基于網(wǎng)絡藥理學及實驗驗證探討羅布麻葉-鉤藤藥對治療高血壓病的作用機制

李東娜，司香環(huán)，李宏佳，徐天舒，2

1. 南京中醫(yī)藥大學鼓樓臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210008

2. 南京大學附屬鼓樓醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 南京 210008

高血壓病的診斷標準指在未服用降壓藥的前提下，收縮壓（SBP）≥140 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa）、舒張壓（DBP）≥90 mm Hg。情緒、飲食、生活習慣等因素均會導致高血壓病的發(fā)生，進而對心臟、腎臟、大血管、腦等靶器官造成損害[1]。中醫(yī)學認為，高血壓病歸屬于眩暈、頭痛等范疇，風、火、痰、瘀、虛為病因，可造成肝風內(nèi)動，風陽上擾。中醫(yī)藥輔助治療高血壓病具有減輕臨床癥狀、增強降壓效果、預防心腦血管疾病發(fā)生的作用。

羅布麻葉具有清熱利水的功效，鉤藤有平肝熄風的功效。兩藥味甘、入肝經(jīng)，是治療高血壓病的常用藥對。該藥對可有效改善頭痛、頭暈癥狀，具有多靶點、安全有效的優(yōu)勢，但是羅布麻葉、鉤藤治療高血壓病的作用機制有待進一步探討。本研究從分子機制角度出發(fā)，采用網(wǎng)絡藥理學的方法，構建藥物-疾病網(wǎng)絡，分析兩藥之間的交叉靶點，為新藥開發(fā)、臨床用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 羅布麻葉-鉤藤藥對化學成分及相關靶點篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），檢索條件設定為口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，篩選出羅布麻葉、鉤藤的化學成分，并羅列出各個成分相關的靶點。

1.2 高血壓病疾病靶點檢索通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//www.omim.org/）進行疾病靶點檢索，檢索關鍵詞為“hypertension”，刪除重復靶點基因。

1.3 藥物-疾病共同靶點篩選及韋恩圖構建將藥物相關靶點、疾病靶點導入Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tool/venny），進行韋恩圖構建。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡構建借助STRING 軟件，將篩選出的藥物-疾病共同靶點數(shù)據(jù)導入，并下載TSV 數(shù)據(jù)文件，借助CytoScape 3.6.1軟件進行分析，得到Degree 值，使用CytoHubba 插件的MCC 算法找出PPI 網(wǎng)絡的核心基因。

1.5 基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析采用DAVID 數(shù)據(jù)庫，進行GO 與KEGG 富集分析，設定標準為P值＜0.05，選定P值最小的前20 條，使用ImageGP 作圖軟件進行可視化分析。

1.6 分子對接驗證在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中檢索并下載高血壓病靶蛋白的3D 結構，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索羅布麻葉、鉤藤，下載其活性成分的2D 結構。通過PyMOL 軟件對高血壓病的靶蛋白進行去除原配體、水分子等處理。最后將靶蛋白與分子的活性成分通過AutoDock 軟件進行對接，通過PyMOL 軟件將對接結果可視化。

1.7 實驗驗證

1.7.1 實驗動物健康雄性SD 大鼠12 只，體質(zhì)量（250±20）g，由上海必凱科翼生物科技有限公司提供。許可證號：SCXK（滬）2018-0006；動物質(zhì)量合格證號：20180006050317。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20～25 ℃，12 h 無光照/12 h 人工光照，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水。動物倫理審批號：2023AE02007。

1.7.2 藥品與試劑采購賽默飛世爾生物公司生產(chǎn)的Rat IL-10 Uncoated ELISA Kit（貨號：88-50629-88）及Servicebio 公司的Rat TNF-α ELISA Kit（GER0004）、Rat IL-1β ELISA Kit（GER0002）、Rat IL-6 ELISA Kit（GER0001）。

