中華絨螯蟹螺原體研究綜述

孔德瑤，陳 穎，師家豪，董麒霏，張 晴

1.南華大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南 衡陽 421001；3.南華大學第二附屬醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4.陜西科技大學，陜西 西安 710021

在分類學上，螺原體屬于動物門自我復制的原核生物，由革蘭氏陽性細菌進化而來。螺原體沒有細胞壁，與動物門中的其他微生物一樣，具有簡單的代謝過程、寄生生活、“煎蛋”菌落形態(tài)和少量基因組，只是其形態(tài)與典型的動物門微生物支原體不同，它們是螺旋狀的，按照螺旋狀的路徑移動。中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma eriocheiris）已被確定為一種新型病原體。已有研究表明，螺原體的致病性也表現(xiàn)在除水生動物以外的其他生物體中，此外，有學者認為中華絨螯蟹螺原體可能與螃蟹的肝胰腺壞死?。℉PND）有關(guān)。在中國，中華絨螯蟹肝胰腺壞死（HPND）已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟損失（Shen，Kumar et al. 2021）。闡明中華絨螯蟹的性質(zhì)、宿主范圍及其作用機理，對于微生物水產(chǎn)經(jīng)濟的發(fā)展具有重要意義。

1 宿主分布

中華絨螯蟹螺原體是第一個在甲殼類動物中被發(fā)現(xiàn)的螺旋體病原體，改變了學術(shù)界對螺旋體宿主的認知，該病原體之前就被確定為中華絨螯蟹震顫?。═D）的致病因素。對中華絨螯蟹螺原體的16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這種螺原體菌株與非凡螺原體（S. mirum）密切相關(guān)。過往的研究報告指出，從兔蜱（Haemaphysalis leporispalustris）中分離出的非凡螺原體具有感染脊椎動物和誘發(fā)乳鼠白內(nèi)障的能力。與預期結(jié)果相似，中華絨螯蟹螺原體除了會感染無脊椎動物，還能感染脊椎動物。其有能力在雞胚胎的卵黃囊中繁殖，進而出現(xiàn)在胚胎雞的大腦中。

2 毒力因子

螺原體是一種無壁的細菌，它依賴于宿主細胞之間蛋白質(zhì)的相互作用。螺原體的表面蛋白在黏附、入侵和與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。螺原體與血細胞之間的相互作用使螺原體能夠進入血細胞中。此外，螺原體是一種沒有細胞壁的溶血性菌種，因此不會產(chǎn)生外部毒素或內(nèi)毒素。在過去的研究中，磷脂酶已被報告為中華絨螯蟹的毒力因子，并發(fā)揮著關(guān)鍵作用。同時，相關(guān)研究結(jié)果表明，SE-LysoPL 在中華絨螯蟹螺原體的致病性中發(fā)揮著核心作用。Western blot 分析結(jié)果顯示，SELysoPL 是中華絨螯蟹螺原體的一種膜蛋白。利用抗體中和試驗，筆者還發(fā)現(xiàn)SE-LysoPL 可能是中華絨螯蟹螺原體的一個重要毒力因子，也在中華絨螯蟹螺原體的致病性和代謝反應中發(fā)揮了重要作用。

3 形態(tài)和運動能力

作為一種沒有細胞壁的獨特細菌，中華絨螯蟹螺原體擁有螺旋狀的細胞結(jié)構(gòu)，其尺寸為：長2.0～10.0 μm，寬77.6±8.8 nm，螺旋間距806.7±140.4 nm，螺旋直徑228.2±55.3 nm（n=200）。在秋水仙素存在的情況下，中華絨螯蟹螺原體將失去其細胞的螺旋性并破壞其致病性。此外，中華絨螯蟹螺原體細胞的極性是由一個錐形的末端體現(xiàn)的，通常被稱為尖端，細胞總是沿著它游泳。

