牛結(jié)核病診斷技術(shù)研究進(jìn)展

文│陳亮（四川省三臺縣動物疫病預(yù)防控制中心）

牛結(jié)核病被世界動物衛(wèi)生組織列為法定報告的動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。該病可以在人類和家畜或者野生動物之間傳播，危害巨大，有學(xué)者指出，“牛結(jié)核病是對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最具破壞力的傳染病之一”。牛奶及其制品是人類經(jīng)常飲用（食用）的食品，其受到污染也會導(dǎo)致人類感染。由于誤食受污染的乳制品而感染肺結(jié)核的患者占總患者的10%以上。由于抗生素濫用、牲畜調(diào)運(yùn)增多等因素，牛結(jié)核病的發(fā)生率顯著提升，嚴(yán)重影響了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，公共衛(wèi)生安全也受到威脅。由于牛結(jié)核病還沒有有效的疫苗，多數(shù)國家通過監(jiān)測，將檢測出的陽性個體進(jìn)行撲殺來防控牛結(jié)核病。為了更好地預(yù)防和控制牛結(jié)核病，筆者對牛結(jié)核病的病原學(xué)特性、流行病學(xué)特點(diǎn)和診斷技術(shù)等進(jìn)行綜述，希望為控制和消滅牛結(jié)核病提供部分理論支撐。

一、病原學(xué)特性

牛結(jié)核病的病原為分枝桿菌屬的牛分枝桿菌。牛分枝桿菌為革蘭氏陽性菌，為專性需氧菌，長1.5～4微米，寬0.2～0.5微米，無鞭毛，無運(yùn)動性，不形成芽孢。體外培養(yǎng)牛分枝桿菌時，溫度需設(shè)定為37.5℃，pH＝5.9～6.9，在此條件下，該菌可較好生長，但生長速度較慢。牛分枝桿菌對外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，在陰濕處可存活5個月以上，干燥環(huán)境下可存活10個月，在水中可存活半年，在糞便和土壤中可以存活6～7個月。但分枝桿菌在高溫下不易存活，陽光暴曬2小時，60℃下10～30分鐘，85℃下5分鐘，90℃下1分鐘都可以殺死該菌。

二、流行病學(xué)

病畜和帶菌畜是牛結(jié)核病的主要傳染源，病畜和帶菌畜的分泌物和排泄物中均帶菌。牛分枝桿菌可以通過呼吸道、消化道和皮膚黏膜傳播。結(jié)核病病?？人詴r，會將帶有牛分枝桿菌的飛沫排放到空氣中，?；蛘咂渌麆游镂霂Ь娘w沫就會感染結(jié)核病。食用被結(jié)核菌污染的食物或未經(jīng)消毒的乳產(chǎn)品也會感染結(jié)核病。牛分枝桿菌易感染牛尤其是奶牛，其次是人、禽類和野生動物等。該病無明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，在農(nóng)村散發(fā)，規(guī)模化養(yǎng)殖場因圈舍通風(fēng)差，互相接觸多，多呈區(qū)域性流行。

三、診斷方法

1.細(xì)菌學(xué)方法。

（1）涂片染色法。采集典型病變組織（如肺、肝）樣進(jìn)行涂片，并使用萋尼二氏抗酸染色法染色，在顯微鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌會被染成紅色，而其他細(xì)菌會被染成藍(lán)色。涂片染色法操作簡便、設(shè)備簡單，是使用較普遍的方法。但此方法無法鑒別出分枝桿菌和非典型分枝桿菌，缺乏特異性，而且實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn)性不高，只適合檢測病菌數(shù)量多的組織樣品。因此，涂片染色法一般用于初步診斷，如需確診還需要結(jié)合其他的診斷技術(shù)。

（2）細(xì)菌培養(yǎng)法。培養(yǎng)法是診斷牛結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)方法。采集病牛鼻腔中的分泌物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，根據(jù)菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu)判定是分枝桿菌還是其他細(xì)菌。此法對病菌含量較低的組織樣也可以檢測出，且靈敏度高。但由于結(jié)核菌生長周期長，一般為4～8周，而且培養(yǎng)成功率僅占發(fā)病病例的10%～20%。為了避免污染物帶來的影響，可以使用高效液相色譜去污法控制樣品中污染物的生長，這樣可以縮短樣品處理的時間，縮短牛分枝桿菌的分離時長，從而幫助菌落的早期生長。

（3）噬菌體生物擴(kuò)增法。分枝桿菌噬菌體具有特定的宿主菌譜，且只能感染活的分枝桿菌。分枝桿菌噬菌體感染宿主后，可以在把宿主菌完全裂解前持續(xù)增殖，子代的噬菌體就會隨著菌體的裂解而釋放，與相應(yīng)的指示細(xì)胞結(jié)合后又通過裂解指示細(xì)胞釋放，最后在瓊脂平板上呈現(xiàn)出透明的噬菌斑。根據(jù)瓊脂平板上是否有噬菌斑就可以判斷樣品中是否含有活的分枝桿菌。該方法在國外已商品化應(yīng)用，我們近些年才開始重視和使用。