1.7.3 動物分組將12 只健康SD 大鼠分為空白組4 只和需要造模組8 只。

1.7.4 造模取健康SD 大鼠8 只，術前24 h 禁食，自由飲水。采用兩腎一夾法建立高血壓病大鼠模型。將大鼠用異氟烷吸入性麻醉后，仰臥位固定，大鼠腹部脫毛，消毒皮膚，于劍突下1.5 cm處沿腹正中線切開，于左腎門處游離腎動脈，在腎動脈下穿入無菌絲線，把直徑為0.25 mm 的針灸針與腎動脈血管長軸緊貼平行放置，用無菌絲線結扎腎動脈和針灸針，然后抽出針灸針，造成單側(cè)腎動脈狹窄[2]。術后3 d 每天腹腔注射青霉素鈉預防感染，并于術后24 h 禁食、不禁水，此后自由進食和飲水。術后第2 周末測量大鼠尾動脈SBP，以SBP≥140 mm Hg 作為造模成功的標準。

1.7.5 給藥方法將造模成功的8 只大鼠隨機分為模型組與治療組，每組4 只。治療組大鼠每天1 次予按照1∶1 比例制備的羅布麻葉-鉤藤藥液連續(xù)灌胃2 周，給藥量為10 g/kg，溶劑為純凈水。模型組與空白組給予等體積0.9%氯化鈉溶液連續(xù)灌胃2 周。

1.7.6 檢測指標在給藥1 周、2 周后分別測量3 次大鼠SBP 并取平均值；末次給藥后，將所有大鼠麻醉，剪切胸主動脈血管組織，制成切片，進行HE 染色及病理觀察；以酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清中白細胞介素（IL）-6、IL-10、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α 的含量。

1.8 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多樣本間比較用單因素方差分析和Tukey 事后檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 羅布麻葉-鉤藤藥對化學成分篩選見表1。根據(jù)1.1 中的條件篩選出羅布麻葉、鉤藤的有效成分總計39 個，其中羅布麻葉6 個，鉤藤33 個。

表1 羅布麻葉-鉤藤有效成分

2.2 羅布麻葉-鉤藤藥對主要化學成分相關靶點通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，參照藥物有效成分進行篩選，共得出945 個藥物靶點基因，其中羅布麻葉相關靶點基因151 個，鉤藤相關靶點基因794 個，其中符合標準的相關靶點基因為180 個。

2.3 高血壓病疾病靶點使用GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫分析，GeneCards 數(shù)據(jù)庫得到高血壓病靶點基因5 516 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫獲取的靶點基因為69 個，除去重復基因最終獲得疾病靶點基因5 550 個。

2.4 藥物-疾病交集靶點韋恩圖見圖1。通過篩選得到藥物靶點180 個、疾病靶點5 550 個，取交集得到152 個靶點，交集靶點有TNF、IL-6、IL-1β 等。

圖1 藥物-疾病交集靶點韋恩圖

2.5 PPI 網(wǎng)絡圖見圖2。利用STRING 在線分析平臺，選擇高置信0.700，將所得數(shù)據(jù)導入CytoScape 3.6.1 軟件，構建PPI 網(wǎng)絡，節(jié)點代表蛋白，有136 個，邊表示靶點之間的相互作用關系，有1 005 條。利用CytoHubba 插件找出PPI 網(wǎng)絡前10 位核心靶點，分別為TNF、IL-8、趨化因子配體2（CCL2）、細胞間黏附分子-1（ICAM1）、IL-1α、IL-6、IL-1β、IL-4、IL-2、IL-10。

圖2 藥物-疾病交集靶點PPI 網(wǎng)絡圖

2.6 GO 與KEGG 富集分析見圖3。GO 富集分析獲得778 條功能條目。細胞組分（BP）共有597 條，主要富集在RNA 聚合酶Ⅱ啟動因子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、凋亡過程的負調(diào)控、DNA 模板化等方面；分子功能（CC）共有59 條，主要富集在細胞外間隙、細胞質(zhì)、胞外區(qū)等；生物過程（MF）共有122 條，主要富集在酶結合、蛋白質(zhì)結合、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG 富集分析獲得122 條通路，有TNF信號通路、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、Toll樣受體（TLR）信號通路等。

