異種實(shí)體器官移植亞臨床研究中的突破與問(wèn)題

劉 欣，杜嘉祥，淮國(guó)麗，邢向陽(yáng)，謝雨宣，潘登科

(1電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610057；2四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，臨床免疫轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072；3成都中科奧格生物科技有限公司，四川 成都 610094)

器官移植是治療終末期器官功能衰竭的有效方法，挽救了大量器官衰竭患者的生命[1]。器官資源的短缺是器官移植的重要障礙，已成為全球性難題。異種器官來(lái)源尤其是豬來(lái)源器官被認(rèn)為是潛在解決器官短缺問(wèn)題的重要方式[2]。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的快速發(fā)展，多基因編輯豬的培育更加快速高效，通過(guò)轉(zhuǎn)入多種人源保護(hù)性蛋白，移植物存活時(shí)間得到延長(zhǎng)[3]。目前，豬-非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(non-human primate，NHP)模型被廣泛用于異種移植研究，且受體最長(zhǎng)存活時(shí)間不斷突破[4]，其中異種心臟移植最長(zhǎng)存活945 d，異種腎臟移植最長(zhǎng)存活758 d(表1)。

表1 NHP模型中受體最長(zhǎng)存活時(shí)間

盡管豬-NHP的實(shí)驗(yàn)研究為異種移植進(jìn)入臨床階段提供了重要的數(shù)據(jù)參考及經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)，然而NHP和人類之間仍然存在一定差異[10]，主要包括預(yù)存抗體種類、器官大小兩方面。猿猴類是屬于較高等的靈長(zhǎng)類，根據(jù)分布和形態(tài)上的不同，猿猴的種類可以分為兩大類：新世界猴(New World monkeys，NWM)和舊世界猴(Old World monkeys，OWM)[11]。目前異種移植模型應(yīng)用最多的受體為狒狒、獼猴、恒河猴、食蟹猴，均屬于OWM，N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)是引起異種移植排斥反應(yīng)的重要非半乳糖抗原，YAMAMOTO等[12]的研究表明當(dāng)Neu5Gc在供體豬體內(nèi)不再表達(dá)時(shí)(CMAH基因失活)，與人類或NWM相比，OWM血清對(duì)供體豬外周血單個(gè)核細(xì)胞具有更顯著的免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)結(jié)合和細(xì)胞毒性。卷尾猴、金絲猴等屬于NWM，但體型較小，無(wú)法滿足豬器官移植手術(shù)。MOAZAMI等[13]的報(bào)告中指出供體豬和受體的心臟尺寸不匹配可能不足以維持足夠的心輸出量，從而導(dǎo)致心臟缺血性損傷。因此，NHP作為異種移植研究模型存在缺陷。出于更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯繎B(tài)度和對(duì)生物安全方面的考量，MONTGOMERY在2022年美國(guó)器官移植大會(huì)上提出豬-腦死亡遺體異種移植亞臨床研究模型，作為異種移植走向臨床前的一種過(guò)渡模型，并在國(guó)外開(kāi)始了早期的探索[14-17]。本文將豬器官向腦死亡遺體的移植定義為異種移植亞臨床研究。

2 異種移植在亞臨床研究中的突破

近期，報(bào)道了9例基因編輯豬器官移植到人體的研究，包括7例(腎臟5例、心臟2例)異種移植亞臨床研究和2例根據(jù)美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)同情使用條例開(kāi)展的豬心移植研究，F(xiàn)DA定義，同情使用是指患有嚴(yán)重或立即危及生命的疾病或癥狀的患者，在沒(méi)有可比較或者令人滿意的替代療法時(shí)，可以允許獲得試驗(yàn)性醫(yī)療產(chǎn)品治療。這些研究?jī)?nèi)容為克服免疫排斥、優(yōu)化免疫抑制劑方案、監(jiān)測(cè)跨物種病原微生物傳播等提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

2.1 腎臟移植

目前，已報(bào)道的異種腎臟亞臨床研究共5例(表2)，其中3例由美國(guó)紐約大學(xué)朗格尼醫(yī)學(xué)中心(New York University Langone Medical Center，NYU Lounge)研究團(tuán)隊(duì)完成，另外2例由阿拉巴馬大學(xué)伯明翰醫(yī)學(xué)院(The University of Alabama at Birmingham，UAB)研究團(tuán)隊(duì)完成。

