,對使用兩周前后的Glyp分子印跡固相萃取膜的浸泡液進(jìn)行測定。結(jié)果顯示,電位差僅降低了4.4%,表明Glyp分子印跡固相萃取膜的穩(wěn)定性良好。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照1.2.2節(jié)試驗(yàn)方法測定濃度為1.0×10-8,5.0×10-8,5.0×10-7,1.0×10-7,2.0×10-6,5.0×10-6,1.0×10-5,1.5×10-4,1.0×10-4,1.0×10-3,3.0×10-3mol·L-1的Glyp標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以Glyp濃度對數(shù)為橫坐標(biāo),對應(yīng)的體系ΔF值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：線性回歸方程為ΔF=260.5×lgc+211 3,線性范圍為5.0×10-8～1.5×10-4mol·L-1,相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

以3s/k(其中s為3次空白信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為線性回歸方程的斜率)計(jì)算檢出限,結(jié)果為1.0×10-8mol·L-1。

2.7 樣品分析和回收試驗(yàn)

按照1.2.2節(jié)試驗(yàn)方法分析3份灌溉水樣品和3份土壤樣品,并與電化學(xué)法[26]進(jìn)行比較,結(jié)果見表2。

表2 樣品分析和比對結(jié)果

由表2可知,本方法和電化學(xué)法的測定結(jié)果基本一致。試驗(yàn)進(jìn)一步采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對灌溉水樣品1進(jìn)行了加標(biāo)濃度水平為1.69 μg·kg-1的回收試驗(yàn),結(jié)果顯示Glyp回收率為101%,表明該方法準(zhǔn)確度較高。

本工作基于Glyp作為輔助配體與Eu3+-Tc生成三元絡(luò)合物表現(xiàn)的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象,結(jié)合Glyp分子印跡固相萃取前處理技術(shù),建立了Glyp的熒光分析方法。該方法的檢出限低,線性范圍較寬,抗干擾能力強(qiáng),能夠應(yīng)用于環(huán)境水及土壤中草甘膦殘留量的測定。