2.分子生物學(xué)診斷技術(shù)。

（1）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR技術(shù)）是將特定的DNA片段或cDNA片段在體外特定條件下短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的片段，其靈敏性、特異性和檢測速度都得到認(rèn)可。目前，常用的包括逆轉(zhuǎn)錄PCR法、套氏PCR法、單管套式逆轉(zhuǎn)錄PCR法、實(shí)時熒光PCR法、酶聯(lián)PCR法等。PCR技術(shù)靈敏度高，檢測速度快，還可以有效避免其他非結(jié)核分枝桿菌的干擾，但由于此檢測方法需要專業(yè)的檢測人員和專業(yè)的檢測設(shè)備，所以多在檢測機(jī)構(gòu)使用。

（2）DNA核酸探針檢測法。將特異性的DNA片段使用特殊的示蹤劑進(jìn)行標(biāo)記作為探針，在特定條件下與待檢樣品DNA分子上的遺傳片段進(jìn)行互補(bǔ)雜交。這樣就可以確定結(jié)核分枝桿菌的種類。目前比較常用的有cDNA探針、全染色體核酸探針、寡聚核酸探針和克隆核酸探針等。

（3）全基因組測序。全基因組測序技術(shù)是將待測樣品的基因進(jìn)行高通量測序，從而得到全基因組序列，再使用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，從基因組學(xué)層面進(jìn)行調(diào)查。全基因組測序技術(shù)可以結(jié)合數(shù)學(xué)模型，鑒別和分析同一地區(qū)不同物種間的毒株型，進(jìn)而了解跨物種的動態(tài)傳播方式。此方法全面、精準(zhǔn)，而且快捷高效，但成本和技術(shù)要求較高，只適用于實(shí)驗(yàn)室檢測。

3.免疫學(xué)診斷技術(shù)。

（1）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。ESAT-6和CFP-10是結(jié)核菌素早期分泌的抗原，是做皮試反應(yīng)的首選抗原。將分離純化的抗原注射到牛頸中部或者尾褶部皮膚皮內(nèi)，觀察比較注射前和注射后72小時的皮膚腫脹情況，從而判斷是否患牛結(jié)核病。此方法的缺陷是特異性低，無法區(qū)分出因感染其他分枝桿菌而致敏的動物，而且對那些因病情嚴(yán)重而免疫力低下的動物也容易出現(xiàn)假陰性。那些感染了副結(jié)核分枝桿菌等環(huán)境分枝桿菌的動物也有可能出現(xiàn)假陽性。提純結(jié)核菌素的質(zhì)量和劑量，檢測人員的操作經(jīng)驗(yàn)和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)等均會影響結(jié)果。為了消除禽分枝桿菌的干擾，現(xiàn)在使用較多的是比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)。在牛頸部一側(cè)相隔大于12厘米的位置分別注射牛結(jié)核菌素和禽結(jié)核菌素，注射量超過2000國際單位/頭，注射完成后觀察到豌豆?fàn)畹墓陌?，即代表皮?nèi)注射成功。

（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。牛感染牛分枝桿菌后，B淋巴細(xì)胞會產(chǎn)生對應(yīng)的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生與疾病發(fā)展態(tài)勢呈正相關(guān)的抗體。該實(shí)驗(yàn)原理是利用具有特異性的抗原（如融合蛋白）作為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的診斷抗原，檢測血清內(nèi)是否含有結(jié)核菌抗體。該方法操作便捷、快速、靈敏度高。缺點(diǎn)是牛分枝桿菌的抗原性較弱，假陽性出現(xiàn)概率大。

（3）γ-干擾素診斷法。利用牛結(jié)核刺激抗原，如提純結(jié)核菌素，與體外培養(yǎng)出的致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合，致敏淋巴細(xì)胞會分泌出大量的γ-干擾素，然后通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來檢測γ-干擾素的表達(dá)水平，從而得到判定結(jié)果。健康牛的淋巴細(xì)胞不會以特定的方式產(chǎn)生γ-干擾素，所以該法可以降低檢測假陽性和假陰性的發(fā)生率。此法與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)合使用，檢測準(zhǔn)確度較高，而且由于在體外進(jìn)行，不會干擾牛本身的免疫情況，同一頭牛可進(jìn)行多次試驗(yàn)。但此方法成本較高，不適合基層大范圍使用。

四、結(jié)語

牛結(jié)核病的防控對促進(jìn)畜牧業(yè)健康發(fā)展，保障人類健康具有重要意義。臨床上可以使用細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法對結(jié)核病進(jìn)行診斷，但由于分子生物學(xué)技術(shù)需要專業(yè)儀器，且技術(shù)要求高，血清學(xué)技術(shù)所需試劑，價格昂貴。目前，較普遍的診斷方式是先通過結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)進(jìn)行初步判定，對疑似病例再使用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步確診。