山羊基因編輯研究進展

賈宇，杜瑞麟，閆爍，張思雨，趙宇龍，高原，郭鵬飛，楊燕燕，宋永利，李喜和,4*

（1.內(nèi)蒙古大學省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070； 2.內(nèi)蒙古大學生命科學學院蒙古高原動物遺傳資源研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070； 3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院畜牧研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000； 4.內(nèi)蒙古賽科星家畜種業(yè)與繁育生物技術研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011517）

山羊作為人類早期馴化的家畜之一，有多種分類方式。按照體高可分為大型種、中型種及小型種，按照生產(chǎn)用途可分為乳用型、絨用型、毛用型、皮用型、肉用型及普通山羊[1-2]。奶山羊是公認的重要乳用品種山羊，其奶源營養(yǎng)價值頗高，適合飲用，是現(xiàn)代乳品、乳制品等的重要原料之一。絨用型山羊、毛用型山羊和皮用型山羊這3 個品種羊的絨、毛及皮產(chǎn)量和質(zhì)量較高，被人類廣泛應用于服裝制造、材料加工等行業(yè)。肉用型山羊如波爾山羊的肉用性能較高。然而，普通山羊各個方面的生產(chǎn)性能都較為單一，無突出優(yōu)點，常被用作科研動物模型，如研究山羊某一基因的選擇性表達等。

1 乳用型山羊基因敲除研究進展

乳脂中有98%是甘油三酯（triglyceride，TAG），其余由膽固醇和游離脂肪酸組成。TAG 中的單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）為人類提供能量，有抗心血管和抗炎作用。羊奶一直被認為是一種營養(yǎng)保健品，因為它的脂肪球更小，脂肪含量更高，且擁有比牛奶更低的致敏性。與牛奶相比，羊奶TAG中的中、短鏈脂肪酸（medium-chain fatty acid，MFA；short-chainfatty acid，SFA） 和不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）含量較高。

相比于牛奶，羊奶產(chǎn)量一直較低，而含有特定營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因奶山羊的乳汁產(chǎn)量則更為稀缺。近年來，對山羊奶奶源的研究逐漸增多。賈啟鵬等[3]通過基因編輯技術，利用成簇有規(guī)律間隔的短回文重復序列 （clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR） 及其相關蛋白 9 （CRISPR -associated 9，Cas9） 和雙載體轉(zhuǎn)染法獲得β-酪蛋白（β-casein，CSN2）基因敲除的細胞，為羊奶CSN2 基因敲除提供了核供體。該試驗首次在奶山羊胎兒成纖維細胞上實現(xiàn)7 760 bp 基因長片段的敲除，篩選出了奶山羊胎兒成纖維細胞敲除系最高陽性細胞比例獲得方案，從而優(yōu)化了大片段陽性細胞制備技術。田慧彬[4]又利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)探究了硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）基因在乳腺脂肪酸代謝中的功能。結果表明，SCD1 對MUFA生物合成有重要影響，同時也調(diào)控著TAG 和膽固醇的合成。該研究成果為小鼠和奶山羊SCD1 基因敲除提供了技術支持。乙酰/丙二酸單酰基轉(zhuǎn)移酶（acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases，MAT） 是脂肪酸合酶的一個功能域，反芻動物的MAT 功能域在脂肪酸合成過程中同時具有起始、延長與終止活性功能，在動物機體合成MFA、SFA 時起關鍵作用。姚瑋瑋[5]對敲除MAT 基因的乳腺上皮細胞模型進行脂代謝功能研究，發(fā)現(xiàn)大部分相關脂肪酸合成基因均顯著下調(diào)。microRNA（miRNA）-24 在非反芻動物的脂肪組織和肝臟的脂質(zhì)代謝中起著重要作用。為明確miRNA-24 在反芻動物奶山羊中的具體作用，Huang 等[6]在原代山羊乳腺上皮細胞（goat mammary epithelial cells，GMEC） 中鑒定了miRNA-24 在調(diào)節(jié)乳汁脂肪合成和分泌過程中的功能，發(fā)現(xiàn)miRNA-24 能夠降低脂肪酸、TAG 和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相關基因的基因豐度，miRNA-24 的敲除會抑制脂滴、TAG 和膽固醇合成并影響脂肪酸組成。該研究結果為miRNA-24 在山羊乳腺細胞脂質(zhì)代謝中具有重要生物學作用提供了證據(jù)。以上研究為山羊乳腺細胞乳蛋白、乳脂合成代謝提供了重要生物學證據(jù)，并對改善羊奶脂肪酸含量奠定了基礎。

