鉛脅迫下東南景天耐鉛內(nèi)生細菌種群多樣性分析

李佳益,李曦,范銘豐,王曉艷,劉希華

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測與可持續(xù)經(jīng)營利用重點實驗室,福建 三明 365004;2.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院,福建 三明 365004;3.三明市土肥站,福建 三明 365000; 4.三明市林業(yè)局,福建 三明 365000)

土壤重金屬污染是一個世界性的緊迫問題。土壤中金屬含量的持續(xù)增加通過食物鏈對人類和動物的健康構(gòu)成威脅。土壤中的重金屬會抑制大多數(shù)植物的生長,尤其是非必需的重金屬,如Pb、Cd、Cr等[1]。植物細胞具有一系列潛在的重金屬的解毒機制,從而有重金屬脅迫的耐性[2]。內(nèi)生細菌不僅具有抵御重金屬毒性的能力,還能增加宿主植物對養(yǎng)分的獲取,增強其對抗脅迫的代謝活性[3]。因此,利用內(nèi)生細菌緩解重金屬對寄主植物的毒性是提高植物重金屬耐受性的有效策略。

東南景天(Sedumalfredii)屬景天科(Crassulaceae),是一種Cd/Zn超富集植物和Pb高富集植物,21世紀初在中國被發(fā)現(xiàn)。東南景天的營養(yǎng)繁殖簡單和快速生長的特性以及顯著的Cd、Zn和Pb吸收、積累特性使其成為植物修復(fù)多重污染土壤的最佳種質(zhì)資源[4]。但由于其植株矮小,生物量較小,修復(fù)重金屬污染土壤的效果甚微。林木生物量大,生長快速,作為能源植物獲得經(jīng)濟收益,是理想的植物修復(fù)材料,但由于重金屬對多數(shù)林木有毒害作用,導(dǎo)致幼樹生長下降,嚴重可致其死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn),一些植物生長促進菌(plant growthpromoting bacteria,PGPB)可以通過刺激植物激素(生長素、細胞分裂素、赤霉素等)的合成來輔助寄主植物,通過產(chǎn)生鐵團、增磷和固氮來緩解營養(yǎng)缺乏,通過細胞外沉淀、細胞內(nèi)積累、隔離和酶解毒(如氧化/還原)降低重金屬生物毒性[5]。此外,PGPB接種提高了成年植物的重金屬積累和轉(zhuǎn)運能力[6]。

本文分析鉛脅迫東南景天耐鉛內(nèi)生細菌的種群多樣性,分析其內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群,將優(yōu)勢種群轉(zhuǎn)接到林木種子或者幼苗上,以利于林木在幼苗期獲得耐鉛污染的能力,從而提升植物修復(fù)鉛污染土壤的效率。

1 材料與方法

1.1 植物材料

1.1.1 植物材料 選擇生長一致的東南景天植株移植到花盆中,砂子和壤土配比為1∶1。配制2.4、4.8、7.2、9.6、12 mmol/L硝酸鉛溶液1000 mL,每3天澆灌一次東南景天,一次100 mL,30 d以后,土壤中鉛離子的濃度達到相應(yīng)處理濃度。鉛脅迫處理之后更換成無菌水100 mL,一個月后采集長勢好、無病害的東南景天的不同部位(根、莖、葉)新鮮組織進行內(nèi)生細菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 配制2.4、4.8、7.2、9.6、12、14.4 mmol/L硝酸鉛濃度的LB固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 耐鉛內(nèi)生細菌分離 分別取東南景天根、莖、葉,清洗干凈后,小量流水清洗1 h,分別移入組培瓶中。在超凈工作臺上完成如下工作:75%的酒精振蕩清洗(根5 min,莖和葉各2 min),無菌水中振蕩清洗5遍,最后一遍無菌水涂布LB培養(yǎng)基以確定是否為內(nèi)生細菌。消毒后的材料分別在滅菌后的研砵添加3～5 mL無菌PBS緩沖液和石英砂進行研磨,吸取研磨后的汁液放入離心管中,在離心機中2000 r/min下離心3 min,吸取150 uL的上清液,涂布在含不同鉛離子的培養(yǎng)基,3次重復(fù),培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24 h,統(tǒng)計各培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。

1.2.2 內(nèi)生細菌基因組DNA提取和16S rDNA序列擴增 菌株基因組DNA用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒(天根,DP302-02)進行提取,以通用引物8f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)(上海華大基因)進行PCR擴增。退火溫度為52℃。PCR產(chǎn)物為1600 bp左右。

