實驗教學用植物活體熒光影像系統(tǒng)的研制

王璠璘 賀新強 王東輝

北京大學學報(自然科學版) 第60卷 第1期 2024年1月

Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 60, No. 1 (Jan. 2024)

10.13209/j.0479-8023.2023.019

北京大學實驗室與設備管理部教學改革經(jīng)費資助

2022–12–13;

2023–02–02

實驗教學用植物活體熒光影像系統(tǒng)的研制

王璠璘 賀新強 王東輝?

北京大學生物學國家級實驗教學示范中心, 蛋白質(zhì)與植物基因研究國家重點實驗室, 北京大學生命科學學院, 北京 100871; ?通信作者, E-mail: wangdh@pku.edu.cn

通過植物培養(yǎng)及拍攝系統(tǒng)的開發(fā), 研制低成本的植物活體熒光影像系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用雙層箱體結構設計, 分為恒溫光照培養(yǎng)系統(tǒng)和熒光記錄系統(tǒng)兩部分, 可以為植物生長發(fā)育提供所需的生命支撐功能, 還能實時獲取植物生長發(fā)育過程中的關鍵圖像, 包括監(jiān)控轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育過程中熒光信號的時空模式。利用該系統(tǒng)成功地對EGFP轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥進行培養(yǎng)和實時觀察。低廉的成本極大地擴展了該系統(tǒng)在實驗教學中的運用, 也為生命活動的觀察和檢測研究奠定基礎。

儀器研制; 植物活體熒光影像系統(tǒng); 植物培養(yǎng)實時顯微記錄儀; 植物培養(yǎng)箱

培養(yǎng)植物材料是植物學研究的日常工作。人工氣候室和人工培養(yǎng)箱能夠用于控制植物的培養(yǎng)條件, 促進生命科學研究的發(fā)展, 尤其適用于研究時間尺度較長的植物發(fā)育過程。隨著學科的發(fā)展, 科研的需求日趨多樣化, 了解生命的發(fā)育過程成為生命科學研究的重點目標之一, 擁有不同功能的培養(yǎng)記錄箱也應運而生。

目前, 已有來自多個國家的公司或科研機構研制、設計并生產(chǎn)的功能多樣的活體成像裝置。“活體成像(imaging)”指研究者在不破壞、不殺死實驗材料的情況下, 對其信號(例如整體形貌、熒光蛋白信號、化學發(fā)光信號和 X 射線影像等)進行成像, 得到同一個體在整個生命周期中的信息。博益?zhèn)I(yè)公司的 Lumazone 系統(tǒng)和 Berthold 公司的LB 985 系統(tǒng)可以在目標植物的正常生活狀態(tài)下, 進行全光譜以及熒光成像, 為研究者提供快捷的檢測手段[1–2]。然而, LB 985 高達百萬元的售價阻礙了它在實驗教學中的廣泛應用。

本研究通過熒光激發(fā)光源和熒光拍照記錄系統(tǒng)的合理結合, 研制植物活體熒光影像系統(tǒng)。我們將這一系統(tǒng)整合到傳統(tǒng)的培養(yǎng)箱上, 制做低成本的植物培養(yǎng)實時記錄儀。該記錄儀可以為植物生長發(fā)育提供所需的生命支持功能, 并實時地獲取植物生長發(fā)育過程中的顯微和宏觀熒光圖像, 監(jiān)控植物發(fā)育過程中的關鍵因素。通過對擬南芥和煙草進行培養(yǎng)觀察, 驗證儀器的各種性能指標, 為后續(xù)對生命活動進行深入的觀察和檢測研究奠定基礎。

1 原理和設計思路

1.1 熒光成像的基本原理及活體熒光影像系統(tǒng)的設計思路

熒光是一種光致的冷發(fā)光現(xiàn)象。處于基態(tài)的熒光分子吸收激發(fā)光, 躍遷到激發(fā)態(tài), 經(jīng)過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程失去部分能量后, 再躍遷回到基態(tài), 發(fā)射比激發(fā)光波長更長的發(fā)射光(即熒光)。激發(fā)光與發(fā)射光的光譜并不重合, 它們原則上可以區(qū)分, 并且在實際應用中可以通過濾光片進行區(qū)分, 這就使得觀察到的結果僅來自特定空間位置的熒光分子。以此為基礎的熒光標記技術已經(jīng)在生命科學研究中得到廣泛應用。

基于熒光成像的原理, 可以將熒光活體成像技術分解為 3 個部分: 1)高靈敏度的光電轉(zhuǎn)換器件, 用來探測微弱的發(fā)射光信號; 2)合理的光譜分離系統(tǒng), 用來從激發(fā)光背景中分離發(fā)射光; 3)根據(jù)光源來切換拍攝系統(tǒng)的控制部件。由于該系統(tǒng)同時記錄植物在正常光照下的生長形態(tài), 因此需要在全光譜的環(huán)境光和激發(fā)光兩個不同光源條件下, 切換不同的拍攝系統(tǒng)。