此外，奶山羊的群體性別比例對生產(chǎn)性能和經(jīng)濟效益也有重要影響，因此通過轉(zhuǎn)基因技術進行性別控制也是科研熱點之一。Zfy 是控制哺乳動物性別的關鍵基因之一。黃敏等[7]將薩能奶山羊成纖維細胞Zfy 基因敲除進行研究，從而為奶山羊Zfy 基因的功能研究及性別控制技術的發(fā)展奠定了理論與技術基礎。

2 絨用型山羊基因敲除研究進展

絨山羊是一種以產(chǎn)絨為主的絨肉兼用型優(yōu)良山羊品種。絨山羊的產(chǎn)絨性能和質(zhì)量與其經(jīng)濟效益密切相關，因此絨山羊的研究以其產(chǎn)絨性能為熱點。第一個上皮性角蛋白輔助蛋白（KAP）的發(fā)現(xiàn)表明，KAP 家族基因與毛囊的生長發(fā)育存在緊密關系。此外在真皮乳頭狀細胞中，同源蛋白盒（Hox）轉(zhuǎn)錄因子的表達控制著毛囊生長的區(qū)域差異。2020 年，在CRISPR/Cas9的理論基礎下，單基因編輯技術也隨之誕生。同年，李冠緯[8]利用以上技術，通過第3 代單基因編輯器（BE3）對陜北白絨山羊的成纖維細胞生長因子5 （FGF5）基因進行敲除。已知FGF5 基因是毛發(fā)生長發(fā)育的關鍵因子，其存在可抑制陜北白絨山羊絨毛的生長。當FGF5 基因被敲除后，陜北白絨山羊絨毛生長速度明顯加快，羊絨產(chǎn)量進一步提升。并且相關專家利用FGF5 基因在其他動物身上也開展了研究，F(xiàn)GF5 的錯義突變與單峰駱駝毛長變化有關[9]。膽固醇修飾的siRNA 抑制FGF5 和FGF18 的表達，可促進小鼠的毛發(fā)生長，延邊牛適應極端寒冷的氣候也與FGF5 有關。Lei 等[10]鑒定了羊毛囊形成、表皮分化和毛囊干細胞發(fā)育相關的重要基因有PRX、SOX18、TGM3 和TCF3。He 等[11]通過基因網(wǎng)絡分析又揭示了羊毛囊形態(tài)發(fā)育相關的關鍵基因如LAMA10、WNT25A、KRT1、SOSTDC21、ZDHHC1、FZD7、BMP4、LRP2、TGFβ79、TMEM10、SOX4、ITGB14、KRT6、ITGA2 和GLI 等。Yu等[12]研究了miR-27a 及其靶向基因PIK3R3 對AKT/MTOR 途徑以及綿羊毛囊干細胞（HFSCS）增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)PIK3R3 表達的敲低可顯著抑制HFSCs的增殖并促進其凋亡，同樣，miR-27a 模擬物顯著抑制了HFSCs 的增殖并促進了細胞凋亡。

內(nèi)蒙古絨山羊是中國優(yōu)秀的地方品種，根據(jù)羊被毛的長度可分為3 種類型：長毛型（毛長＞22 cm）、短毛型（毛長≤13 cm）和中間型（13 cm＜毛長≤22 cm）。毛發(fā)長度也影響著羊絨經(jīng)濟價值，為探究不同毛型生長的分子機制及相關調(diào)控基因，Gong 等[13]對12 月齡內(nèi)蒙古長毛型（LHG）和短毛型絨山羊（SHG）的基因表達數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)進行了研究，探索了不同毛型和其相關的9 個候選基因共表達模塊。結果表明，加權基因共表達網(wǎng)絡分析（WGCNA）將這些基因分為19 個共表達模塊，其中1 個模塊與不同毛發(fā)類型之間存在很強的相關性。該模塊基因在LHG 中高表達，在SHG 中低表達； 對該模塊基因進行GO 功能分析，結果主要富集在細胞成分；KEGG 通路主要富集精氨酸以及脯氨酸代謝 （chx04010） 和MAPK 信號通路（chx39）。與此同時，他們也篩選了不同毛型相關的候選基因，包括KRT74、KRT100861184、LOC102177231、LOC102178767、LOC102179881、LOC106503203、LOC108638293、LOC108638298 和LOC 等。通過qRTPCR 檢測發(fā)現(xiàn)，2 種毛發(fā)類型之間的這些候選基因表達存在顯著差異，且大多與毛長呈顯著正相關。以上研究中大量與山羊皮、絨毛生長發(fā)育相關基因的發(fā)現(xiàn)都可作為改善皮、絨毛的理論研究基礎，進一步研究后可應用于生產(chǎn)實踐。