表2 豬-人腎臟移植研究現(xiàn)狀

NYU Lounge研究團(tuán)隊(duì)的3例手術(shù)均選擇了GTKO豬，移植后豬腎立即就產(chǎn)生了尿液，能夠有效清除代謝廢物肌酐，術(shù)后觀察期內(nèi)并未出現(xiàn)免疫排斥跡象[15]。此外，NYU Lounge研究團(tuán)隊(duì)還嘗試了腎臟聯(lián)合胸腺的移植方法：在移植前2個(gè)月時(shí)，將豬自體胸腺植入到腎包膜下，期望建立免疫耐受，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示豬腎聯(lián)合胸腺的移植方式能夠抑制適應(yīng)性免疫。法國(guó)巴黎城市大學(xué)的ALEXANDRE團(tuán)隊(duì)利用空間轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)圍繞NYU Lounge研究團(tuán)隊(duì)完成的2例存活54 h豬腎移植的手術(shù)從免疫反應(yīng)方面進(jìn)行了完整的分析[17]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2例異種移植物中與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化、自然殺傷細(xì)胞聚集、內(nèi)皮活化、補(bǔ)體活化和T細(xì)胞發(fā)育的相關(guān)基因表達(dá)均顯示增加。

UAB研究團(tuán)隊(duì)使用10-基因編輯豬10GE，包括4種基因敲除(GTKO、CMAH、B4GALNT2、GHR)和6種人源保護(hù)性基因的插入(CD46、CD55、CD47、THBD、EPCR、HO-1)。該團(tuán)隊(duì)在進(jìn)行第一例移植時(shí)發(fā)現(xiàn)左腎產(chǎn)生的尿液量少，且腎臟不能清除肌酐[16]。2023年該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了第二例異種腎移植手術(shù)，豬腎臟在灌注后短時(shí)間就產(chǎn)生了尿液，開(kāi)始代謝肌酐。該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為受體的腦死亡狀態(tài)或豬腎獲取過(guò)程的缺血損傷可能影響到肌酐清除[18]。以上提示手術(shù)過(guò)程中要注重腎臟的保存[19]。

2.2 心臟移植

目前，已報(bào)道的異種心臟移植共完成4例(表3)。由馬里蘭醫(yī)學(xué)中心(University of Maryland School of Medicine，UMSOM)研究團(tuán)隊(duì)和NYU Lounge團(tuán)隊(duì)分別完成2例。

表3 豬-人心臟移植研究現(xiàn)狀

UMSOM研究團(tuán)隊(duì)完成的2例異種心臟移植，是通過(guò)同情使用條例開(kāi)展的豬心向心衰患者的移植，術(shù)后豬心臟在人體中能夠自發(fā)搏動(dòng)，未出現(xiàn)超急性免疫排斥，第一例患者存活60 d[20]，第二例患者存活40 d。其中對(duì)第一例的檢測(cè)結(jié)果已報(bào)道，發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致排斥的三個(gè)方面。首先，觀察到廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管損傷，出現(xiàn)間質(zhì)水腫和紅細(xì)胞外滲及補(bǔ)體沉積等問(wèn)題，這提示發(fā)生抗體介導(dǎo)的排斥。其次，本例中為避免微生物感染所使用的靜脈注射免疫球蛋白，被證明能夠結(jié)合豬細(xì)胞表面抗原，加劇了排斥反應(yīng)。最后，血清中循環(huán)游離DNA的結(jié)果顯示，出現(xiàn)了豬巨細(xì)胞病毒(porcine cytomegalovirus，PCMV)，終止時(shí)在受體其他器官中同樣被檢測(cè)到，潛在的PCMV在異種移植物中的重新激活和復(fù)制可能引發(fā)破壞性炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)指出了需注重內(nèi)皮損傷機(jī)制研究，開(kāi)發(fā)新型免疫抑制藥物，需要更加嚴(yán)格的篩查供體豬。第二例移植較第一例采用了更靈敏的PCMV檢測(cè)方法，并采用了新型免疫抑制劑CD154，移植后患者狀態(tài)良好，但后續(xù)移植的心臟開(kāi)始出現(xiàn)排斥現(xiàn)象并導(dǎo)致患者死亡，檢測(cè)結(jié)果等待最新報(bào)道。

NYU Lounge完成了2例豬-腦死亡遺體的心臟移植，并維持觀察66 h[13]。移植物在觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)排斥跡象，能較好地維持心臟功能。但其中1例由于豬心臟尺寸偏小，最終因供血不足導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)了不可逆的缺血性損傷，這提示器官大小也是移植成功的重要保證，敲除GHR基因是否能夠穩(wěn)定、一致地控制豬器官大小尚不明確，選擇器官大小接近人類的小型豬可能是更好的選擇，且能夠避免此類問(wèn)題的出現(xiàn)。

3 異種實(shí)體器官移植亞臨床研究存在的問(wèn)題

3.1 免疫排斥反應(yīng)

