增強拉曼光譜法快速篩查尿液中的芬太尼類物質(zhì)的研究

＊陳海云 林曉 凌偉航 蘇院司 滕麗瓊

（南寧壯博生物科技有限公司 廣西 530007）

芬太尼是一種強效合成阿片類物質(zhì)，具有陣痛等麻醉藥理作用，與嗎啡類似，但藥效約是嗎啡的75～100倍[1]。過量使用芬太尼可導(dǎo)致嘴唇發(fā)青、呼吸困難、口吐泡沫、身體僵硬，芬太尼的劑量低至2mg就可能致命。芬太尼的相似物極多，其母體包含兩個苯環(huán)與一個哌啶環(huán)，極易被取代，因此也被稱為“設(shè)計家藥物”，且芬太尼本身熒光干擾強，對現(xiàn)場檢測干擾較大[2]。

芬太尼類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)相似度較高，可以通過檢測芬太尼類物質(zhì)共有的官能團進行識別，再根據(jù)取代基的不同進行細分[3]。目前，芬太尼類物質(zhì)的檢驗方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、拉曼光譜法、紅外光譜法等[4]。拉曼增強技術(shù)作為一項新興的分子光譜技術(shù)，可以準(zhǔn)確檢測待測物的分子結(jié)構(gòu)[5]。相較常規(guī)拉曼，增強技術(shù)（SERS）克服其它光譜技術(shù)（常規(guī)拉曼、紅外、紫外-可見光等）難以檢測微痕量物質(zhì)的缺點，將目標(biāo)物信號增大百萬倍以上，并且不受水和環(huán)境氣體信號影響，同時保留其它光譜技術(shù)快速、簡便的優(yōu)點[6]。

本文主要記錄了用拉曼技術(shù)在人體尿液中檢測芬太尼類新精神活性物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)品檢測的實驗過程，并對其實驗結(jié)果進行了分析。

1.實驗部分

(1)實驗儀器及條件

實驗儀器：壯博JD-1000手持式拉曼光譜儀（南寧壯博生物科技有限公司研究團隊研制），激光光源785nm，激光功率250mW，積分時間600ms。壯博JD-1000手持式拉曼光譜儀與市售拉曼光譜儀對比，壯博JD-1000手持式拉曼光譜儀建設(shè)有更為全面的尿液中毒品數(shù)據(jù)庫，并有擁有自身的光譜識別算法和云平臺比對數(shù)據(jù)，市售的大多數(shù)拉曼儀器建立的是標(biāo)準(zhǔn)品比對數(shù)據(jù)庫，并不符合本試驗要求。

(2)實驗材料

實驗以芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼（南京藥科大學(xué)）；表面增強拉曼檢測試劑盒（管制非藥用類麻醉、精神類藥品）（南寧壯博生物科技有限公司）；人體尿樣（南寧壯博生物科技公司）；氯金酸、檸檬酸三鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

(3)實驗方法

①金納米Au@TRM材料制備。將100mL 0.01% HAuCl3溶液加熱至沸騰，加入1mL 1%的檸檬酸鈉溶液作為還原劑，磁力攪拌30min，冷卻后即得納米金溶膠，在納米金溶膠中再加入一定濃度的秋蘭姆溶液，混勻后常溫孵化一定時間，離心濃縮至10mL，再加入90mL復(fù)溶液復(fù)溶。將制備好的溶膠冷卻至室溫，于4℃下避光儲存。

②樣品制備。分別將4種芬太尼加入到人工尿樣中，制備成芐基芬太尼濃度為0.5mg/kg、丙烯酰芬太尼濃度為0.5mg/kg、硫代芬太尼濃度為0.5mg/kg、乙酰芬太尼濃度為1mg/kg的模擬尿樣。標(biāo)準(zhǔn)品芐基芬太尼用水稀釋到濃度為0.5mg/kg、丙烯酰芬太尼用水稀釋到濃度為0.02mg/kg、硫代芬太尼用水稀釋到濃度為0.05mg/kg、乙酰芬太尼用水稀釋到濃度為1mg/kg進行檢測。