1.2.3 16S rDNA序列酶切圖譜分析 選用HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ和TaqⅠ等4 種限制性內(nèi)切酶消化16S rDNA擴增產(chǎn)物,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,分析酶切結(jié)果,分別用0,1數(shù)字代表酶切條帶的有無。

1.2.4 代表種群分子鑒定 篩選出聚類分析結(jié)果中的9個組群的代表種,擴增出16S rDNA片段,回收1600 bp左右的PCR產(chǎn)物并連接到pMD19-T Vector,挑取陽性克隆送往上海華大基因公司測序。序列經(jīng)BLAST進行最大相似性比對,用Clustal X 1.83進行同源性分析[7]。

1.3 統(tǒng)計分析

采用DPS[8]進行方差分析。

應(yīng)用Pritchard等[9]聚類分析方法(軟件Structure Version 2.2)對供試的內(nèi)生細菌的酶切結(jié)果進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。其中設(shè)定群體數(shù)目(K)為2～15,Structure參數(shù)Burnin Period和afterBurnin均設(shè)定為10 000次,然后依據(jù)似然值最大的原則選取合適的K值[11],并畫出基于模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 東南景天內(nèi)生細菌分離情況

通過分離結(jié)果(圖1、圖2和圖3)來看,從東南景天的根部分離出來的內(nèi)生細菌的數(shù)量明顯多于莖部和葉部,葉部所分離的內(nèi)生細菌數(shù)量最少。以土壤中鉛離子濃度為12 mmol/L的東南景天體內(nèi)所分離出來內(nèi)生細菌數(shù)量最多,而2.4 mmol/L組則數(shù)量最少。隨著鉛脅迫的濃度的增大,東南景天體內(nèi)所共生的內(nèi)生細菌數(shù)量也隨之增加,以幫助東南景天來抵抗鉛離子脅迫,而在低濃度的鉛離子環(huán)境中,由于東南景天自身具有富集鉛離子的特性,所以無需共生細菌來抵抗鉛脅迫。不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基中分離內(nèi)生細菌的數(shù)量也不同,趨勢為隨著培養(yǎng)基鉛離子增加,相應(yīng)的內(nèi)生細菌的數(shù)量也隨之增加,但培養(yǎng)基中鉛離子的濃度超過9.6 mmol/L時,內(nèi)生細菌數(shù)量開始下降,當(dāng)培養(yǎng)基中鉛離子濃度為14.4mmol/L時,內(nèi)生細菌數(shù)量最少。方差分析結(jié)果表明(表1),東南景天不同部位、不同鉛離子濃度土壤和不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基所分離的內(nèi)生細菌的數(shù)量達到極顯著差異。

注:圖示為土壤中鉛離子濃度,單位為mmol/L,下同。

圖2 不同鉛離子濃度土壤東南景天莖中不同鉛濃度培養(yǎng)內(nèi)生細菌的數(shù)量

圖3 不同鉛離子濃度土壤東南景天葉中不同鉛濃度培養(yǎng)內(nèi)生細菌的數(shù)量

表1 東南景天內(nèi)生細菌方差分析表

2.2 東南景天內(nèi)生細菌聚類分析

本文選取土壤和培養(yǎng)基鉛離子濃度均為12 mmol/L的組合來分析東南景天體內(nèi)生細菌的種群結(jié)構(gòu)。選取根82株、莖29 株、葉7 株進行提取單菌落細菌DNA,擴增16S rDNA序列,經(jīng)酶切,酶切產(chǎn)物有多種類型(圖3)。整理四種酶的酶切圖,分別用0,1數(shù)字代表酶切條帶的有無,并進行統(tǒng)計。

圖3 酶切凝膠電泳圖

利用Structure軟件對118株內(nèi)生細菌菌株進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,在K=2～12中,K=9時似然值最大(圖4),因此東南景天內(nèi)生細菌種群應(yīng)分為9大類(圖5),表明東南景天內(nèi)生細菌種群具有明顯的多元特性和異質(zhì)性。

以第8組群數(shù)量最多,為24個,第9組群和第1組群數(shù)量也較多,分別是17個和15個,第6組群數(shù)量為13個,第3組群數(shù)量為11個,其他4個組群數(shù)就比較少,第5組群、第7組群、第2組群和第4組群分別為9個、9個、6個和6個,無法定義分類的種群數(shù)量為8個。說明第8和第9組群為主要組群。

