組氨酸通過抗氧化作用改善移植肝缺血再灌注損傷

張志剛，高銘舒，李佳穎，許小君，魏元元，杜鈺璐，王 楠，黃啟超

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032；2西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)教研室，陜西 西安 710069；3陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；4延安大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，陜西 延安 716000)

缺血再灌注損傷是一種廣泛存在于肝臟手術(shù)(例如肝移植和切除術(shù))中的病理生理過程，主要發(fā)生在出血性休克期間[1-2]。缺血再灌注損傷是導(dǎo)致器官移植失敗和肝功能障礙風(fēng)險增加的關(guān)鍵要素[3-4]。遺憾的是，目前尚缺乏治療肝缺血再灌注損傷的有效藥物，缺血預(yù)處理是有可能改善患者預(yù)后的治療手段[5-6]。因此，迫切需要研發(fā)用于治療缺血再灌注相關(guān)肝損傷的新型治療策略。

肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生可能部分歸因于缺血階段的肝損傷，另一部分歸因于血流恢復(fù)時引發(fā)的一系列損傷[7-9]。越來越多的證據(jù)表明，在再灌注期間，顯著增加的線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘發(fā)DNA損傷、脂質(zhì)過氧化和細胞壞死是引發(fā)組織損傷的主要因素之一[10]。因此，ROS作為氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵引發(fā)因素，一直被視為抗氧化療法的潛在靶點[11-13]。例如，2014年英國劍橋大學(xué)CHOUCHANI等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，琥珀酸在缺血組織中積累，被琥珀酸脫氫酶迅速氧化，通過線粒體復(fù)合物Ⅰ反向電子傳遞驅(qū)動，產(chǎn)生大量的ROS；而丙二酸可以抑制琥珀酸脫氫酶的活性，減少缺血期間琥珀酸的積累，從而改善心臟和中風(fēng)小鼠模型的缺血再灌注損傷[15]；鈰納米顆粒作為代表性的納米抗氧化劑，2019年美國威斯康星大學(xué)蔡偉波教授研究團隊[16]的研究結(jié)果表明，二氧化鈰通過清除ROS有效緩解肝缺血再灌注損傷的臨床癥狀。

組氨酸在抗氧化防御中起重要作用，其主要的保護機制是通過其咪唑環(huán)直接清除急性炎癥反應(yīng)期間細胞產(chǎn)生的ROS；另外，鐵離子、銅離子、鎳離子、鉻離子和鋅離子可以通過芬頓反應(yīng)促進自由基的產(chǎn)生，對生物體產(chǎn)生毒性作用，而組氨酸可以通過螯合上述金屬離子，從而減少ROS產(chǎn)生[17-19]。既往有文獻報道，組氨酸-色氨酸-酮戊二酸溶液可提高移植器官抗氧化能力和對寒冷的耐受性，可用于肝、腎、胰腺、小腸、心臟和肺移植器官保存[20-21]；谷氨酰胺、組氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和丙氨酸聯(lián)合使用具有對抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷作用[22]，上述研究表明多種代謝物聯(lián)合使用對肝組織有保護作用，而單一組氨酸是否可以用于抗肝組織缺血再灌注損傷尚不清楚。此外，也有文獻報道，50～100 mg/kg體質(zhì)量組氨酸可以通過清除單線態(tài)氧和羥基自由基對大鼠短暫性前腦缺血和大鼠離體心臟缺血再灌注損傷有保護作用[23-24]，但是高濃度組氨酸有多種不良反應(yīng)，比如身體發(fā)育遲緩、智力差、情緒不穩(wěn)定、震顫、共濟失調(diào)和精神病等[25]。臨床常用的復(fù)方氨基酸注射液中組氨酸以10～20 mg/kg體質(zhì)量靜脈注射給藥，本實驗通過10 mg/kg體質(zhì)量小鼠腹腔注射給藥，探究是否對于肝組織缺血再灌注損傷有保護作用，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 數(shù)據(jù)來源 數(shù)據(jù)來源于美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中加州大學(xué)洛杉磯分校REED教授團隊的研究，移植前約2 h和再灌注后2 h對移植肝行活檢針活檢(n=40)[26]。所有樣品均在Illumina HiSeq 3000平臺上測序。

1.1.2 實驗動物 購買8～10周齡雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量20～25 g。將小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的無特異性病原體環(huán)境(20～26 ℃，12 h光照和12 h黑暗循環(huán))中，隨意獲取食物和水，飼養(yǎng)3 d。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會的批準(zhǔn)(許可證號：20220998)。