自主移動是中華絨螯蟹螺原體的一個特點，螺旋形狀非常適合在半黏性介質(zhì)中移動[1]。中華絨螯蟹螺原體可以在黏稠介質(zhì)中以5 μm/s 的速度游動，行動非常迅速。隨著環(huán)境介質(zhì)黏度的增大，中華絨螯蟹螺原體的游動速度也在隨之提高。中華絨螯蟹螺原體沿細胞軸呈現(xiàn)出兩種手性，即右手和左手的螺旋細胞形狀，在尖端的作用下，手性從正面逆轉(zhuǎn)，在兩個螺旋的邊界上產(chǎn)生了扭結(jié)結(jié)構(gòu)。兩種手性共存使扭結(jié)的純機械傳播得以實現(xiàn)。隨著扭結(jié)點的移動，扭結(jié)點位置兩個相反方向的螺旋旋轉(zhuǎn)可以產(chǎn)生一個相同前進方向的推進力，像螺絲釘一樣通過與水的摩擦實現(xiàn)前進。環(huán)境黏度越大，游動速度就越快?？偟膩碚f，這種獨特的游泳機制可能有助于它們生存和感染宿主。

4 細胞骨架

中華絨螯蟹螺原體的螺旋形細胞形態(tài)是由內(nèi)部細胞骨架支撐的，細胞骨架由一個長約240 nm 的啞鈴形結(jié)構(gòu)和一個扁平的帶狀結(jié)構(gòu)組成。錐形頂端的啞鈴形結(jié)構(gòu)由一條扁平的帶子連接起來，該帶子沿體螺旋線跨越最短的螺旋路徑。游泳過程中的螺旋度轉(zhuǎn)移和扭結(jié)傳遞都取決于內(nèi)部的螺旋帶結(jié)構(gòu)，其由“纖維”絲和基因組中編碼的5 種MreB 蛋白（MreB1-5）中至少4 種MreBs（MreB1、2、4、5）組成?！袄w維狀”絲狀物是螺槳菌屬的特有產(chǎn)物。有壁細菌只擁有一種MreB 蛋白，在系統(tǒng)發(fā)育上與螺原體相距甚遠。上述事實足以說明螺原體的MreBs 與纖維絲的區(qū)別。因此，中華絨螯蟹螺原體中特殊的纖維絲和MreB 一直是一個研究的熱點話題。通過觀察發(fā)現(xiàn)，纖維素通過形成類似于細胞的半截體和位于細胞膜下的一定曲率，來決定細胞的螺旋度。MreBs是肌動蛋白家族的成員，被稱為聚合動力學，是基于核苷酸結(jié)合的，如ATP 和GTP，它們是螺旋槳游動的潛在發(fā)力者?；诰酆蟿恿W的均勻MreB 分子的聚合和解聚所形成的收縮和延伸導致MreB 絲的長度發(fā)生變化，并最終導致螺旋度轉(zhuǎn)變，這可以通過纖維絲來定義。螺旋度轉(zhuǎn)移在纖維絲中得到了完善，纖維絲專門用于轉(zhuǎn)移而不改變長度，并將沿著細胞軸線向下，產(chǎn)生上述基于帶狀物的軸向合作性扭結(jié)傳輸。

5 宿主免疫反應

5.1 中華絨螯蟹

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)普及率的日益提高，由中華絨螯蟹螺原體引起的震顫?。═D）開始大量出現(xiàn)，養(yǎng)殖者因TD 而遭受了巨大的經(jīng)濟損失。中華絨螯蟹螺原體最初通過破損的傷口和鰓進入宿主，然后入侵血細胞，這就是其感染的主要場所。中華絨螯蟹螺原體在血細胞中形成多個包涵體，隨著病原體的不斷增殖，包涵體不斷擴大最終導致血細胞破裂。同時，中華絨螯蟹螺原體通過血液循環(huán)不斷瞄準許多器官的結(jié)締組織，在后期，它們感染神經(jīng)系統(tǒng)并在神經(jīng)肌肉接頭和胸神經(jīng)節(jié)處大量繁殖，導致TD 發(fā)生。

基于中華絨螯蟹螺原體的致病性和特異性，人們進行了大量的研究，從基因表達、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯和蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）等層面闡述了宿主對TD 病原體免疫反應的分子機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中華田園綜合體的免疫系統(tǒng)在感染中華絨螯蟹螺原體后產(chǎn)生了強有力的反應，包括吞噬作用、丙酚氧化酶激活系統(tǒng)（proPO 系統(tǒng)）、血淋巴凝結(jié)系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)、抗菌蛋白等。與其他無脊椎動物的免疫系統(tǒng)相同，中華絨螯蟹依靠先天免疫，即細胞免疫和體液免疫來識別病原體和抵抗感染[2]。

