云南部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒M和ORF3基因的遺傳進化分析

關鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）；M 基因；ORF3基因；遺傳進化分析

中圖分類號： S852.651 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 06?0059?07

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrheavirus，PEDV） 引起的，以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和生長緩慢為主要特征的急性、高度接觸性傳染病[1]。PEDV 是有囊膜的單條正鏈RNA 病毒，基因組全長約28 kb，包括1 個5'非編碼區(qū)（untranslatedregion，UTR）、1個3'UTR 以及7個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M、N）[2]。其中，ORF3 蛋白基因長度為675 bp，是PEDV粒子中的非結構蛋白，分子質量為25.3ku；它是PEDV 基因組中唯一的輔助蛋白，也是病毒的通道蛋白，與病毒的毒力有關，能夠影響病毒復制[3]。ORF3 蛋白還可通過延長細胞周期的S 期、抑制早期細胞凋亡和促進自噬來調節(jié)細胞周期進程，從而為病毒繁殖提供適當?shù)沫h(huán)境[4-5]。近年來，隨著毒株的遺傳變異，ORF3 基因出現(xiàn)突變、天然截短和翻譯中斷等現(xiàn)象，且不同毒株之間存在差異[6-7]。膜糖蛋白（membrane glycoproteins，M） 基因長度為681 bp，可翻譯226 個氨基酸，分子質量為27～32 ku，其保守性和結構穩(wěn)定性很高，常被用于設計引物以檢測PEDV[8]。PEDVM 蛋白是一種重要的結構蛋白，與病毒復制、感染和組裝有關[9-10]。

為進一步了解PEDV 在云南的流行及演變情況，本研究于2022—2023年，從云南多個疑似暴發(fā)PED 的豬場采集病料樣品125 份，采用RTPCR法檢測樣品中是否存在PEDV；對PEDV 陽性樣品進行測序分析，構建M 和ORF3基因的遺傳進化樹，旨在了解病毒的流行和遺傳進化情況，為該病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料收集與貯存

2022年8月—2023年7月，從云南省祿勸彝族苗族自治縣（以下簡稱“祿勸縣”）、永平縣、鳳慶縣、大理市和曲靖市9 個暴發(fā)仔豬腹瀉病的豬場采集發(fā)病仔豬小腸組織樣品、糞便或肛拭子共125份。取適量樣品于5mL 無菌離心管中，將樣品與無菌PBS溶液按1∶5（V∶V） 充分混勻后置于?80 ℃ 反復凍融3次，12000r/min 離心10min，取上清分裝于新的離心管中，加入1% 雙抗，一部分用于提取RNA；另一部分凍存用于后續(xù)試驗。

1.2 主要試劑

TransZol UP RNA 提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；Super HiFi PCR Mix （KT212）、DL2000 DNA Marker、DL3000 DNA Marker、核酸染料、cDNA 第1 鏈合成預混試劑盒等購自北京天根生化有限公司。

1.3 引物合成及PCR 擴增

根據(jù)表1 合成引物，將樣品提取RNA 后反轉錄為cDNA，用針對豬傳染性胃腸炎病毒（porcineinfectious gastroenteritis virus，TGEV）、豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）、豬德爾塔冠狀病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV） 和PEDVM 基因的引物進行PCR 擴增，取PCR 產物7 μL，經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，符合預期大小的樣品送至上海生工有限公司進行測序。確定為PEDV M 陽性的樣品，用針對PEDV ORF3 基因的引物進行擴增并測序。

1.4 序列比對及分析

將測序結果與GenBank 中的相關序列（表2）進行比對，并將比對正確的毒株按照采集地、樣品類型、日期進行命名。采用DNAstar 軟件對測序結果進行拼接；采用生物學軟件Megalign 分析序列同源性，并對核苷酸和氨基酸序列突變點進行統(tǒng)計分析；采用MEGA 11 構建遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 PEDV檢測及M基因擴增

