酸櫻桃離體快繁體系研究

楊囡君

(商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南 商丘 476100)

園藝學(xué)上的核果類(lèi)是指植物分類(lèi)學(xué)上薔薇科李亞科Drupaceae(Prunoideae) 李屬(PrunusLinn)果實(shí)為核果的一類(lèi)果樹(shù)[1],通常包括櫻桃、桃、李、杏等,屬于我國(guó)的果樹(shù)生產(chǎn)方面重要的種類(lèi),其在生產(chǎn)上常采取種子繁殖和無(wú)性繁殖.種子繁殖簡(jiǎn)單易行、成本低廉,但苗木生產(chǎn)速度較慢,苗質(zhì)較差,且易出現(xiàn)品種變異問(wèn)題,這已成為制約核果類(lèi)果樹(shù)生產(chǎn)發(fā)展的限制因素[2].此外,核果類(lèi)果樹(shù)種質(zhì)資源的保存采用田間保存的方法,占地面積大、管理經(jīng)費(fèi)高,而且一旦遇到環(huán)境的威脅或危害性病蟲(chóng)害,可能導(dǎo)致種質(zhì)資源的丟失,而利用組織培養(yǎng)的方法可以克服上述的缺點(diǎn).

櫻桃的離體培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)80年代[3-4],經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展,目前已在莖尖和莖段培養(yǎng)、葉片離體培養(yǎng)、不定根培養(yǎng)、胚培養(yǎng)等許多領(lǐng)域都有較為關(guān)鍵的突破.

提升櫻桃繁殖率可以運(yùn)用莖尖、莖段進(jìn)行培養(yǎng),這在較短的時(shí)間內(nèi)即可完成,還能夠根據(jù)其特點(diǎn)進(jìn)行分化而取得植株再生.總之,這一優(yōu)勢(shì)在無(wú)土苗木領(lǐng)域處于非常關(guān)鍵的地位.

本試驗(yàn)的目的是以我國(guó)核果類(lèi)果樹(shù)常用的砧木酸櫻桃為試材,建立并完善其離體快繁體系,并保存這些果樹(shù)的種質(zhì)資源,為未來(lái)基礎(chǔ)理論研究提供所需的批量化性狀相同的試驗(yàn)苗木.同時(shí),有助于苗木砧木生產(chǎn)方面的推廣應(yīng)用,給轉(zhuǎn)基因工程打下良好的基礎(chǔ),也為合理保護(hù)核果類(lèi)果樹(shù)的種質(zhì)資源及研究其離體保存技術(shù)做出貢獻(xiàn).

1 材料與方法

1.1 材料

酸櫻桃 ‘CAB’砧木可以使接穗的花期推遲,從而可以避開(kāi)晚霜期,使接穗不受凍害.其耐寒性、耐旱性較強(qiáng),對(duì)土壤條件要求不高,實(shí)生繁殖時(shí),根系發(fā)達(dá),與甜櫻桃品種的嫁接親和力很強(qiáng),且有矮化作用.

酸櫻桃品種‘CAB’于2020年5月初由北京市的農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

外植體是來(lái)自于酸櫻桃根蘗苗的莖尖以及帶腋芽的莖段部分外植體,經(jīng)自來(lái)水沖洗完成后,分別剪制1 cm左右莖段,然后放置超凈工作臺(tái)中采用2種殺菌方法:1)75%乙醇30 s+0.1%升汞5 min;2)75%乙醇30 s+0.1%升汞7 min,再用無(wú)菌水沖洗5次,多余水分用無(wú)菌濾紙吸干[5-6].統(tǒng)計(jì)接種成活率:

成活率=接種成活外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%.

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

初代培養(yǎng)基選擇櫻桃組織培養(yǎng)常用的MS[7-8](瓊脂6 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、pH5.8)和F14(瓊脂6 g·L-1、蔗糖20 g·L-1、pH5.4)培養(yǎng)基[1],[3].將培養(yǎng)基分裝到100 ml三角瓶中,每瓶分裝大約50 ml,在1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓121℃下,保持壓力15 min,高壓滅菌.培養(yǎng)設(shè)定的光照強(qiáng)度是1800 lx-2000 lx,一天的光照時(shí)間是10 h,溫度設(shè)定的是23±2℃.培養(yǎng)基配制、滅菌方法以及培養(yǎng)條件,下同.

1.2.3 增殖培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)基以篩選出的初代培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度配比的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素,共12種處理組合.其中,IBA設(shè)3個(gè)水平,分別為0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1;6-BA設(shè)4個(gè)水平,分別為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1.

每個(gè)處理均接種10株,完成3次的重復(fù),培養(yǎng)時(shí)間為1個(gè)月,再仔細(xì)察看,計(jì)算其增殖的系數(shù)、所產(chǎn)出的新梢的有效數(shù)量(指那些分化苗的長(zhǎng)度是大于1 cm的植株)及所生長(zhǎng)出的有效新梢的所占比的概率.