異種移植中的排斥反應(yīng)可以分為3類：超急性排斥、急性血管性排斥(acute vascular rejection，AVR)和急性細(xì)胞性排斥(acute cellular rejection，ACR)[21]。目前亞臨床研究結(jié)果表明，超急性免疫排斥已被克服，然而在這之后的數(shù)日到數(shù)周內(nèi)會(huì)發(fā)生以進(jìn)行性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、移植物內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管內(nèi)血栓形成和纖維蛋白沉積為特征的AVR和ACR[22]。與同種異體移植相比，異種移植的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)豬進(jìn)行基因改造，現(xiàn)有的基因工程豬在以猴為模型的移植中已取得很多長(zhǎng)期存活記錄，但在臨床應(yīng)用上仍處于早期探索，臨床使用的供體豬基因型選擇尚未明確，尋找新的基因改造靶點(diǎn)也是需要去攻克的難題。此外，也需要更多力量投入在基礎(chǔ)研究，如明確異種排斥機(jī)制、開(kāi)發(fā)新型免疫抑制藥物和建立免疫監(jiān)測(cè)體系等。

3.2 免疫抑制方案

有效的免疫抑制方案在器官移植中發(fā)揮重要作用，但現(xiàn)有的免疫抑制藥物僅適用于同種移植，并不足以維持異種器官的長(zhǎng)期存活[23]。豬-NHP的移植案例中已證明阻斷CD40/CD154通路可以顯著提高存活時(shí)間[24]，其中豬心臟、腎臟已取得長(zhǎng)期存活記錄[25]。此外，抗補(bǔ)體藥物對(duì)抑制異種移植早期排斥反應(yīng)十分重要，抗C5抗體Tesidolumab能夠有效減少早期IgM類抗體引起的攻膜復(fù)合物形成[26]。目前，國(guó)內(nèi)適用于異種移植的免疫抑制劑開(kāi)發(fā)較少，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)豬到猴的移植缺乏長(zhǎng)期存活記錄。

3.3 生物安全

隨著異種移植(亞)臨床研究的推進(jìn)，跨物種病原微生物感染風(fēng)險(xiǎn)獲得更多的關(guān)注，供體豬來(lái)源的部分細(xì)菌、病毒被證明可感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物/細(xì)胞，可能導(dǎo)致靈長(zhǎng)類動(dòng)物患已知或未知的疾病[27]。已有多項(xiàng)研究表明PCMV的傳播與受體存活時(shí)間相關(guān)，PCMV的激活可能引起了免疫排斥的加重[28]。因此，無(wú)菌豬的培育是開(kāi)展(亞)臨床研究的前提保障[29]。

無(wú)菌豬的培育依賴于無(wú)指定病原體屏障設(shè)施和剖腹產(chǎn)手術(shù)，從母豬子宮中獲取仔豬后直接培育在潔凈環(huán)境中[30]，目前，國(guó)內(nèi)僅有少數(shù)幾家能夠滿足實(shí)施條件。異種移植領(lǐng)域雖已提出相應(yīng)的病原微生物篩查清單，但這對(duì)于真正開(kāi)展臨床研究仍然有較多不確定性，在(亞)臨床研究中還需要不斷完善[10]。此外，需要優(yōu)化病原微生物檢測(cè)技術(shù)和完善體豬篩選流程以避免出現(xiàn)第一例豬心移植中的PCMV感染[31]。

3.4 法律法規(guī)

異種移植相關(guān)的法律法規(guī)的完善也是異種移植走向臨床不可缺少的一環(huán)。世界衛(wèi)生組織聯(lián)合國(guó)際異種器官移植協(xié)會(huì)分別于2008年和2018年在長(zhǎng)沙制定和更新了國(guó)際異種移植臨床規(guī)范[32]。但我國(guó)相應(yīng)技術(shù)準(zhǔn)備、倫理審查及政策法規(guī)建設(shè)尚未完善[33]，并未頒布異種移植相關(guān)法律法規(guī)。此外，盡管大部分國(guó)家都出臺(tái)了腦死亡判定標(biāo)準(zhǔn)以及腦死亡立法，但我國(guó)大陸地區(qū)還未完成腦死亡立法，缺乏腦死亡立法的支持可能是我國(guó)異種移植在亞臨床研究中發(fā)展受限的原因之一[34]。

4 總結(jié)與展望

豬-腦死亡遺體模型可能是一種更謹(jǐn)慎、安全的臨床過(guò)渡方式，雖然該模型僅能維持有限的觀察時(shí)間，但這將為我們提供更有價(jià)值的臨床數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)。異種器官移植是一項(xiàng)前沿而富有挑戰(zhàn)性的技術(shù)，可以解決目前人類面臨的嚴(yán)重的器官缺乏問(wèn)題，但它也面臨著一些風(fēng)險(xiǎn)和其他問(wèn)題，需要科學(xué)家們和社會(huì)各界共同努力來(lái)推進(jìn)，也需要相應(yīng)的法律法規(guī)進(jìn)行約束，最終實(shí)現(xiàn)真正走向臨床，造福人類。