1.2 植物培養(yǎng)實時記錄儀的設計思路

植物培養(yǎng)實時記錄儀是一個自動化的植物培養(yǎng)與拍照空間, 培養(yǎng)箱分為上下兩個分區(qū), 上層放置各種電路, 下層用于培養(yǎng)植物。相應的控制軟硬件整合了諸如光周期控制、拍攝參數(shù)控制等培養(yǎng)與記錄系統(tǒng)必不可少的功能。

2 植物活體熒光影像系統(tǒng)的建立

2.1 培養(yǎng)條件控制系統(tǒng)

植物培養(yǎng)條件控制包括光照控制與溫度控制兩部分。

光照控制首先需要合適的光源。光源應當能夠提供強度合適、分布均勻、頻譜合理的光照, 保證植物能在相同且適宜的光照下生長。我們選擇LED軌道燈(35W, 6000K, 簡稱 LBJ PAR30)作為培養(yǎng)光源, 并測試其強度與頻譜特性。此外, 我們通過繼電器與相應的控制軟件開發(fā)環(huán)境 LabView, 對植物的生長晝夜節(jié)律進行控制。由于白光光照會影響熒光的拍攝, 我們對培養(yǎng)條件控制系統(tǒng)和拍攝系統(tǒng)進行整合, 將培養(yǎng)條件控制系統(tǒng)和拍攝系統(tǒng)通過同一程序進行控制。用戶可以通過圖形用戶界面(GUI)一鍵開關白光, 并進行熒光成像。

強度是光照的重要指標。實測得到自然光條件下的照度如表 1 所示。在晴朗夏日的正午, 北京戶外開闊處的最強光照約為 12×104Lux。參考自然光條件的照度, 我們對人工條件下的照度進行評估。實測得到溫室中不同位置的照度為(4.0±0.8)×103Lux, 可以達到晴天蔭蔽處的光照水平。

頻譜是光照的另一重要指標。我們檢測了常用光源的頻譜(圖 1)。自然光光譜整體比較平穩(wěn), LED燈表現(xiàn)為幾個峰的疊加, 熒光燈的光譜由許多尖峰組成。進一步對比自然光與 LED 補光燈可以發(fā)現(xiàn), 3 款 LED 補光燈在 450nm 左右的紫光都具有更多的光譜成分; 在 500～600nm 的綠光與紫光處, LED 軌道燈 PAR30 與已建成溫室中的 LED 光源 HY-LED都具有更多的光譜成分, 而 GXP-450LED 與自然光基本上一致。GXP-450LED 在 650nm 左右的紅光區(qū)提供了額外的光照。到紅外區(qū), 只有自然光仍然具有一定強度的光照?？傮w來看, 我們選用的 LBJ PAR30 與溫室正在使用的 HY-LED 補光燈具有相對一致的光譜。

2.2 拍攝系統(tǒng)

培養(yǎng)箱的拍攝系統(tǒng)是一個集成像與控制為一身的機器視覺系統(tǒng)。一個典型的工業(yè)機器視覺應用系統(tǒng)組成包括光照系統(tǒng)、數(shù)字攝像機和機器視覺軟硬件[3]。

在正常的培養(yǎng)條件下, 培養(yǎng)箱通過植物生長燈為植物提供充足的白色光照。該光照也可以用于拍攝植物的形貌。為拍攝熒光信號的圖像, 系統(tǒng)需要合適的熒光激發(fā)光源, 包括波段合適的發(fā)光元件與激發(fā)光濾光片, 這是實現(xiàn)活體熒光成像的關鍵。數(shù)字攝像機也需要配備相對應的濾光片。

表1 自然光條件下的光強照度(Lux)

Sunlight: 陽光; LBJ PAR30: LED 軌道燈(35 W, 6000 K); GXP-450LED: 太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司的 GXP-450LED 培養(yǎng)箱的光源; HY-LED: 皓逸公司的皓悅系列燈具, 為已建成溫室中的 LED 光源; Philips Tubelight: 飛利浦公司的 Essential Tubelight 燈具, 為已建成溫室中的熒光燈光源

為了制作頻譜合適的激發(fā)光源, 我們選擇 LED, 因為特定顏色的 LED 具有相對較窄的光譜; 并且, 相較于與濾光片/單色器搭配使用的金鹵燈, 在單波長激發(fā)光的觀測條件下, 與濾光片搭配使用的 LED成本更為低廉。