增殖的系數(shù)=參與進(jìn)行的分化苗的總數(shù)量/實(shí)驗(yàn)所用接種的數(shù)量.

產(chǎn)出的有效新梢占比的概率=生產(chǎn)出的有效新梢的數(shù)量/參與進(jìn)行的分化苗的總數(shù)量×100%.

1.2.4 生根培養(yǎng)及移栽基質(zhì)的篩選

本試驗(yàn)主要運(yùn)用了2種方式來(lái)開(kāi)展具體的生根測(cè)試:

1) 采用高濃度的生長(zhǎng)素苗基浸蘸的方式.用經(jīng)過(guò)高壓滅菌濃度分別為100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1的IBA浸蘸無(wú)菌植株的基部5 min、10 min、15 min、20 min、30 min,后將其接種到1/2MS空白培養(yǎng)基中,共15種處理.

2) 給1/2MS培養(yǎng)基添加濃度分別為0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1的IBA,共5種處理.

平均每種的接種數(shù)量都是30株.通過(guò)一個(gè)月的培育,計(jì)算其生根的數(shù)量(即參與生根的植株的數(shù)目數(shù)值)、產(chǎn)出生根的所占比概率、所參與生根的平均的根長(zhǎng)度.

產(chǎn)出生根的所占比概率=所生根的數(shù)量/參與進(jìn)行接種的總數(shù)量值×100%.

所生根的平均的根長(zhǎng)度=總根共有的長(zhǎng)度之和/所有的根數(shù)量.

挑選出長(zhǎng)度大概為2 cm,并且根的長(zhǎng)勢(shì)大致相同的所生根苗,再進(jìn)行3-5天的開(kāi)蓋煉苗后,再把苗拿出來(lái),將根上面的瓊脂清洗干凈,隨后將其放置進(jìn)通過(guò)高壓滅菌的河砂、蛭石以及營(yíng)養(yǎng)土與蛭石比例是1∶1的基質(zhì)里面.移入栽植的成活率與移栽后1周的溫度及濕度有很大關(guān)系,因此在移栽時(shí)要保持溫度適宜,且在移栽的第1周要注意保濕和通風(fēng),以提高成活率.

以上數(shù)據(jù)處理采用DPS數(shù)據(jù)處理分析軟件進(jìn)行分析.統(tǒng)計(jì)方法及數(shù)據(jù)處理方法,下同.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法和培養(yǎng)基對(duì)成苗的影響

通過(guò)濃度0.1%升汞對(duì)外植體加以消毒處置.由于升汞對(duì)外植體存毒害,用此點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)檢.預(yù)檢測(cè)結(jié)果顯示:消毒時(shí)間為5 min、7 min時(shí),外植體成活的概率分別是66.9%和83.2%,所以消毒時(shí)間確定為7 min.

圖1 不同培養(yǎng)基的初代培養(yǎng)

將選用的植株培養(yǎng)30天,這樣其頂芽與莖段可以不再需愈傷組織的時(shí)間,就能直接長(zhǎng)出新的不定芽.而被放置在MS培養(yǎng)基里面的那些無(wú)菌苗,呈現(xiàn)出翠綠的色澤,成長(zhǎng)茂盛.處于F14培養(yǎng)基中的無(wú)菌苗,呈現(xiàn)出較重的玻璃化情況(如圖1所示),生長(zhǎng)點(diǎn)褐化死亡.F14也是比較經(jīng)常采用的櫻桃組織培養(yǎng)基,可在此次酸櫻桃培育生長(zhǎng)的時(shí)候,選用F14當(dāng)作初代的培養(yǎng)基,這也造成呈現(xiàn)出莖尖的生長(zhǎng)點(diǎn)形成了褐化死亡,以及還有玻璃化的嚴(yán)重情形,造成這些情形的原因是酸櫻桃的基因類(lèi)型跟其他的櫻桃的品種屬性可能存在差異性.另外,楊振國(guó)等[9]的酸櫻桃玻璃化苗研究結(jié)論表明:蔗糖濃度為20 g·L-1時(shí),約有1/5的酸櫻桃出現(xiàn)了玻璃化苗,而且蔗糖濃度與玻璃苗的數(shù)量呈負(fù)相關(guān),可見(jiàn)蔗糖含量的降低是導(dǎo)致F14培養(yǎng)基試管苗出現(xiàn)玻璃化的主要因素.因此,本試驗(yàn)所篩選出的MS培養(yǎng)基更適宜于培養(yǎng)初代酸櫻桃.

