m6A mRNA修飾在心血管疾病中作用的研究進展

陳映泉綜述,鐘 勇審校

0 引 言

隨著醫(yī)療技術的進步和人口老齡化的發(fā)展,包括心血管疾病(cardiovascular disease,CVDs)在內的多種衰老相關疾病的患病率在世界范圍內持續(xù)上升。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修飾是一種在真核生物mRNA內部序列中富集的轉錄后調控修飾,參與調控包括自噬、炎癥、氧化應激、DNA損傷、細胞衰老的多個生物學過程,與CVDs的發(fā)生發(fā)展密切相關[1-2]。本文就m6A mRNA修飾在心血管衰老、CVD發(fā)生發(fā)展中的調控作用及其作為CVD生物標志物及治療靶點的重要價值作一綜述。

1 m6A修飾相關蛋白

m6A修飾主要由甲基轉移酶、去甲基化酶、結合蛋白共同調節(jié),可調控mRNA的穩(wěn)定性、剪接、核輸出、翻譯和降解。甲基化轉移酶復合物催化m6A修飾,其核心部分由甲基轉移樣蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)、METTL14、Wilms腫瘤蛋白1相關蛋白(wilms tumor 1-associated protein, WTAP)組成,此外,還包含METTL5、METTL16、ZC3H13、ZCCHC4、VIRMA/ KIAA1429、RBM15、RBM15B、CBLL1/ HAKAI等成分。METTL3可作為催化亞基與僅起結構作用的 METTL14形成共定位于核區(qū)的異源二聚體,在體內外催化m6A mRNA修飾。WTAP、METTL16、RBM15/RBM15B等雖缺乏催化活性,但可將METTL3-METTL14二聚體招募到核斑點,并將其靶向具有m6A修飾位點的RNA,提高甲基化效率和精確度。

m6A去甲基化酶包括脂肪肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)和AlkB同源物5(AlkB Homolog 5,ALKBH5),它們的發(fā)現(xiàn)證明了m6A RNA修飾是動態(tài)可逆的。m6A結合蛋白包括YTH結構域家族蛋白(YTHDC1/2和 YTHDF1/2/3)和HNRNP家族成員(HNRNPC、HNRNPG和 HNRNPA2B1),此外,還包括胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白(insulin-like growth factor-2 mRNA-binding proteins 1/2/3,IGF2BP1/2/3)、FMRP、eIF3、PRRC2A、RBMX、ELAVL1/HuR等,可選擇性識別發(fā)生m6A修飾的堿基,并激活下游信號通路,通過調控mRNA表達,決定m6A修飾的最終生物學功能[1]。

這些m6A效應蛋白在不同的生物系統(tǒng)中具有多方面的調節(jié)功能。METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDC1和YTHDC2已被證實與心力衰竭、心肌肥厚、心臟再生、缺血后血管生成、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓等有關。在上述變化過程中,m6A水平往往呈上升趨勢。然而,在某些情況下也可觀察到下降的趨勢[3]。

2 m6A修飾與心血管衰老

衰老是生物隨著時間的推移自發(fā)的必然過程,各種應激刺激可以加速這一過程,m6A甲基化修飾與之密切相關。有研究發(fā)現(xiàn),早衰細胞的m6A和METTL3水平偏低,過表達METTL3可通過增加MIS12 mRNA的表達挽救衰老表型,IGF2BP2可能通過穩(wěn)定MIS12 mRNA延緩細胞衰老[4]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)METTL3/14水平在經(jīng)歷復制性衰老的細胞中逐漸下降,過表達METTL14可減輕復制性衰老和過早衰老[5]。低流體剪切應力(fluid shear stress,FSS) 直接作用于血管壁內皮細胞,是許多CVDs的關鍵病理因素。一項研究發(fā)現(xiàn),在低FSS作用下,可觀察到RBM15和eIF3A的表達上調,m6A差異性表達,這比mRNA表達更早、更敏感。進一步的分析證實,低FSS可能通過改變mTOR、PI3K-AKT、胰島素和ERRB信號通路的m6A修飾,以及通過降低氧化應激反應中的關鍵轉錄因子HIF1a、NFAT5和NFE2L2的甲基化來調節(jié)衰老過程[6]。