圖3 GO 與KEGG 富集分析

2.7 分子對接分析見圖4、表2。將羅布麻葉-鉤藤藥對的主要活性成分槲皮素、山柰酚分別與高血壓病核心靶蛋白的前4 位TNF、CCL2、IL-8 和ICAM1 進行對接，結合能均＜-2 kcal/mol，提示配體與受體均能自發(fā)性結合。

圖4 羅布麻葉-鉤藤藥對活性成分與高血壓病核心靶點對接示意圖

表2 羅布麻葉-鉤藤藥對活性成分與高血壓病交集靶點及結合能

2.8 羅布麻葉-鉤藤藥對對高血壓病大鼠SBP 的影響見表3。干預1 周、2 周后，與同期空白組比較，模型組SBP 均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與同期模型組比較，治療組SBP 均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 3 組大鼠SBP 比較（）mm Hg

表3 3 組大鼠SBP 比較（）mm Hg

注：①與空白組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

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2.9 羅布麻葉-鉤藤藥對對大鼠胸主動脈結構的影響見圖5。HE 染色圖像顯示，空白組大鼠胸主動脈形態(tài)正常，血管壁內(nèi)膜、中膜和外膜之間結構層次清晰，中膜厚度適中，外膜與中膜邊界明顯；與空白組比較，模型組胸主動脈管壁內(nèi)膜結構排列紊亂，中膜增厚，外膜與中膜邊界模糊，部分外膜結締組織可見炎癥浸潤現(xiàn)象；治療組可見中膜排列較為整齊且增厚現(xiàn)象得到明顯改善，外膜與中膜邊界較為清晰，外膜結締組織炎癥浸潤現(xiàn)象明顯減少。

圖5 3 組大鼠胸主動脈組織病理檢查結果（HE 染色，×100，×200）

2.10 羅布麻葉-鉤藤藥對對大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 水平的影響見表4。干預2 周后，與空白組比較，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，治療組血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 3 組干預2 周血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平比較（）pg/mL

表4 3 組干預2 周血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平比較（）pg/mL

注：①與空白組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05

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3 討論

高血壓病是腦卒中、冠心病等疾病的重要誘發(fā)因素，中醫(yī)上分為肝火亢盛、陰陽兩虛、痰濕壅盛及陰虛陽亢等4 種證型[3]。臨床上羅布麻葉與鉤藤常作為藥對聯(lián)合使用治療高血壓病，在改善高血壓病的癥狀方面療效顯著。高峰等[4]以羅布麻治療高血壓病患者，結果發(fā)現(xiàn)羅布麻可有效降低血壓，且患者頭痛、心悸、耳鳴、失眠、眩暈、煩躁等臨床癥狀得以改善?？梢娏_布麻具有改善高血壓病患者的癥狀及輔助降壓的功效。黃華等[5]研究發(fā)現(xiàn)鉤藤堿影響轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1/Smad 通路，并可降低AngⅡ含量，調(diào)節(jié)改善自發(fā)性高血壓大鼠的心室重構，進而降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓。但對于中藥治療高血壓病的作用機制并不明確。本研究基于網(wǎng)絡藥理學的研究方法，篩選出羅布麻葉-鉤藤藥對的主要活性成分共39 個，治療高血壓病的靶點共152 個，與高血壓病相關的信號通路共122 條。

根據(jù)表1，篩選出羅布麻葉-鉤藤藥對的主要活性成分有β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、鉤藤堿、木犀草素等，其中山柰酚在羅布麻葉和鉤藤中都存在。相關研究表明β-谷甾醇與標準抗高血壓藥物賴諾普利相比，對高血壓病大鼠血清生化參數(shù)有更好的改善作用[6]。動物實驗研究結果表明，山柰酚對心血管具有保護作用，作用機制可能是通過刺激一氧化氮合酶增加血清一氧化氮含量，舒張血管[7]。研究提示，山柰酚通過利尿作用降低血壓[8]。槲皮素可以降低腎性高血壓病大鼠的血壓，主要是通過改變腎動脈平滑肌細胞內(nèi)游離鈣離子濃度降低血壓[9]。還有研究指出，通過將細胞氧化還原狀態(tài)調(diào)整為適應性反應或可耐受的壓力條件，可發(fā)揮其對心腦血管的保護作用[10]。鉤藤堿作為降壓藥物的活性成分主要是通過阻滯鈣離子通道，實現(xiàn)小動脈擴張、減慢心率和降低心輸出量來發(fā)揮作用[11]。木犀草素可以通過提高一氧化氮生物利用度、降低氧化應激標志物、逆轉(zhuǎn)心室收縮時間（QT）和QTc 間期延長，并降低腎損傷分子-1（Kim-1）、核因子-κB（NF-κB）和心肌肌鈣蛋白I（CTnI）的表達來起到降血壓的作用[12]。