3 肉用型山羊基因敲除研究進展

目前，人類嚴重依賴牲畜來滿足肉類、奶類等日?；旧钚枨?。肉質(zhì)性狀的控制、改良是畜牧業(yè)生產(chǎn)（包括豬、牛及羊等）的重要目標。因此，更好地了解肌肉發(fā)育及最終生長結果的生化特性是動物生產(chǎn)和肉類科學的主要挑戰(zhàn)課題。有關肌肉的研究能使養(yǎng)殖者了解動物的肌肉生長特性，從而更好地管理豬、牛及羊等，最終提高肉用型動物的經(jīng)濟效益。為了在短期內(nèi)迅速培育優(yōu)良品種，對牲畜進行基因改造成為最好的策略之一?；蚬こ毯娃D(zhuǎn)基因的優(yōu)勢可在短時間內(nèi)顯著提高牲畜生產(chǎn)性能，增加經(jīng)濟效益。肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）是動物體內(nèi)天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，是一種眾所周知的骨骼肌發(fā)育負調(diào)節(jié)因子，具有抑制動物肌肉生長的功能。1997 年，美國約翰霍普金斯大學的Mcpherron 博士首次發(fā)現(xiàn)MSTN 是影響肌肉生長的最主要的代謝限制因子[14]。MSTN 蛋白由MSTN 基因編碼，位于2 號染色體2q32.2；它在3 個外顯子中編碼375 個氨基酸，占據(jù)大約8 kb 的位置。MSTN 基因編碼區(qū)自然突變導致表達量減少，敲低或敲除MSTN 會導致肌肉量增加，這一發(fā)現(xiàn)被認為是研究提高肌肉量和發(fā)展肉用型家畜的重大成功。MSTN基因突變可導致豬、牛、羊和人類出現(xiàn)肌肉肥大或雙?。―M）表型，而MSTN 的過表達則與肌肉萎縮有關。Zhang 等[15]利用CRISPR/Cas9 和體細胞核移植相結合的方法構建了位點特異性敲入阿巴斯絨山羊模型，將FAT1 基因特異性插入山羊MSTN 位點，實現(xiàn)了FAT1插入與MSTN 同步突變。劉姣[16]在陜北白絨山羊?qū)崿F(xiàn)了這2 個基因的同時編輯，并且發(fā)現(xiàn)MSTN 敲除后絨山羊的能量和蛋白質(zhì)代謝相關通路被影響，從而促進了肌肉生長。同年，為了對比CRISPR/Cas9 和轉(zhuǎn)錄激 活 因 子 樣 效 應 物 核 酸 酶 ［transcription activator-like （TAL ） effector nucleases，TALENs］這2 種基因編輯技術在大型動物中進行基因組編輯的差異, Zhang 等[17]通過構建絨山羊模型應用CRISPR/Cas9 和TALENs 技術在多個水平上敲除MSTN 基因。結果發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9 獲得MSTN 的突變頻率是TALENs 的8.5 倍。相比于TALENs 技術，CRISPR/Cas9 更精確、效率更高，具有顯著優(yōu)勢。這可能也是CRISPR/Cas9 技術在生物技術領域成為首選的基因編輯技術，獲得一致認可的原因之一。Kumar等[18]評估了MSTN 下調(diào)對山羊成肌細胞中MRF 基因家族（MyoD、Myf5）、follistatin（FST）和IGF（IGF-1 和IGF-2） 表達的影響。結果表明，MSTN 下調(diào)導致MyoD 表達上調(diào)，Myf5 和FST 表達下調(diào)。此外，在培養(yǎng)4 d 后，成肌細胞增殖增強了4 倍，證明了MSTN基因位點編輯可用于轉(zhuǎn)基因山羊的生產(chǎn)培育，以增加肌肉質(zhì)量、提高屠宰率并增加經(jīng)濟效益。CRISPR/Cas 介導的是一種包括間隔獲取、crRNA （CRISPR RNA）生物發(fā)生/表達和靶標干擾3 個機制步驟在內(nèi)的微生物免疫應答反應，位點特異性Cas9 生成的位點特異性雙鏈斷裂（DSB），在低等生物中能有效刺激同源重組 （homologous recombination，HR） 通路約10 000 倍，憑借此方法可以更好地提高糧食生產(chǎn)，如肉類的生產(chǎn)效率。