③標(biāo)準(zhǔn)品檢測。進行檢測時，將激光頭的激光出射口對準(zhǔn)檢測瓶，檢測瓶中加入待檢驗品，按下手機界面的“檢測”按扭，采數(shù)秒信號后；如果鑒別結(jié)果是危險品，則給出匹配物質(zhì)名稱并震動報警。使用表面增強拉曼檢測試劑盒對樣品進行檢測。

空白檢驗：取100μL去離子水，加入100μL增強試劑，立即用拉曼光譜儀器在目標(biāo)物檢測模式下標(biāo)準(zhǔn)品M1庫中檢測，平行操作4份。取100μL水溶液，加入100μL增強試劑，用拉曼光譜儀器在目標(biāo)物檢驗?zāi)Ｊ较聶z測，重復(fù)檢測4次。

樣品檢驗：取100μL芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼水溶液，加入100μL增強試劑，用拉曼光譜儀器在目標(biāo)物檢驗?zāi)Ｊ较聶z測，重復(fù)檢測4次。

④尿液中摻標(biāo)準(zhǔn)品檢測?？瞻啄蛞簷z測：取4份400 μL空白尿液樣品，按試劑盒產(chǎn)品說明書中方法進行處理，供配套拉曼光譜儀器目標(biāo)物檢驗?zāi)Ｊ较逻M行目標(biāo)物識別檢測。重復(fù)檢測4次。

尿液中摻標(biāo)物檢測：取4份400 μL芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼尿液添加樣品，按產(chǎn)品試劑盒說明書中方法進行前處理再加入100μL增強試劑，供配套拉曼光譜儀器目標(biāo)物檢驗?zāi)Ｊ较逻M行目標(biāo)物識別檢測，重復(fù)檢測4次。

2.結(jié)果與討論

(1)標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果

通過表面增強拉曼試劑，可以將照射到芬太尼類物質(zhì)表面的信號大大增強，從而辨別出不同芬太尼的峰值特征，拉曼測定的是分子受激發(fā)后的反射光，因此對于有些物資如無定型的物質(zhì)玻璃等會在測定中產(chǎn)生強烈的熒光干擾，將拉曼信號掩蓋[7]。所以需要增強試劑增強目標(biāo)物的反射光，放置被熒光干擾或者掩蓋，就結(jié)論而言，增強試劑很好的幫助目標(biāo)物增強了反射光，提供了良好的信號。通過多峰判斷對比出具體物質(zhì)。芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品，實驗結(jié)果如圖1所示。徐琳，何洪源等人[8]研究了28種芬太尼的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)在拉曼光譜中，芬太尼類物質(zhì)均在1000cm-1處有強的拉曼峰，該峰是由苯環(huán)上C-H鍵的面內(nèi)彎曲振動引起的[8]。對應(yīng)我們檢測出的4種芬太尼都出現(xiàn)的位移在996cm-1處的峰。此處的峰為基峰，其他峰的強度均低于基峰強度的30%。僅憑996cm-1這條峰無法確證為芬太尼類物質(zhì)。故需要對各類芬太尼類物質(zhì)進行具體分析其特征峰歸屬，其對應(yīng)的拉曼峰見表1。從這些特征峰數(shù)值和位移情況可以看出，拉曼光譜對于芬太尼類物質(zhì)具有高的區(qū)分度，但對于部分結(jié)構(gòu)上相差一個甲基的結(jié)構(gòu)類似物或甲基取代基不同的同分異構(gòu)體的區(qū)分度較弱。

表1 芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的拉曼特征峰數(shù)值表

圖1 芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的光譜對比圖

(2)尿液中摻標(biāo)檢測結(jié)果

芬太尼樣品在尿液中含有的有機物過多有較強的的干擾，利用試劑盒進行前處理并添加了增強試劑后能夠有效的避免干擾，讀取有效明顯的特征峰。通過比對，能夠很明顯的發(fā)現(xiàn)，拉曼激光明顯會受到環(huán)境或者其他因素干擾（圖2）。