3 m6A修飾與CVDs

3.1 m6A對CVDs危險因素的影響

3.1.1 高血壓FTO在調節(jié)能量平衡和新陳代謝的下丘腦中高度表達,因此,FTO變異與高血壓風險之間的相關性可能與交感血管舒縮張力的調節(jié)有關。有研究發(fā)現(xiàn),內皮細胞FTO過表達可通過減少PGD2的合成,促進動脈肌源性收縮,阻礙血管平滑肌的松弛,從而增加血管阻力,促進高血壓的發(fā)展[7]。

3.1.2糖尿病糖尿病是CVD的高危因素。多個研究發(fā)現(xiàn),在2型糖尿病患者的m6A呈下降趨勢,FTO過表達通過誘導FOXO1、G6PC和DGAT2的mRNA表達參與糖代謝,從而影響小鼠肝臟糖異生;FTO低表達可增加內皮細胞和骨骼肌的AKT的磷酸化,減輕高脂飲食誘導的胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良[7]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)METTL3低表達可改善葡萄糖耐量和胰島素敏感性,METTL14低表達可降低β細胞胰島素的分泌[8]。目前針對m6A修飾在Ⅰ型糖尿病中的作用的研究較少,最近一項研究發(fā)現(xiàn),Ⅰ型糖尿病患者m6A調控因子中METTL3和IGF2BP2的表達明顯下調,YTHDC1和HNRNPA2B1的表達明顯上調,具體機制有待進一步探討[9]。

3.1.3血脂異常與肥胖FTO可通過m6A-YTHDF2依賴機制調控CCNA2和CDK2的表達,進而調控有絲分裂克隆擴張,影響前脂肪細胞和脂肪形成的細胞周期進程[10]。FTO-YTHDF2軸也被證明可促進自噬小體的形成和自噬,從而促進脂肪生成[11]。METTL3通過m6A-YTHDF2依賴機制調控CCND1的表達,與FTO在脂肪形成中起相反的作用[12]。有研究證實,在高脂飲食誘導的肥胖型心肌病小鼠中,間斷性禁食可通過降低METTL3表達、增加FTO表達,降低m6A甲基化水平,從而減輕心臟脂質沉積和細胞凋亡[13]。

3.2m6A在CVDs中的作用

3.2.1 動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)As的發(fā)生與內皮細胞炎癥相關。FTO以m6A依賴和YTHDF3介導的方式調節(jié)動脈粥樣硬化保護基因(eNOS和KLF2)的表達,從而影響內皮細胞的炎癥反應[14]。敲除METTL14基因則可使Myd88和IL-6的表達減少,促進M2極化,抑制泡沫細胞形成[15]。此外,有研究表明,METTL3可通過m6A依賴的方式,在YTHDF1、YTHDF2參與下上調NLRP1 mRNA并下調KLF4 mRNA,激活p65/NF-κB通路,從而促進炎癥細胞的粘附和As的啟動[16]。然而,也有研究發(fā)現(xiàn)METTL3可通過加速降解振蕩誘導的EGFR mRNA表達,緩解內皮功能障礙,延緩As的進展[17]。

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖、遷移和表型轉化也受m6A修飾調控,與As的發(fā)生密切相關。FTO過表達可通過促進KLF5的表達,上調糖原合成酶激酶3的下游表達,促進了VSMCs的遷移,并促進了VSMCs從收縮表型向增殖表型的轉化,從而促進了動脈粥樣硬化、主動脈瘤的發(fā)展。相反,WTAP以m6A依賴的方式上調p16的表達,從而抑制了VSMCs的增殖和遷移[18]。

3.2.2腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)AAA以血管壁重塑和進行性擴張為特征,有研究發(fā)現(xiàn)AAA中m6A水平顯著提高,且高m6A水平會增加AAA破裂的風險。一項研究發(fā)現(xiàn),FTO與動脈瘤性平滑肌細胞和巨噬細胞的浸潤有很強的相關性,表明FTO可能在AAA的進展中發(fā)揮重要作用[14]。此外,RBM15、WTAP、ALKBH5和IGFBP3均在破裂性腹主動脈瘤中高度表達,并與免疫細胞浸潤強相關。RBM15可通過招募WTAP-METTL3-METTLE14 RNA甲基轉移酶復合物提高m6A水平,敲低RBM15可降低m6A依賴性的CASP3的表達,抑制人腹主動脈平滑肌細胞凋亡[19]。