脂肪是肌肉的重要組成成分。在過去45 年中，由于動物遺傳、營養(yǎng)和管理的進步及加工技術的變化，零售肉類的脂肪含量大幅下降。肉類和肉制品中總SFA 和反式脂肪酸 （TFA） 含量降低，并富集n-3 PUFA 濃度。飲食與人類非傳染性疾病發(fā)病率存在關聯(lián)，使人們對開發(fā)新型低致病的食物生產(chǎn)系統(tǒng)產(chǎn)生濃厚興趣。與羊肉或牛肉相比，某些家禽的脂肪含量較低，多不飽和脂肪酸含量較高，TFA 濃度較低。改變羊肉、牛肉等的脂肪酸譜在很大程度上取決于攝入植物類型、微生物脂肪分解及瘤胃中膳食脂質(zhì)的微生物氫化，這是單胃和反芻動物肉類脂質(zhì)組成差異的主要原因之一。晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子2 （period circadian protein2，PER2）是一種主要的生物鐘基因，與各種非反芻動物的細胞增殖和脂質(zhì)代謝密切相關。Gao 等[19]從斷奶山羊中分離瘤胃上皮細胞（REC），用免疫熒光法測定細胞中時鐘蛋白 （clock protein）CLOCK 和PER2 蛋白的豐度，使用短干擾RNA 敲除模型研究PER2 的作用，并使用丁酸鈉評估上調(diào)PER2 的效果，以探究山羊REC 中生物鐘相關的mRNA 豐度，并確定PER2 對細胞增殖和SCFA 轉(zhuǎn)運體（脂代謝、細胞增殖和凋亡相關基因）mRNA 豐度的影響。結果表明，CLOCK 和PER2 可能在控制細胞增殖、SCFA 和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用，從而得以改變山羊的肉質(zhì)。相關肉類的研究在農(nóng)場動物身上還有很多，如通過CRISPR/Cas9 技術敲除MSTN 調(diào)控中華黃牛生長性狀； 利用CRISPR-Cas9 系統(tǒng)編輯豬IGF-2 調(diào)控元件來改善豬的生長速度，在不影響其肉質(zhì)的情況下以此改善豬的產(chǎn)肉量等。由此可見，基因編輯技術為提高畜牧業(yè)生產(chǎn)力和應對全球畜牧業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)性提供了理論基礎和可行方案。

4 山羊作為試驗模型基因敲除研究進展

相比于牛、馬等大型哺乳動物，山羊生長周期短、飼養(yǎng)成本更低、更易管理。因山羊?qū)Νh(huán)境的適應性普遍較高、易飼養(yǎng)，所以經(jīng)常被用來作為研究某一特定基因選擇性表達的模型動物，參與科學技術的更新、互作及相關傳染病的研究。

壓力性尿失禁 （stress urinary incontinence，SUI）是女性人群中常見的健康問題，影響女性的生活質(zhì)量，但目前還沒有適合大部分患者的治療方法。由于倫理問題限制，患SUI 的靈長類動物模型無法構建，這使得農(nóng)場動物模型成為最佳選擇。Amend 等[20]為研究SUI 的發(fā)病機制，通過CRISPR/Cas9 技術建立山羊病理模型，在規(guī)定的條件下誘導尿失禁，模擬已知的SUI 危險因素（如分娩或手術損傷等）后，發(fā)現(xiàn)與兩足動物相比，四足動物的腹部腫塊不會直接壓迫盆底，膀胱的壓力較小。此外，大型動物還可以使用標準儀器進行尿道手術。這為臨床研究中改進手術器械或開發(fā)新型器械提供了參考依據(jù)。