由圖1和表3 可知：在檢測的125 份樣品中，檢出49 份PEDV 陽性樣品（663 bp），陽性率為39.2%；PoRV 陽性樣品14份（333 bp），陽性率為11.2%；PoRV 與PEDV 混合感染率為10.4%（13/125），未檢測出TGEV 和PDCoV。對符合目的基因大小的PCR 產物進行測序，結果與Genebank上的參考序列進行比對分析，比對正確的毒株分別為：YNLPF2-1、YNLPF2-8 和YNLPF2-15（羅平縣肛拭子）；YNQJF4-1、YNQJF4-3、YNQJF4-6、YNQJF4-7 和YNQJF4-9 （曲靖市糞樣）；YNDLF6-1 （大理市糞樣）； YNDLC7-6和YNDLC7-8 （大理市腸樣）。

2.2 PEDV ORF3基因片段的擴增

PEDV M陽性樣品的ORF3基因引物擴增和電泳檢測結果顯示：得到長833 bp的片段，符合預期目的（圖2）。

2.3 PEDV M基因和ORF3基因的生物信息學分析

2.3.1 PEDV M基因的遺傳進化分析

PEDV M 基因序列的進化樹（圖3） 顯示：10株云南流行毒株同屬GⅡ型。其中，YNQJF4-6和YNQJF4-7 與中國的AJ1102、GD-A、LC 株親緣關系較近；其余8 株與GD S07 親緣關系較近，與GⅠ型CV777、DR13、SM98 等疫苗株的親緣關系較遠。同源性分析結果顯示：云南流行株M基因的核苷酸同源性為96.9%～100.0%，與國內外參考流行株的核苷酸同源性為96.2%～99.8%，與經典疫苗株CV777 和DR13 的同源性分別為97.1%～98.1% 和96.9%～97.9%，與美國代表毒株OH851 的同源性為98.1%～99.5%，與GⅡ型的越南株VNUFP013-1 和中國株AJ1102 的同源性分別為97.6%～99.7% 和97.4%～99.5%。10 株M 基因氨基酸序列與參考毒株CV777、DR13、83P-5、SM98、VNJFP1013-1 的比對結果顯示：云南流行株有6 個氨基酸突變位點，分別是第24 位（C→R）、第53 位（F→S）、第56 位（T→I）、第76 位（I→T）、第162 位（T→M） 和第183 位（Q→P），未出現(xiàn)氨基酸插入及缺失現(xiàn)象。

2.3.2 PEDV ORF3基因遺傳進化分析

PEDV ORF3基因序列進化樹（圖4） 顯示：10株云南流行毒株同屬GⅡ型。其中，YNQJF 4-3和YNQJF 4-7與中國的AJ1102、GD-A、LC 株以及越南株VN-JFP1013親緣關系較近；其余8 株與GD S07親緣關系較近，與經典疫苗株CV777、DR13等親緣關系較遠。同源性分析結果顯示：云南流行株ORF3 基因的核苷酸同源性為95.6%～100.0%，與國內外參考流行株的核苷酸同源性為89.3%～99.6%，與經典疫苗株CV777 和JS2008 的同源性分別為96.3%～96.7% 和89.3%～90.2%，與GⅡ型的越南株VNUFP013-1 和中國株AJ1102 的同源性分別為95.9%～98.8% 和95.9%～99.1%。

2.3.3 PEDV ORF3蛋白氨基酸序列分析

將PEDV ORF3基因片段序列翻譯為蛋白氨基酸序列，與經典疫苗株CV777、DR13 和JS2008的ORF3 蛋白氨基酸序列進行比對，結果顯示：與CV777 相比，10 株毒株在第21 位點（A→V）、第54 位點（V→I）、第79 位點（V→I）、第101 位點（A→T） 和第166 位點（N→S） 發(fā)生氨基酸突變；YNQJF4-3 和YNQJF4-7在第168 位點（D→N）、第25 位點（D→L）、第70 位點（I→V） 和第107 位點（C→F） 發(fā)生氨基酸突變；YNDLC7-6、YNDLC7-8、YNDLF6-1、YNLPF2-1、YNLPF2-8、YNLPF2-15和YNQJF4-9在第182 位點（H→Q） 發(fā)生氨基酸突變；無氨基酸插入或缺失現(xiàn)象。與DR13和JS2008 的ORF3蛋白氨基酸序列進行比對，結果顯示：10 株毒株均未出現(xiàn)氨基酸連續(xù)大片段缺失的現(xiàn)象。

