lncRNA UCA1靶向miR-145調(diào)控癲癇細(xì)胞炎癥反應(yīng)

樊麗霞

福州市第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州 350004

癲癇是一種腦部慢性疾病，全球約超過5000 萬人受其困擾，嚴(yán)重影響了患者及其家庭的生活質(zhì)量?？拱d癇發(fā)作藥物主要是緩解患者的癥狀，但約30%的癲癇患者對(duì)抗癲癇藥物有耐藥性[1-2]。癲癇的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程，其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，對(duì)癲癇發(fā)生機(jī)制的深入探討對(duì)開發(fā)新的癲癇治療策略具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200nt、缺乏編碼蛋白能力的非編碼RNA。膀胱癌相關(guān)1（UCA1）的長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）是與炎癥相關(guān)的lncRNA 之一，以往的研究表明UCA1 對(duì)癲癇大鼠存在動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)效應(yīng)[3]。有發(fā)現(xiàn)在體外抑制miR-145 可防止突觸收縮并降低體內(nèi)癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度[4]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)UCA1 和miR-145 可能存在靶向關(guān)系，但UCA1 和miR-145 在癲癇細(xì)胞炎癥反應(yīng)中是否存在靶向調(diào)控關(guān)系尚未見報(bào)道。因此，本研究將探究沉默和過表達(dá)UCA1 對(duì)癲癇細(xì)胞炎癥調(diào)控及其與miR-145 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 CTX-TNA 星形膠質(zhì)細(xì)胞購自LMAI Bio 公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基購自Hyclone、OPTI-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自GIBCO 公司；Lipo2000 購自Invitrogen 公司；miR-145 模擬物、miR-145 抑制劑、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pcDNA3.1 質(zhì)粒、psiCHECK質(zhì)粒、Trizol 試劑購自賽默飛科技有限公司；Dual-Luciferase 報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒Promega 公司、熒光定量試劑盒購自百歐泰；shUCA1、CCK8試劑盒購自abcam 公司；UCA1 全序列合成及引物合成由上海生工完成；青霉素鏈霉素（雙抗）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CTX-TNA2 星形膠質(zhì)細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液（含D-葡萄糖4.5 g/L、碳酸氫鈉3.4 g/L、L-谷氨酰胺584 mg/L、青霉素75 mg/L、鏈霉素50 mg/L），于含有5% CO2的CO2孵育箱中，在37℃、95%濕度條件下培養(yǎng)，并用10 ng IL-1β 持續(xù)處理24 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞為貼壁細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h 后按照操作手冊(cè)采用lipo2000 將shUCA1、pcDNA3.1-UCA1 重組質(zhì)粒、pcDNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CTX-TNA 星形膠質(zhì)細(xì)胞，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要采用lipo2000 分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染shUCA1、miR-145 inhibitor，轉(zhuǎn)染48h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活性 將CTX-TNA 細(xì)胞（4×103個(gè)細(xì)胞/孔）鋪在96 孔板中生長(zhǎng)24 h。除去培養(yǎng)基，并將CCK-8 溶液加入培養(yǎng)基中，使用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)量光密度（OD）值，OD 值越大，細(xì)胞活力越強(qiáng)。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 通過starBase 數(shù)據(jù)庫的miRNA-lncRNA interactions 模塊預(yù)測(cè)分析UCA1與miR-145 的結(jié)合位點(diǎn)?；蚝铣蒛CA1 中含有miR-145 結(jié)合位點(diǎn)的片段，并將該片段插入pmirGLO載體。將CTX-TNA 細(xì)胞用上述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，并與模擬NC 或miR-145 模擬物共轉(zhuǎn)染。在37℃下溫育48 h 后，收獲細(xì)胞，根據(jù)Dual-Luciferase 報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.5 RT-qPCR RT-qPCR 反應(yīng)在7900HT 快速實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)上操作，實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)測(cè)量各組miR-145的表達(dá)水平，以GAPDH 內(nèi)參，引物序列見表1。各組mRNA 的相對(duì)表達(dá)量通過2-ΔΔCt 進(jìn)行分析。

表1 RT-qPCR引物列表

1.2.6 ELISA 實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 的水平。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用One-Way ANONA 分析，數(shù)據(jù)以表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCA1 對(duì)CTX-TNA2 星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的影響 與對(duì)照組、過表達(dá)空載體組、干擾空載體組、sh-UCA1 干擾組相比，pcDNA3.1-UCA1 過表達(dá)組IL-2、IL-6、TNF-α 均顯著降低（均P＜0.01）；與對(duì)照組、過表達(dá)空載體組、pcDNA3.1-UCA1 過表達(dá)組、干擾空載體組相比，sh-UCA1 干擾組IL-2、IL-6、TNF-α 均顯著增高（均P＜0.01）。見表2。

表2 各組炎癥因子的表達(dá)

2.2 UCA1 對(duì)CTX-TNA2 星形膠質(zhì)細(xì)胞miR-145 表達(dá)的影響 UCA1 過表達(dá)可顯著降低CTX-TNA2 星形膠質(zhì)細(xì)胞miR-145 表達(dá)水平（P＜0.01）。下調(diào)UCA1 表達(dá)可顯著增加CTX-TNA2 星形膠質(zhì)細(xì)胞miR-145 表達(dá)（P＜0.01），表明UCA1 可影響CTXTNA2 星形膠質(zhì)細(xì)胞miR-145 表達(dá)。見圖1。