1.1.3 主要試劑 組氨酸(CAS：71-00-1)購自美國默克生物試劑公司?？筩leaved caspase-3抗體(ab32042)、抗Bcl-2抗體(ab182858)、抗Bax抗體(ab32503)購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。蛋白濃度測定試劑盒(P0012)、蛋白提取試劑盒(BC3710)、RIPA裂解液(R0010)購自北京索萊寶科技有限公司。流式細胞術(shù)凋亡檢測試劑盒(BB-4101)購自上海貝博公司。細胞凋亡檢測試劑盒(C1090)、細胞核染色液試劑盒(C1005)、ROS檢測試劑盒(S0033M)采購自北京碧云天試劑有限公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(476826)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒(476831)購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.1.4 主要實驗儀器 FV3000激光共聚焦顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；凝膠成像分析系和流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司；全自動生化分析儀(7600)購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和處理 將30只小鼠分為3組：假手術(shù)組、生理鹽水治療組、組氨酸治療組。組氨酸治療組分別在術(shù)前3、24、72 h注射1 mL組氨酸(濃度為200 μg/mL，10 mg/kg)，生理鹽水治療組及假手術(shù)組注射同體積生理鹽水，注射方式為腹腔注射。

1.2.2 小鼠肝缺血再灌注模型 參照文獻[27-28]，采用8～10周齡(體質(zhì)量20～25 g)雄性小鼠構(gòu)建非致死性節(jié)段性(70%)肝缺血再灌注損傷模型。在用戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，行中線剖腹術(shù)暴露肝臟。然后使用無創(chuàng)傷微血管鉗(1.6 cm，黎泉醫(yī)療器械)夾閉住左葉和正中葉的血液供應(yīng)。缺血性肝葉變白表明缺血手術(shù)成功。缺血1 h后，取出血管鉗進行再灌注，再灌注肝葉較缺血肝葉變紅。在再灌注6 h后，對小鼠實施麻醉安樂死以收集肝臟樣本和血液樣本以供隨后檢查。

1.2.3 肝功能檢測 眼球取血液后，將全血4 ℃靜置過夜，1 500g離心，15 min，收集血清，取20 μL加入180 μL生理鹽水稀釋10倍，血清ALT和AST試劑加入全自動生化分析儀檢測ALT和AST活性。

1.2.4 Western blotting檢測 取右葉肝組織后提取蛋白并測定濃度。配置電泳凝膠，上樣孔中加入相應(yīng)樣本蛋白20 μg，進行電泳，轉(zhuǎn)膜120～180 min，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉90 min；根據(jù)標(biāo)記蛋白裁剪相應(yīng)條帶，將條帶置于一抗(1∶1 000)抗體孵育盒，置于搖床過夜，然后進行二抗(1∶2 000)孵育(室溫1 h)。將條帶放于成像儀器中成像。

1.2.5 肝組織病理學(xué)檢測 肝組織修塊后浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液，石蠟包埋后進行組織切片，厚度為5 μm，HE染色用顯微鏡觀察5個視野進行統(tǒng)計，計算單個視野中肝細胞壞死區(qū)域面積。

1.2.6 肝組織TUNEL染色 使用細胞凋亡檢測試劑盒檢測肝細胞凋亡比例，細胞固定30 min后，加入PBS孵育5 min。使用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20 min。加生物素標(biāo)記液避光孵育60 min，樣品顯色后封片，用顯微鏡觀察5個視野進行統(tǒng)計，計算單個視野中凋亡肝細胞所占百分比。

1.2.7 缺血再灌注人肝永生化(T-antigen-immortalized human liver epithelial，THLE)細胞模型 THLE細胞培養(yǎng)在含有100 mL/L胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中(含0.1 g/L青霉素-鏈霉素)。將THLE細胞分別以每孔3×105個細胞量種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。將細胞分為陰性對照組、生理鹽水處理組和組氨酸處理組，每組6個樣本。除陰性對照組外，對快速生長期細胞分別在無糖、無血清添加生理鹽水和添加組氨酸(200 μg/mL)的DMEM中行缺氧(940 mL/L N2，10 mL/L O2和50 mL/L CO2)培養(yǎng)6 h。然后在正常空氣條件下用100 mL/L胎牛血清(950 mL/L空氣，50 mL/L CO2)在37 ℃下培養(yǎng)6 h。