3討論

豬流行性腹瀉于1971年在英國首次被報道，之后迅速在歐洲甚至亞洲蔓延，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失[14-15]。由于PEDV 毒株易發(fā)生變異，導致現(xiàn)有疫苗免疫效果不佳，因此，有必要通過流行病學調查監(jiān)測新出現(xiàn)的流行株，從而及時研發(fā)針對性的疫苗用于有效防控[16-17]。本研究采集云南省部分地區(qū)9 個豬場共125 份小腸、糞便和肛拭子樣品進行檢測，結果顯示：有49份PEDV 陽性樣品，14份PoRV 陽性樣品，PEDV與PoRV 混合感染率為10.4%，未檢測出TGEV和PDCoV?？梢姡琍EDV 仍是云南省新生仔豬腸道疾病的主要病原，迫切需要研制新型有效的疫苗來防治PEDV 的變異情況[14]。

對PEDV M 基因進行遺傳進化分析及同源性分析，結果表明：10 株云南流行毒株均屬于GⅡ型，其中，YNQJF4-6 和YNQJF4-7與中國的AJ-1102、GD-A、LC 株親緣關系較近，其余8 株與GD S07 親緣關系較近，與GⅠ型CV777、DR13、SM98 等疫苗株的親緣關系較遠，現(xiàn)有疫苗可能無法完全覆蓋云南省流行的PEDV 毒株，從而影響疫苗的免疫效果。10 株云南流行株M 序列的核苷酸同源性為96.9%～100.0%，表明這些毒株在遺傳上具有較高的相似性；與國內外參考流行株的核苷酸同源性為96.2%～99.8%，與經典疫苗株CV777 和DR13 的同源性分別為97.1%～98.1%和96.9%～97.9%，與GⅡ型的越南株VNUFP013-1和中國株AJ1102的同源性分別為97.6%～99.7% 和97.4%～99.5%，提示PEDV 可能存在跨國流傳的現(xiàn)象。10條云南流行株與參考毒株CV777、DR13、83P-5、SM98、VNJFP1013-1的M 基因氨基酸序列有6個氨基酸突變位點，但未出現(xiàn)氨基酸插入及缺失現(xiàn)象，整體上M 基因序列較保守，與已有研究結果[18-19]一致。盡管M 基因序列整體上比較保守，但這些突變位點可能影響病毒的生物學特性或免疫逃避能力，仍然需要引起關注，可能在未來成為疫苗研發(fā)或抗病毒藥物設計的潛在靶點。

10株云南流行株ORF3序列的核苷酸同源性為95.6%～100.0%，與國內外參考毒株的核苷酸同源性為89.3%～99.6%；氨基酸序列主要有5 個氨基酸突變位點，無氨基酸插入或缺失現(xiàn)象。研究表明：ORF3基因是否發(fā)生17 個氨基酸缺失是區(qū)別野生型和弱毒株的關鍵分子特征，且與病毒的毒力和致病性密切相關[20]。本研究中，PEDV毒株的ORF3序列氨基酸未觀察到疫苗株大片段缺失的特征，提示其為強毒株。

本研究揭示了云南省部分地區(qū)流行的PEDV遺傳特征和流行狀況，為了解PEDV 的流行病學和致病機制提供了新視角。研究樣本采自云南省部分地區(qū)的9 個豬場，樣本量相對有限且地域覆蓋范圍不夠廣泛，可能無法完全代表云南地區(qū)乃至全國的PEDV 流行狀況，未來的研究仍需進一步擴大樣本量。此外，本研究主要關注了M 基因和ORF3 基因的遺傳進化特征，而PEDV 的其他基因片段也可能對病毒的生物學特性和致病機制有重要影響。因此，未來的研究需要綜合考慮PEDV 的全基因組特征，以更全面地理解其遺傳多樣性和致病機制。

4 結論

云南流行的PEDV 是以GⅡ型為主的強毒株，與中國其他地方流行的毒株親緣關系密切，急需研制針對變異株的疫苗，降低其帶來的經濟損失。

責任編輯：何謦成