合適的光源與濾光片組合可以進一步提高熒光影像的拍攝效果[4–5]。選擇濾光片的原則如下: 1)激發(fā)光與發(fā)射光的波段必須完全分離, 避免激發(fā)光的反射和散射影響發(fā)射光的觀測; 2)經(jīng)濾光片選擇后, 熒光分子對激發(fā)光的吸收效率應盡可能高, 產(chǎn)生發(fā)射光的熒光效率應當盡可能高, 以便提高信號強度; 3)截止波段, 濾光片的 OD 值應足夠高, 以便消除反射與散射的激發(fā)光。

構建儀器時, 將激發(fā)光濾光片置于準直的光源光線后, 發(fā)射光濾光片置于視場角較小的相機鏡頭前。準直的光源光線與較小的視場角都有助于避免濾光片在斜入射條件下展現(xiàn)不同的光學性質(zhì)。

基于上述選擇要點, 選定葉綠體和 EGFP 為需要觀測的熒光信號, 在進行多輪嘗試之后, 我們的熒光影像系統(tǒng)采用的配置如表 2 所示。發(fā)射濾光片固定在自制的濾光片轉(zhuǎn)換器上, 可以實現(xiàn)多通道的觀察。

為驗證光照系統(tǒng)的有效性, 我們首先分析激發(fā)光的光譜(圖 2)。在不使用濾光片時, LED 光源的光譜范圍相對較寬, 有相當一部分與 EGFP 的發(fā)射光譜重合, 并且占據(jù)強度較大的波段, 這對發(fā)射濾光片的選擇是不利的。加裝 460～490nm 的濾光片后, 激發(fā)光源的光譜顯著改善。

進一步, 我們拍攝 PTFE 標準白板在激發(fā)光照射下的影像, 驗證了發(fā)射光與激發(fā)光的有效分離。PTFE 標準白板是一種在紫外–可見–近紅外(200～ 2500nm)范圍內(nèi)都具有較高反射率(高于 98%)的漫反射材料(圖 2(a)), 且不會產(chǎn)生熒光, 可用于檢測反射光信號。不同光源與濾光片組合下的 PTFE 影像見圖 3。值得注意的是, 對 490～495nm 的青色 LED, 使用 460～490nm 濾光片濾光后, 透過 510nm 長波通濾光片或 523～537nm 濾光片進行觀察, 即使經(jīng)過長曝光(2 分 53 秒), 圖像中幾乎觀察不到 PTFE 漫反射影像。這表明, 上述光源與濾光片的組合有效地隔絕了反射信號。

表2 光源和濾光片參數(shù)

(a)光源、濾光片和 PTFE 的性質(zhì), PTFE 反射率數(shù)據(jù)來自供應商; (b)光源和濾光片的性質(zhì), 強度取對數(shù)坐標。濾光片的透過率非實測數(shù)據(jù), 僅用于示意

相機參數(shù)設置為Gamma=1, Contrast=0, RGB=(81, 64, 92), ISO=200

為了接收圖像傳感器傳回的數(shù)字圖像信息, 圖像傳感器/相機的供應商可能會提供閉源的控制軟件或者供開發(fā)者使用的 SDK (Software Development Kit)。在本文的活體熒光影像系統(tǒng)中, 我們采用相機自帶的 TSView7 拍攝軟件。該軟件提供的拍攝參數(shù)包括 Gamma, Contrast 和 ISO 等, 可用于優(yōu)化照片質(zhì)量。

3 植物活體熒光影像系統(tǒng)的應用

為探究目標基因在植物體內(nèi)的時空表達模式, 研究者可以將該基因的啟動子與報告基因進行連接, 構建出的基因片段可用于在植物中表達。報告基因的時空表達模式反映該基因的時空表達模式。其中, 常用的報告基因包括 GUS 和 GFP (綠色熒光蛋白)基因; 常用的模式植物包括擬南芥()和紅花煙草()。我們檢測了在擬南芥和煙草中的表達模式, 驗證了植物活體熒光影像系統(tǒng)的功能。

根據(jù)紅花煙草和擬南芥的形貌及對應的熒光影像(圖 4(a)), 對于活性較好的植株(第 1 行和 2 行), EGFP 轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)明顯的 EGFP 信號, 而非轉(zhuǎn)基因植株(WT)觀察不到信號。對于紅花煙草, 葉脈處的 EGFP 信號最強, 可能是因為葉脈比葉片更粗, 也可能與基因表達的調(diào)控有關。

(a) 煙草與擬南芥的影像, 左側(cè)植株為 EGFP 轉(zhuǎn)基因植株, 右側(cè)為野生型(WT); >510 nm 對應觀察葉綠素熒光, 523～537 nm 對應觀察EGFP熒光; 拍攝參數(shù)為Contrast = 0, RGB = (81, 64, 92), ISO = 200; 校正前、后分別表示未使用濾光片和使用濾光片后; (b) 不同成分干燥滅菌土壤的影像, 土壤未顯示熒光, 拍攝參數(shù)為曝光時間2分32秒, Gamma = 0, Contrast = 0, RGB = (81, 64, 92), ISO = 200