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡前10 位核心基因推測，羅布麻葉-鉤藤藥對對高血壓病的治療作用可能與上述靶點有關。TNF-α 是高血壓病發(fā)病機制中至關重要的炎性因子，高血壓病導致氧化應激的產(chǎn)生，TNF-α 水平明顯升高[13]。肖芝秀等[14]研究表明高血壓病分級越高，TNF-α 水平越高。IL-8 和CCL2 是高血壓病發(fā)病過程中的重要趨化因子，相關研究發(fā)現(xiàn)，高血壓病的發(fā)病機制與IL-8 及CCL2 有關，IL-8 及CCL2可以影響單核細胞的黏附，使其浸潤血管壁[15]。ICAM-1 是免疫球蛋白家族中一種跨膜的單鏈糖蛋白，王紹華等[16]研究發(fā)現(xiàn)腎小管ICAM-1 的表達隨著高血壓病的進展不斷增加。高血壓病患者和實驗動物模型中IL-4 水平升高，研究發(fā)現(xiàn)其可誘導心肌內(nèi)皮細胞和成纖維細胞產(chǎn)生MCP-1，誘導心肌成纖維細胞中活性氧（ROS）介導的轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白（AP）1和膠原-1 的表達[17]。

通過KEGG 富集分析得出TNF、HIF-1、TLR、T 細胞受體等多種通路。研究表明，抑制TNF 信號通路可實現(xiàn)肺動脈高壓大鼠炎癥抑制目的[18]。HIF 屬于一組轉(zhuǎn)錄因子，可在轉(zhuǎn)錄水平上介導細胞對缺氧的大部分反應，HIF-α 信號在炎癥的啟動或調(diào)節(jié)中起著關鍵作用。HIF-α 信號參與組織重塑過程，有可能成為高血壓病新的治療靶點[19]。金晨等[20]發(fā)現(xiàn)TLR-4和高血壓病的發(fā)展密切相關，通過腎素-血管緊張素（RAS）系統(tǒng)激活和血管功能障礙、血管重塑，參與高血壓病的發(fā)生、發(fā)展。Yang T 等[21]觀察到自發(fā)性高血壓病大鼠結腸上皮中T 細胞受體信號通路受到抑制，結腸上皮細胞的功能變化可能與高血壓病的發(fā)病有關。

本研究結果顯示，經(jīng)過2 周的連續(xù)給藥，與模型組比較，治療組的SBP 降低，胸主動脈可見中膜排列較為整齊且增厚現(xiàn)象得到明顯改善，外膜與中膜邊界較為清晰，外膜結締組織炎癥浸潤現(xiàn)象明顯減少，其血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 水平均降低（P＜0.05），提示羅布麻葉-鉤藤藥對能有效且穩(wěn)定地降低高血壓病大鼠的血壓。這可能與羅布麻葉-鉤藤藥對能夠調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 的表達量有關。由此可推測，羅布麻葉-鉤藤藥對可通過抑制TNF 信號通路降低血壓。

綜上所述，基于網(wǎng)絡藥理學的方法對羅布麻葉-鉤藤藥對治療高血壓病的機制進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)羅布麻葉-鉤藤藥對主要的活性成分作用于TNF、HIF-1 等信號通路，通過氧化應激、血管重塑、炎癥反應等過程發(fā)揮降壓作用，證明了羅布麻葉-鉤藤治療高血壓病多通路協(xié)同作用的特點。