圖1 UCA1對(duì)CTX-TNA星形膠質(zhì)細(xì)胞miR-145表達(dá)的影響

2.3 UCA1 靶向結(jié)合miR-145 UCA1 基因序列上存在miR-145 的結(jié)合位點(diǎn)，為研究miR-145 是否是lncRNA UCA1 的功能性直接靶標(biāo)，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告分析。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-145和野生型UCA1 質(zhì)粒（UCA1WT）可顯著減弱熒光素酶活性（P＜0.01），UCA1 結(jié)合位點(diǎn)突變后，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-145 和突變型UCA1 質(zhì)粒（UCA1 MUT）熒光素酶活性升高。表明UCA1 和miR-145 間存在靶向調(diào)控關(guān)系，見圖2。

圖2 UCA1靶向結(jié)合miR-145

2.4 沉默UCA1 對(duì)CTX-TNA2 星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的影響 與對(duì)照組相比，shUCA1 組CTX-TNA2 星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 均顯著升高（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，sh-UCA1+miR-145 抑制劑組TNF-α 無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)改變（P＞0.05），sh-UCA1+miR-145 抑制劑組IL-6、IL-2 顯著降低（P＜ 0.01）；與sh-UCA1 組相比，sh-UCA1+miR-145 抑制劑組IL-2、IL-6、TNF-α 明顯降低（P＜ 0.01）。見表3。

表3 各組炎癥因子的表達(dá)

3 討論

癲癇一直位列世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）重點(diǎn)防治的五大神經(jīng)精神疾病之一。據(jù)WHO2018 年發(fā)布的實(shí)況報(bào)道，估計(jì)我國(guó)有高達(dá)1000 萬以上的人群受累。盡管有大量抗癲癇發(fā)作藥物，但約30%的癲癇患者對(duì)抗癲癇藥物有耐藥性[1-2]。同時(shí)，許多抗癲癇藥物都有副作用，如頭暈、嗜睡和思維遲鈍。此外，現(xiàn)有藥物可以預(yù)防癲癇發(fā)作，但不能預(yù)防癲癇發(fā)生[5]。因此，尋找新的有效療法也是當(dāng)前癲癇領(lǐng)域研究關(guān)注的熱點(diǎn)。

盡管近年來在癲癇發(fā)病機(jī)制方面取得了一些進(jìn)展，但由于癲癇的復(fù)雜性，其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，也是癲癇極難治愈的主要原因[6]。因此，對(duì)癲癇發(fā)生機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，對(duì)開發(fā)新的癲癇治療方法具有重要意義。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，炎癥在癲癇發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[7]。炎癥反應(yīng)失調(diào)可能導(dǎo)致神經(jīng)連接異常和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮過度，促進(jìn)癲癇的發(fā)生和發(fā)展[8]。目前研究認(rèn)為IL-1、IL-6 及腫瘤壞死因子α（TNF-α）等細(xì)胞因子與癲癇有關(guān)。然而，癲癇的炎癥調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。

許多研究報(bào)告提示星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙促進(jìn)癲癇的發(fā)展和進(jìn)展，星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[9]?；谖墨I(xiàn)報(bào)道及本研究團(tuán)隊(duì)既往的研究，用IL-1β 處理的CTX-TNA2 細(xì)胞可以作為研究癲癇的體外模型。本研究證明了lncRNAUCA1 通過調(diào)節(jié)miR-145 調(diào)控癲癇細(xì)胞炎癥反應(yīng)，這為制定癲癇策略治療提供了新的靶點(diǎn)。

據(jù)報(bào)道lncRNA 的異常表達(dá)與癲癇有關(guān)，lncRNAUCA1 可抑制癲癇[10]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNAUCA1可抑制癲癇細(xì)胞模型的炎癥反應(yīng)。由于炎癥可能促進(jìn)癲癇發(fā)生[11]，lncRNAUCA1 可以通過抑制炎癥抑制癲癇，但其抑制機(jī)制尚不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。

眾所周知，miRNA 作為lncRNA 的介導(dǎo)物，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，已成為癲癇病因和發(fā)展的關(guān)鍵因素[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在體外抑制miR-145 可防止突觸收縮并降低體內(nèi)癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度[13]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-145 能夠調(diào)節(jié)多種疾病的信號(hào)通路[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在癲癇細(xì)胞模型中，過表達(dá)UCA1 可明顯抑制miR-145 表達(dá)（P＜0.001），沉默UCA1 可顯著促進(jìn)miR-145 表達(dá)（P＜0.001），過表達(dá)UCA1 可抑制癲癇細(xì)胞炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 的表達(dá)；證明過表達(dá)UCA1 可靶向miR-145 調(diào)節(jié)癲癇細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，miR-145 為lncRNAUCA1 的直接靶點(diǎn)，進(jìn)而影響炎癥。

總之，對(duì)lncRNA 及其下游分子機(jī)制的研究有助于闡明癲癇的發(fā)病機(jī)制。本研究證明了lncRNAUCA1通過調(diào)控miR-145 來抑制癲癇的炎癥反應(yīng)。本研究中的所有數(shù)據(jù)均來自體外試驗(yàn)，但未來研究計(jì)劃將在體內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以驗(yàn)證癲癇的調(diào)節(jié)機(jī)制，為癲癇患者的治療策略提供新的靶點(diǎn)。