對于甲殼動物來說，受體介導的吞噬作用是先天免疫系統(tǒng)的一個組成部分，可以幫助宿主細胞消除入侵的病原體[3]。過往的研究表明，中華絨螯蟹的VAMP（囊泡相關(guān)膜蛋白）在中華絨螯蟹螺原體的感染中存在差異性表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VAMP 參與了細胞的吞噬作用，并與溶酶體進行結(jié)合以防御入侵的中華絨螯蟹螺原體，轉(zhuǎn)錄抑制VAMP 后，被中華絨螯蟹螺原體吞噬和滅活的病原體就明顯減少了。

蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的分析表明，在中華絨螯蟹螺原體入侵期間，宿主增強了proPO 系統(tǒng)相關(guān)基因的表達，如Pox 和cSP，并改變了許多proPO 系統(tǒng)的相關(guān)蛋白，包括絲氨酸蛋白酶和蛋白酶抑制劑，同樣通過蛋白泛素化調(diào)控來增強proPO 蛋白的表達。

除了proPO 系統(tǒng)外，其他重要的甲殼動物防御機制、溶血凝固系統(tǒng)，也被認為可以加強中華絨螯蟹螺原體入侵后的免疫反應。根據(jù)中華絨螯蟹螺原體感染后轉(zhuǎn)錄圖譜的差異，確定了“補體和凝血級聯(lián)途徑”的富集基因簇。血球蛋白和凝血相關(guān)蛋白在感染期間都表現(xiàn)出相當大的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化。據(jù)推測，可能是入侵的病原體被凝血功能捕捉到了血栓中，從而激活了吞噬機制以消除病原體[4]。

通過觀察發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹螺原體提高的活性氧（ROSs）水平在被感染的果蠅S2 細胞中引發(fā)了細胞的凋亡和壞死，極大地降低了細胞的活力。中華絨螯蟹相應的抗氧化系統(tǒng)積極對抗氧化的影響，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、Trx 系統(tǒng)（硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、NADPH）、過氧還蛋白等都是該系統(tǒng)中關(guān)鍵的抗氧化因子。

5.2 羅氏沼蝦

作為被螺旋體攻擊的另一種甲殼類動物——羅氏沼蝦，同樣用蛋白組學技術(shù)來探索此類蝦對中華絨螯蟹螺原體的免疫功能，發(fā)現(xiàn)宿主體內(nèi)的細胞骨架蛋白（肌動蛋白和肌動蛋白相關(guān)蛋白）與病原的黏附和侵襲有關(guān)。Ras 相關(guān)核蛋白通過調(diào)節(jié)對螺原體的吞噬作用來參與羅氏沼蝦的先天性免疫反應，由于螺原體能逃避吞噬作用并形成良好的生活環(huán)境包涵體的特殊致病機制，沉默MrRan 卻能提高對蝦的存活率。

6 結(jié)論

螺原體缺少細胞壁，基因組簡單，結(jié)構(gòu)相對簡單。中華絨螯蟹螺原體呈螺旋狀，其細胞骨架由一個長約240 nm 的啞鈴形結(jié)構(gòu)和一個扁平的帶狀結(jié)構(gòu)組成。而中華絨螯蟹螺原體作為我國水產(chǎn)生物中華絨螯蟹震顫病的致病原，嚴重阻礙了我國水產(chǎn)經(jīng)濟的發(fā)展。除此之外，中華絨螯蟹還容易感染克氏原螯蝦、南美白對蝦、羅氏沼蝦和日本沼蝦，還能引起其他雞胚及果蠅等非水生生物的感染。據(jù)觀察，中華絨螯蟹螺原體可能通過尖端與宿主細胞結(jié)合，自主移動是中華絨螯蟹螺原體的特點之一。而在宿主反應過程中發(fā)現(xiàn)的SE-LysoPL 則是其核心的毒力因子，中華絨螯蟹螺原體的類似黏附蛋白（ALP）也參與了病原體-宿主的相互作用。對中華絨螯蟹螺原體的毒力因子、細胞骨架、運動形態(tài)、宿主反應等開展深入研究有助于為其引起的一系列不良反應提供預防、檢測和治療靶點，從而保障水產(chǎn)經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。