圖2 芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼在尿液中檢出的光譜對比圖

①標(biāo)準(zhǔn)品與尿液中摻標(biāo)光譜比對

芬太尼樣品在尿液中和標(biāo)準(zhǔn)品檢測讀取有效明顯的特征峰。通過比對，能夠發(fā)現(xiàn)，有部分拉曼位移輕微有些變化，其特征峰數(shù)值變動范圍在1～5之間。對于芐基芬太尼拉曼光譜圖，其695cm-1、739cm-1、824cm-1、911cm-1、996cm-1、1022cm-1、1166cm-1、1209cm-1特征峰作為特征識別依據(jù)在尿液中和標(biāo)準(zhǔn)品特征峰一致，其特征峰數(shù)值偏移為0，完全一致；對于乙酰芬太尼，其中996cm-1特征峰作為特征識別依據(jù)在尿液中和標(biāo)準(zhǔn)品一致，其743cm-1、826cm-1、918cm-1、1024cm-1、1069cm-1、1202cm-1為尿液中乙酰芬太尼的特征峰，對比標(biāo)準(zhǔn)品特征峰741cm-1、824cm-1、915cm-1、1022cm-1、1170cm-1、1198cm-1數(shù)值變動范圍為2～4，拉曼位移偏移數(shù)值在5以內(nèi)為正常偏移，所以根據(jù)尿液中乙酰芬太尼與標(biāo)準(zhǔn)品乙酰芬太尼特征峰判別，無雜峰、圖譜一致，識別為同一物質(zhì)；尿液中丙烯酰芬太尼1019cm-1、1251cm-1特征峰對比標(biāo)準(zhǔn)品特征峰1021cm-1、1249cm-1，其特征峰數(shù)值變動范圍為3，為正常偏移，所以根據(jù)尿液中丙烯酰芬太尼與標(biāo)準(zhǔn)品丙烯酰芬太尼特征峰判別，無雜峰、圖譜一致，可識別為同一物質(zhì)；對于硫代芬太尼，551cm-1、996cm-1、1068cm-1特征峰為兩種狀態(tài)共同特征識別依據(jù)，尿液中硫代芬太尼739cm-1、800cm-1、909cm-1、1023cm-1、1162cm-1、1414cm-1特征峰對比硫代芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品特征峰742cm-1、802cm-1、911cm-1、1021cm-1、1164cm-1、1412cm-1，其特征峰數(shù)值變動范圍為2～3，也為正常偏移，所以根據(jù)尿液中硫代芬太尼與標(biāo)準(zhǔn)品硫代芬太尼特征峰判別，無雜峰、圖譜一致，可識別為同一物質(zhì)。

3.結(jié)論

本文基于拉曼增強技術(shù)對水溶液和尿液中的芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼進行研究。通過實驗值對比，分析了4種芬太尼的拉曼光譜特征。在實戰(zhàn)時，對樣品進行前處理后，排除雜質(zhì)和熒光干擾條件下，證明利用增強拉曼技術(shù)可有效檢測出低痕量芬太尼類物質(zhì)，絕大多數(shù)的芬太尼類結(jié)構(gòu)類似物都明顯具有區(qū)分度。由于芬太尼類物質(zhì)種類多且人體吸食后代謝研究難度大，所以芬太尼類物質(zhì)在生物體內(nèi)經(jīng)過代謝后尿液中的藥物濃度的確切含量還在不斷研究中，尚不能定論是怎樣的數(shù)值。本次試驗的檢出限對比液相色譜儀能檢出的檢出限來看偏高，還需進行更多的試驗去驗證該方法在警方實戰(zhàn)過程中的有效性。且本文利用拉曼技術(shù)檢測人體尿液中芬太尼的試驗由于沒有大量吸食芬太尼的人員尿液，所以本試驗是在正常人體尿液中摻入的芬太尼類物質(zhì)的低濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實際應(yīng)用時可能出現(xiàn)假陰性或者假陽性的結(jié)果，驗證實際應(yīng)用情況，需要在警方的支持下才能更好的完成試驗[9-10]。

總的來說，該方法具有快速、準(zhǔn)確、無損、操作簡便等優(yōu)點，為水溶液中和尿液中芐基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼的快速檢測打下了良好的基礎(chǔ)。