同時，CRISPR/Cas9 和不同的技術結合極大地促進了家畜基因編輯的發(fā)展。Fan 等[21]詳細地描述了使用CRISPR/Cas9 和體細胞核移植 （somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術相結合的策略，即從構建山羊CRISPR/Cas9 靶向載體開始，到將克隆胚胎轉(zhuǎn)移到雌性受體的試驗過程。利用 CRISPR/cas9系統(tǒng)可構建穩(wěn)定敲除不同基因的細胞系，張志飛等[22]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)以普通山羊細胞為模型敲除色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)1，成功建立了TPH1 基因穩(wěn)定敲除的山羊乳腺上皮細胞系。

山羊痘病毒（goat pox virus，GTPV）是山羊痘的病原體，在山羊中較為流行。GTPV 會引起發(fā)熱、皮膚結節(jié)、呼吸道病變和淋巴結腫大等癥狀。在我國，主要的山羊痘疫苗毒株為AV41（GTPV-AV41），該疫苗株源于1959 年青海分離的GTPV-AV40 菌株。Zhu 等[23]考慮到GTPV-AV41 接種的安全性和毒副作用，采用同源重組和Cre（環(huán)化重組酶）/Loxp 系統(tǒng)，在不影響復制的前提下，刪除非必需基因片段，構建了與GTPVAV41 毒力和免疫調(diào)節(jié)功能相似的減毒山羊痘病毒（GTPV-TK-ORF）。體內(nèi)和體外試驗結果均表明，GTPV-TK-ORF 比野生型GTPV-AV41 更安全，具有良好的免疫原性，可保護山羊免受GTPV-AV40 的毒力感染，減少其發(fā)病率和死亡率。

5 思考與展望

將高新生物技術應用于畜牧產(chǎn)業(yè)中，是中國畜牧業(yè)進步發(fā)展彎道超車的重要手段。隨著越來越多技術手段的開發(fā)，畜牧業(yè)產(chǎn)值在地方農(nóng)業(yè)產(chǎn)值比重穩(wěn)步增加，成為中國國民畜牧經(jīng)濟的重要發(fā)展戰(zhàn)略之一?；蚓庉嫾夹g在畜牧業(yè)發(fā)展過程中的作用也越來越重要。隨著基因編輯技術的快速發(fā)展，鋅指核酸酶（ZFNs）、TALENs 和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)已被應用于精確修飾生物體內(nèi)的內(nèi)源基因。目前，有研究者已經(jīng)能從分子水平上開展試驗設計，使對山羊的研究在基因敲除的助力下更是不斷突破。山羊奶成分的改善、肉質(zhì)的改良及山羊MSTN 基因的敲除改變肌肉生長速度等，都是目前山羊產(chǎn)業(yè)的研究熱點?；蚓庉嫾夹g適用性強，目前已經(jīng)廣泛應用于其他動物的研究，如牛的基因組工程研究包括抗病性、根除過敏原（如β-乳球蛋白敲除）、產(chǎn)物生成（如動物種系）、引入有價值的特征及其健康調(diào)控（如心血管等疾病的糾正）等；豬的營養(yǎng)學研究（肉質(zhì)改善、性別決定）、轉(zhuǎn)錄組分析及品種改良等也在有序開展。此外，基因編輯技術在小鼠、斑馬魚、綿羊、兔子及猴子等動物中均有涉及。

基因編輯技術作為近些年大熱的工程技術，對大、小型動物的個體層面、群體層面的研究都在不斷深入，但目前也有其自身缺陷和未能“探測”的領域，所以基因編輯技術這項工程的開展仍道阻且長。相信在研究人員的共同努力下，這項工程將完美竣工。未來包括山羊在內(nèi)的大、小型動物的未知基因位點、基因性能及其他經(jīng)濟、社會價值等都將更加明了，基因編輯技術在畜牧業(yè)、制造業(yè)及醫(yī)療行業(yè)等領域的地位將更加重要。