1.2.8 THLE細胞凋亡檢測 使用細胞凋亡檢測試劑盒檢測缺氧/復(fù)氧THLE肝細胞凋亡改變，將貼壁細胞消化后1 000g離心5 min，加入195 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate，annexin V-FITC)結(jié)合液輕輕重懸細胞后加入5 μL annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。用流式細胞儀檢測凋亡細胞百分比。

1.2.9 THLE細胞ROS檢測 使用ROS檢測試劑盒檢測缺氧/復(fù)氧THLE肝細胞ROS水平，用無血清培養(yǎng)液稀釋2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)終濃度為10 μmol/L，細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次。用共聚焦顯微鏡選取5個視野拍照，ImageJ軟件統(tǒng)計單個視野細胞熒光總強度。

2 結(jié)果

2.1 組氨酸代謝通路在肝組織缺血再灌注后下調(diào)

通過分析NCBI人肝組織移植前后轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA測序(RNA sequencing，RNA-seq)數(shù)據(jù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)組氨酸代謝通路是移植肝缺血再灌注損傷后表達下調(diào)的基因集之一(圖1A)。這表明組氨酸代謝被抑制可能是移植肝缺血再灌注損傷后共有特征。與移植前肝組織相比，組胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶、尿酸水合酶1、酰胺水解酶結(jié)構(gòu)域1、酰胺水解酶結(jié)構(gòu)域2、甲酰氨基轉(zhuǎn)移酶環(huán)脫氨酶、肌肽合酶1，肝移植后6種主要的組氨酸分解代謝酶表達均下調(diào)(圖1B～C)。以上結(jié)果提示，組氨酸濃度升高可能具有抗移植肝缺血再灌注損傷作用。

A：NCBI人肝組織移植前后轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA測序差異基因代謝富集通路圖(n=40)。B：肝組織移植前后組氨酸分解代謝基因表達水平(n=40)；aP<0.05。C：組氨酸分解代謝通路圖。HNMT：組胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶；UROC1：尿酸水合酶1；AMDHD1：酰胺水解酶結(jié)構(gòu)域1；AMDHD2：酰胺水解酶結(jié)構(gòu)域2；FTCD：甲酰氨基轉(zhuǎn)移酶環(huán)脫氨酶；CARNS1：肌肽合酶1。圖1 組氨酸代謝通路在肝臟組織缺血再灌注后下調(diào)

2.2 補充組氨酸具有改善小鼠肝缺血再灌注損傷作用

為了明確組氨酸治療組是否能夠有效改善肝缺血再灌注損傷，我們通過觀察缺血1 h再灌注6 h(圖2A)C57小鼠肝臟組織缺血壞死面積大小、血清轉(zhuǎn)氨酶活性高低和肝組織細胞凋亡所占比例，判斷是否有治療效果。肝組織大體照片顯示組氨酸治療組缺血再灌注后肝組織缺血損傷面積顯著小于生理鹽水治療組(圖2B)。ALT和AST是臨床應(yīng)用最廣泛反映肝細胞損傷的生化指標(biāo)[29]。與生理鹽水治療組相比，組氨酸治療組血清ALT和AST活性明顯降低(P<0.05，圖2C～D)。此外，為了進一步明確組氨酸對于肝缺血再灌注損傷保護作用，我們觀察肝組織病理結(jié)構(gòu)改變。參考肝組織病理學(xué)觀察標(biāo)準(zhǔn)[30]，HE染色結(jié)果提示，生理鹽水治療組缺血再灌注損傷肝組織在光鏡下可見被夾閉部分肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝周邊供血差區(qū)部分細胞變性，肝細胞彌漫腫大，以小葉中央周圍細胞為主；肝細胞核深染，偶見核溶解；散在氣球樣變性及肝細胞壞死灶及明顯炎癥細胞浸潤。組氨酸處理組小鼠肝組織的上述病理學(xué)改變明顯減輕(P<0.05，圖2E～F)。以上結(jié)果均表明，補充組氨酸可改善小鼠肝缺血再灌注損傷。

A：缺血再灌注小鼠模型方案；B：缺血再灌注小鼠肝臟大體照片(n=10)；C～D：小鼠血清ALT、AST活性檢測(n=10)；E～F：小鼠肝臟HE染色肝細胞損傷壞死面積(n=5)。ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。aP<0.05。圖2 補充組氨酸具有改善小鼠肝缺血再灌注損傷作用