選取這9個組群的代表菌株進行測序,將測序序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索,分別找到與之相似性最高的種屬,系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,推斷出這9個組群所代表的菌種如表2。從表2中可以看到,芽孢桿菌屬(Bacillus)的數(shù)量在內(nèi)生細菌中是最多的,假單胞菌屬(Pseudomonas)和腸桿菌屬(Enterobacter)的數(shù)量也占據(jù)優(yōu)勢。阪崎腸桿菌屬(Cronobacter)和賴氨酸桿菌屬(Lysinibacillus)的數(shù)量則是最少的。

表2 9個組群的代表菌種

3 小結(jié)與討論

本文探討了不同鉛離子脅迫下的東南景天體內(nèi)耐鉛內(nèi)生細菌的種群多樣性。在預(yù)試驗中,由于高濃度(土壤中鉛離子濃度為14.4 mmol/L)的鉛脅迫導(dǎo)致東南景天出現(xiàn)葉片發(fā)黃,且部分植株死亡,所以沒有開展該處理的東南景天內(nèi)生細菌的分離。通過分離實驗,從東南景天的根部分離出來的內(nèi)生細菌的數(shù)量明顯多于莖部和葉部,葉部所分離的內(nèi)生細菌數(shù)量最少。在鉛脅迫培養(yǎng)東南景天內(nèi)生細菌分離實驗中,隨著硝酸鉛濃度的增加,內(nèi)生細菌的數(shù)量也增加,以土壤中鉛離子濃度12 mmol/L的東南景天體內(nèi)所分離出來的內(nèi)生細菌數(shù)量最多。不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基中分離內(nèi)生細菌的數(shù)量也不同,9.6 mmol/L鉛離子培養(yǎng)基中分離到內(nèi)生細菌數(shù)量最多,而14.4 mmol/L鉛離子的培養(yǎng)基中所分離到的內(nèi)生細菌數(shù)量最少。利用Structure軟件并結(jié)合分子鑒定對澆鉛濃度和培養(yǎng)基鉛離子濃度均為12 mmol/L所分離到118株東南景天內(nèi)生細菌菌株進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,表明芽孢桿菌屬的數(shù)量在內(nèi)生細菌中是最多的,依次是假單胞菌屬和腸桿菌屬,說明這三者是東南景天體內(nèi)的優(yōu)勢種群。

隨著全球工業(yè)化的發(fā)展,世界范圍內(nèi)土壤中的重金屬濃度進一步增加,從而影響到人類的健康。因此如何修復(fù)土壤中的重金屬污染是科學(xué)家亟待解決的問題。微生物與植物的聯(lián)合修復(fù)既解決了微生物修復(fù)重金屬污染的殘留問題,也解決鉛脅迫植物生長不良的問題,已成為現(xiàn)在研究熱點。微生物在植物生長和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[10]。同時,植物微生物共生有效地改善了土壤質(zhì)量和養(yǎng)分循環(huán),因此,接種精選和馴化的微生物可以顯著提高植物修復(fù)效率[11]。植物的種類和基因型、植物組織與植物內(nèi)生細菌的種群密度關(guān)聯(lián)性很大,有文獻報道,植物超積累重金屬的機制很可能與定殖于其組織內(nèi)的內(nèi)生菌多樣性有著十分密切的關(guān)系[12],從部位來說植物根組織中的內(nèi)生細菌的種群密度是最高的[13]。本文中,東南景天的根部的內(nèi)生細菌數(shù)量也是遠高于莖和葉組織。研究發(fā)現(xiàn),一些植物生長促進細菌可以通過刺激生長素、細胞分裂素和赤霉素等植物激素的合成來幫助寄主植物;通過鐵載體的產(chǎn)生、磷的溶解和固氮來緩解營養(yǎng)缺乏;通過細胞外沉淀、細胞內(nèi)積累、隔離和酶解毒(如氧化/還原)來降低重金屬的生物毒性[14-16]。隨著鉛脅迫濃度的增大,植物體內(nèi)需要有更多內(nèi)生細菌的數(shù)量,以促進植物的生長以及提高植物對鉛的抗性。芽孢桿菌USTB-O 可提高小麥對 Cu 的積累,且能分泌 IAA促進植物生長[17];而假單胞菌能夠向植物根際提供生長激素[18],促進植物生長的同時會產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)[19],吸收植物所產(chǎn)生的ACC以降低植物的乙烯含量[20];腸桿菌通過改變重金屬價態(tài)的形式實現(xiàn)去除重金屬毒性的作用[21]。這3類菌能夠保護植物在鉛脅迫逆境中的生長,成為東南景天內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群。

東南景天體內(nèi)具有豐富促生特性的內(nèi)生細菌種質(zhì)資源,這對于植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染菌群資源的開發(fā)及微生物肥料的菌種選育和生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。