3.2.3肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)PAH以肺血管不可逆的重塑為特征。缺氧條件下,大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中的METTL3和YTHDF2水平顯著升高,YTHDF2可識別METTL3介導的m6A修飾的PTEN mRNA,促進PTEN降解,進而激活PI3K/Akt信號通路,導致PASMCs過度增殖[20]。此外,肺泡巨噬細胞中YTHDF2可促進Hmox1 mRNA的降解,敲除YTHDF2可減輕體內外巨噬細胞的交替激活和PASMCs增殖[21]。另外有研究發(fā)現(xiàn),缺氧誘導的PAH小鼠PASMCs中SETD2和METTL14水平升高,特異性敲除SETD2可降低METTL14表達,延緩PAH進展[22]。

3.2.4心肌肥厚與肥厚型心肌病有研究表明,肥厚信號刺激的心肌細胞中m6A甲基化水平明顯增加,METTL3過表達可通過絲裂原活化蛋白(MAP3K6,MAP4K5,MAPK14)誘導代償性心肌肥厚,維持心血管功能的穩(wěn)定[23]。然而,另外一項研究觀察到從擴張心肌病樣本中分離的mRNA中m6A甲基化增加,表明敲除METTL3可促進心肌細胞的肥厚和重構,METTL3過表達減弱病理性心肌肥厚[24]。此外,肥厚心肌中YTHDF2的表達增加,從而通過m6A依賴性的MYH7 mRNA降解抑制心肌肥厚[25]。

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是一種的遺傳相關性心臟病,以不對稱心肌肥大為特征。臨床表型的異質性表明基因突變并不能說明HCM的全部情況。一項研究表明,YTHDC1和IGFBP3在HCM中高表達,YTHDC1可能影響了肥厚性心肌的有絲分裂和能量代謝,IGFBP3可能參與了心肌組織的免疫微環(huán)境和重構[26]。

3.2.5缺血性心臟病自噬異常與缺血性心臟病密切相關。有研究發(fā)現(xiàn),METTL3過表達可通過抑制缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷心肌細胞的自噬通量,促進細胞的凋亡,METTL3敲除小鼠的心肌梗塞減少,心功能改善;FTO、ALKBH5過表達則可出現(xiàn)相反的結果。此外,TFEB是溶酶體自噬的重要調節(jié)劑,可通過調節(jié)mRNA的穩(wěn)定性抑制METTL3表達并誘導ALKBH5表達,而METTL3表達反過來也可降低TFEB表達,建立了一個負反饋回路[27-28]。

大多數(shù)研究報道甲基化酶在心肌缺血時具有破壞性作用,去甲基化酶具有保護作用。例如,過表達METTL3具有促進心肌纖維化的作用,過表達WTAP促進了內質網(wǎng)應激和細胞凋亡,從而加重心肌I/R損傷[29];敲除METTL14基因抑制了PHLPP2 mRNA修飾并激活Akt-S473,通過PHLPP2調節(jié)心肌細胞的生長和凋亡,減輕小鼠心臟急性I/R損傷[30];FTO過表達可增加YAP1 mRNA的穩(wěn)定性來減輕心肌細胞的凋亡和炎癥,ALKBH5過表達可促進心肌細胞增殖,從而改善改善心臟功能[14]。然而,也有研究表明METTL14過表達可通過激活Wnt1/β-catenin信號通路,從而改善心功能,表明甲基化酶也可能具有保護作用[31]。

此外,有研究發(fā)現(xiàn),ALKBH5可通過 ErbB4 mRNA 去甲基化調節(jié)成纖維細胞活化以適應缺氧,在心肌梗塞早期對缺氧做出反應并促進疤痕修復。因此,ALKBH5/ErbB4是減少心臟破裂發(fā)生的可能治療靶點[32]。

3.2.6心力衰竭心肌細胞的喪失和收縮能力的缺乏是導致心力衰竭的主要致病機制。有研究表明,FTO過表達可通過調節(jié)Mhrt的m6A修飾來抑制缺氧-復氧處理的心肌細胞的凋亡,從而改善心力衰竭。此外,FTO過表達可將Ca2+處理轉錄本Serca2a去甲基化并增強Serca2a mRNA的穩(wěn)定性,從而改善心肌細胞的收縮功能,防止心力衰竭的進展。在一個橫向主動脈縮窄誘導的心力衰竭模型中發(fā)現(xiàn),心力衰竭時FTO低表達會增加Pgam2 m6A mRNA甲基化并促進其降解,進一步損害心肌組織的糖酵解過程和心臟收縮功能。另外可以觀察到,與正常小鼠相比,FTO敲除小鼠術后射血分數(shù)明顯降低,心室擴張明顯增加,從左心室肥厚到心力衰竭的時間顯著縮短[33-34]。以上研究證實FTO可以延緩心力衰竭的進展,并為心力衰竭的診斷和治療策略的發(fā)展提供新的途徑。