除 EGFP 轉(zhuǎn)基因植物樣本外, 我們在土壤和枯萎的葉片中也檢測到熒光信號。從圖 4(a)可以看出, 觀察葉綠素熒光(第 3 列)時, 第 2 行和第 3 行的土壤都觀察到顯著的熒光信號。觀察 EGFP 熒光(第 4列)時, 3 個樣品的土壤中都觀測到顯著的綠色信號。即便扣除 PTFE 板的反射信號本底后, 信號也沒有明顯減弱(第 5 列)。據(jù)此, 我們判定其為熒光信號。此外, 對于枯萎的葉片(第 3 行), 雖然它不能檢測到葉綠素的紅色信號(第 3 列), 卻表現(xiàn)出強烈的綠色熒光(第 5 列和 6 列)。以上兩個現(xiàn)象有可能源自熒光成像過程中的常見問題——自發(fā)熒光, 即樣品在沒有經(jīng)過人工處理時, 自身就具有熒光。因此, 在樣品觀測時, 應盡量去除植株枯萎的組織和器官。葉綠素熒光實際上也屬于自發(fā)熒光, 但距離 EGFP 的波段較遠, 因此可以使用濾光片將其從觀察波段中排除。干燥的滅菌土壤是觀察不到熒光的(圖 4(b)), 可考慮在周期性覆蓋干燥的土壤來排除土壤造成的熒光背景。

經(jīng)過對轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥的培養(yǎng)觀察, 證明此款在植物活體熒光影像系統(tǒng)基礎上搭建的植物培養(yǎng)實時記錄儀通過恒溫光照培養(yǎng)箱與熒光檢測記錄儀的雙向組合, 有效地解決了植物活體生長過程中基因表達觀察的難題。

4 結論

植物培養(yǎng)實時記錄儀是在植物活體影像系統(tǒng)基礎上搭建的一款功能模塊化設計多功能成像平臺, 可以最大程度地滿足植物科學研究最新的技術需要, 并為順應實驗技術的前沿發(fā)展方向, 預留了多種兼容方案。目前, 該記錄儀可應用于長時間監(jiān)測活體植物的生長變化情況, 并在記錄的同時, 調(diào)控其生長環(huán)境。相較于分子水平的研究, 更大時空尺度的研究為科研工作者理解植物中的基因功能及相互作用提供了額外的維度。

[1] Berthold. NightSHADE LB 985plant ima- ging system [EB/OL]. (2011) [2022–03–31]. https:// www.berthold.com/en/bioanalytic/products/in-vivo-im aging-systems/nightshade-lb985/

[2] 博益?zhèn)I(yè)儀器有限公司. Lumazone植物活體成像系統(tǒng)(生物發(fā)光和熒光)[EB/OL]. (2007) [2022–02–28]. http://www.bio-one.cn/CxcpDetails.aspx?xid=120

[3] 劉秀平, 景軍鋒, 張凱兵. 工業(yè)機器視覺技術及應用. 西安: 西安電子科技大學出版社, 2019: 1–2

[4] 愛特蒙特光學. 熒光濾光片套裝, 適用于綠色熒光蛋白(GFP)[EB/OL]. (2022) [2022–04–03]. https:// www.edmundoptics.cn/p/fluorescence-filter-set-for-gr een-fluorescence-protein-gfp/21525/

[5] 愛特蒙特光學. 熒光濾光片套裝, 適用于青色熒光蛋白(CFP)[EB/OL]. (2022) [2022–04–03]. https:// www.edmundoptics.cn/p/fluorescence-filter-set-for-cy an-fluorescence-protein-cfp/21522/

Research and Development of Living PlantsFluorescence Imaging System for Experimental Teaching

WANG Fanlin, HE Xinqiang, WANG Donghui?

National Teaching Center for Experimental Biology, State Key Laboratory of Protein and Plant Gene Research, School of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871; ? Corresponding author, E-mail: wangdh@pku.edu.cn

Through the development of plant culture and imaging system, a low-cost plant living fluorescence imaging system was developed. The system adopts a double-layer box structure design, which is divided into two parts: the constant culture system and the fluorescence recording system. It can provide the necessary life support function for plant growth, and can also obtain the key images in the process of plant growth in real time, including the time-space mode of monitoring the fluorescence signal in the development of the transgenic plant. The EGFP transgenic tobacco andwere successfully cultured and observed in real time using this system. The low cost greatly expanded the application of the system in experimental teaching, and also laid a foundation for the further study of the observation and detection of follow-up life activities.

instrument development;fluorescence imaging system for living plants; plant cultivation real-time microscope recorder; plant incubator