2.3 補充組氨酸具有減少缺血再灌注肝細胞凋亡作用

為明確組氨酸是否對缺血再灌注肝細胞有保護作用，我們建立缺氧/復(fù)氧細胞模型模擬細胞缺血再灌注損傷[31](圖3A)。細胞凋亡實驗結(jié)果顯示，與生理鹽水處理組相比，組氨酸處理組細胞總凋亡比例顯著減少(P<0.05，圖3B～C)；此外，肝組織TUNEL染色檢測結(jié)果表明，與生理鹽水治療組相比，組氨酸治療組缺血再灌注損傷肝組織細胞凋亡比例顯著減少(P<0.05，圖3D～E)。因此，補充組氨酸可能對肝細胞具有抗缺血再灌注損傷作用。

2.4 補充組氨酸可減少ROS水平，提示具有抗肝臟缺血再灌注損傷作用

缺血再灌注后ROS水平升高可引起肝細胞損傷和細胞凋亡[32]。為了明確組氨酸改善肝缺血再灌注損傷機制，我們檢測肝細胞ROS水平和凋亡相關(guān)指標(biāo)。與陰性對照組細胞相比，缺氧/復(fù)氧THLE細胞ROS水平顯著增加；而組氨酸處理后，細胞中ROS水平顯著減少(P<0.05，圖4A～B)。ROS增加可以激活細胞凋亡相關(guān)水平，通過蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，生理鹽水治療組肝組織Bax蛋白表達水平均顯著上調(diào)，Bcl-2蛋白表達顯著下調(diào)，Bax/Bcl-2比值顯著升高；此外，cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高。組氨酸治療后，與生理治療組相比，上述促凋亡蛋白水平顯著降低，抑制凋亡蛋白水平顯著升高，Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.05，圖4C～D)。綜上所述，補充組氨酸通過減少細胞ROS水平進而抑制肝細胞凋亡，提示補充組氨酸可以改善肝組織缺血再灌注損傷。

A～B：THLE細胞陰性對照組、生理鹽水處理組和組氨酸處理組測定單個視野細胞ROS熒光總強度(×1 000，n=3)，綠色代表細胞中ROS水平；C～D：假手術(shù)組、生理鹽水治療組和組氨酸治療組肝臟組織缺血再灌注損傷凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平(n=3)。THLE：缺血再灌注人肝永生化；ROS：活性氧。aP<0.05，bP<0.01。圖4 補充組氨酸通過減少細胞ROS水平進而抑制肝細胞凋亡

3 討論

肝臟缺血再灌注不僅直接破壞大量肝細胞，還會影響肝細胞的再生力，這是影響肝手術(shù)成功概率及導(dǎo)致患者術(shù)后肝功能衰退甚至死亡的關(guān)鍵因素[3-4]。2018年8月發(fā)表在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊JHepatol上的研究結(jié)果表明，通過靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人同種異體肝移植后肝臟組織中組氨酸水平明顯升高[33]，本實驗通過對NCBI人肝組織移植前后轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜RNA-seq數(shù)據(jù)分析以及肝移植前后肝臟代謝組學(xué)公共數(shù)據(jù)分析，試圖找出能顯著降低肝缺血再灌注損傷損傷期間ROS的代謝物。結(jié)果顯示，組氨酸可能對肝臟具有抗缺血再灌注損傷作用。

補充組氨酸是增強組織抗氧化作用的一種安全、有效的方法[34]。組氨酸作為一種營養(yǎng)必需氨基酸，可被快速而廣泛地吸收，口服劑量的生物利用度達到80%[35]，這為各種條件下使用組氨酸作為營養(yǎng)補充劑創(chuàng)造了良好的理論依據(jù)。我們研究發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水治療組相比，組氨酸治療組小鼠肝缺血再灌注損傷肝功能明顯改善，通過細胞實驗也發(fā)現(xiàn)組氨酸處理組缺氧/復(fù)氧THLE細胞凋亡比例降低，說明補充組氨酸可以改善移植肝缺血再灌注損傷。此外，我們的研究提示補充組氨酸可減少肝細胞ROS水平，進而抑制細胞凋亡，改善肝臟缺血再灌注損傷。這為移植肝缺血再灌注損傷患者臨床救治提供新的藥物和方法，同時也為更多抗氧化代謝物應(yīng)用于各種缺血損傷疾病提供臨床救治思路。