3.2.7心律失常到目前為止,探討m6A修飾與心律失常的關系的研究相對較少。一項研究表明FTO的整體敲除可導致心功能在交感神經(jīng)方向的自主神經(jīng)調節(jié)失衡,并可能導致心肌重構[14]。最近一項研究發(fā)現(xiàn),房顫患者心肌組織中RBM15B、IGFBP2、IGFBP3和ALKBH5的表達水平顯著升高,而HNRNPC和HNRNPA2B1的表達水平顯著降低,不同的m6A修飾模式可能通過影響免疫相關基因NCF2和HCST的表達參與房顫免疫微環(huán)境的的調節(jié)[35]。

3.2.8心臟瓣膜病主動脈瓣鈣化是最常見的心臟瓣膜病之一。有研究發(fā)現(xiàn),METTL3可通過m6A-YTHDF2依賴機制抑制TWIST1表達,從而促進人主動脈瓣間質細胞成骨分化,從而加重瓣膜鈣化并導致瓣膜心臟病的發(fā)展[36]。

3.3m6A在CVDs中的潛在應用

3.3.1 m6A作為潛在的生物標志物m6A修飾與CVD的發(fā)生發(fā)展密切相關。m6A對外界刺激的反應快速且及時,這使其具有作為診斷或預測CVD的生物標志物的潛力。此外,m6A修飾的檢測技術也在不斷創(chuàng)新,這使其具有投入臨床使用的可行性。心血管病的病理特征可能在一定程度上反映在外周血表轉錄組中,有研究表明心肌梗死后血液中FTO及m6A含量與心力衰竭的發(fā)展有關,通過血液檢測其含量可作為判斷心肌梗死預后的指標[37]。

3.3.2m6A作為CVDs的治療靶點m6A 相關蛋白在特定位點的調控機制的研究為其精準靶向治療提供了可能。例如,山楂酸可通過調節(jié)METTL3介導的m6A修飾抗心肌肥厚[38];三七總皂苷可通過促進WTAP及其下游靶蛋白p16 的表達來抑制VSMCs的增殖和遷移,為評估血管成形術后內膜增生的風險提供了一種潛在的生物標志物,以及一種新的治療靶點[39]。融合蛋白dm6ACRISPR通過連接催化不同活性的酶到ALKBH5,調控mRNA的穩(wěn)定性或翻譯,特異性地將具有m6A標記的轉錄本去甲基化,可能用于CVD的基因抑制和細胞功能調控[40]。此外,通過白藜蘆醇、姜黃素、間歇禁食和糞便微生物區(qū)系移植改善m6A水平也被證實可以有效地減少包括CVDs在內的代謝相關疾病的進展[3]。

4 結語與展望

綜上所述,m6A mRNA修飾在心血管衰老及穩(wěn)定心血管功能中起重要的調控作用并可作為CVDs的潛在生物標志物和治療靶點。目前m6A在CVDs中的作用機制的闡述大多集中在METTL3、METTL14、FTO和ALKBH5,其他調控因子及各調控因子間的相互作用機制有待進一步研究。m6A修飾在心律失常、Ⅰ型糖尿病中的作用機制的研究也相對較少。其次,雖然在包括缺血性心臟病和心力衰竭在內的大多數(shù)CVDs中m6A呈現(xiàn)升高趨勢,去甲基化酶過表達可產生保護性作用,但仍存在一些相悖的結論,甲基化酶及去甲基化酶相關激活劑及抑制劑的臨床適應癥也有待論證。此外,m6A修飾不僅可調控mRNA表達還能調控ncRNA的表達,從而影響生物學功能,其靶點缺乏單一性,可能產生的副作用需要被充分考慮,這限制了m6A效應劑的臨床應用。最后,m6A經(jīng)濟方便的檢測技術有待進一步研發(fā)。因此,距離將m6A mRNA修飾常規(guī)應用于臨床診療中還有很長的路要走。