2.2 不同濃度外源激素對(duì)酸櫻桃增殖的影響

Wilkins[10]以前記載過(guò)BA與IBA均為酸櫻桃的擴(kuò)大繁殖十分適合采用的激素,所以本試驗(yàn)也把側(cè)重點(diǎn)放在了濃度不一樣的BA與IBA激素方面,主要分析它們分別在酸櫻桃的實(shí)際生長(zhǎng)以及擴(kuò)大繁殖過(guò)程中所起到的成效,結(jié)果如表1所示.酸櫻桃增殖培養(yǎng)基采用12個(gè)處理組合,結(jié)果表明,編號(hào)為1、2、3、4(其BA的濃度不一樣,分別是0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1,而IBA的濃度一樣,都是0.1 mg·L-1)的培養(yǎng)基在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),植株矮小,增殖系數(shù)低,且有黃化和死亡的情況發(fā)生;相反,在編號(hào)為7、8、11、12(其BA的濃度較高,BA濃度分別為1.5 mg·L-1、1.5 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1)的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)得酸櫻桃,則增殖的系數(shù)很高.這一結(jié)果在編號(hào)為12(BA濃度是2.0 mg·L-1,IBA濃度是0.3 mg·L-1)的培養(yǎng)基內(nèi)最為明顯,其增殖的系數(shù)達(dá)到6.1,但因?yàn)樵撆囵B(yǎng)基的分裂素濃度也比較高,其分化苗也均呈現(xiàn)出程度不一的玻璃化.而在編號(hào)分別為5、6、9、10(其IBA濃度分別是0.2 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.3 mg·L-1)的培養(yǎng)基內(nèi),酸櫻桃的分化苗生長(zhǎng)勢(shì)良好.其中,編號(hào)5的培養(yǎng)基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1)中的酸櫻桃的增殖系數(shù)的數(shù)值達(dá)到了4.5,所產(chǎn)生出的有效的新梢(主要是指那些新梢長(zhǎng)度在1 cm以上)的數(shù)值占比概率則是83.6%.可見(jiàn),編號(hào)5的培養(yǎng)基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1)是酸櫻桃增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基(如圖2所示).編號(hào)是9的培養(yǎng)基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1)內(nèi)的植株生長(zhǎng)最是茁壯,都是節(jié)間產(chǎn)生的分化苗,將其同其他的培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比便會(huì)發(fā)現(xiàn),這一培養(yǎng)基是最佳的適用酸櫻桃健壯生長(zhǎng)的培養(yǎng)基.

圖2 離體增殖的酸櫻桃苗

2.3 不同生根方式對(duì)酸櫻桃生根的影響

苗基浸蘸方法對(duì)于酸櫻桃生根產(chǎn)生的影響.酸櫻桃苗基在100 mg·L-1IBA里分別浸泡20 min、30 min,以及在200 mg·L-1IBA浸泡5min后(如表2所示),生根效果均較好,生根率可達(dá)100%,平均根長(zhǎng)5.1 cm-8.9 cm(如圖3所示),即低濃度長(zhǎng)時(shí)間浸蘸和高濃度短時(shí)間浸蘸均可達(dá)到較好的效果.但是當(dāng)IBA濃度達(dá)到200 mg·L-1,處理時(shí)間20 min以上時(shí),則無(wú)法生根,只形成大的愈傷組織.其原因可能是生長(zhǎng)素可以促進(jìn)根原基形成,而幼根的生長(zhǎng)則不需要高濃度的生長(zhǎng)素,否則會(huì)起到抑制根系的生長(zhǎng)作用[11].

表2 苗基浸蘸方法對(duì)于酸櫻桃生根產(chǎn)生的影響

圖3 苗基浸蘸法生根苗

不同的IBA濃度對(duì)于酸櫻桃生根產(chǎn)生的影響,如表3所示.酸櫻桃以1/2 MS為基本培養(yǎng)基時(shí),均有生根現(xiàn)象產(chǎn)生.在1/2 MS培養(yǎng)基上不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也可以生根,說(shuō)明酸櫻桃較易產(chǎn)生根系.隨著生長(zhǎng)素IBA濃度的增加,產(chǎn)生根的概率也開(kāi)始增加,IBA濃度繼續(xù)增加后生根概率開(kāi)始減少,平均根長(zhǎng)也隨之變短,出現(xiàn)大量的愈傷組織,即在高濃度生長(zhǎng)素IBA的作用下,產(chǎn)生了大量的根原基.當(dāng)IBA濃度為0.5 mg·L-1時(shí),酸櫻桃平均生根率達(dá)到了76.7%,根長(zhǎng)平均為2.1 cm(如圖4所示).比較兩種生根方式可以發(fā)現(xiàn):第一種苗基浸蘸法,比較容易生根而且根系也有較快的生長(zhǎng)速度,這可以減少生根以及移植栽培的時(shí)間,但是操作過(guò)程比較繁雜;第二種普通生根法,操作過(guò)程比較容易,但生根的概率比較小,根系的生長(zhǎng)速度也相對(duì)緩慢,需要一個(gè)月才能正常移植栽培.所以,選擇哪一種生根的方法,可根據(jù)具體的情況和需求來(lái)定.

表3 不同的IBA濃度對(duì)于酸櫻桃生根產(chǎn)生的影響

圖4 普通生根法生根苗(1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1 )

2.4 不同移栽基質(zhì)對(duì)酸櫻桃試管苗成活率的影響

在移栽植株的生長(zhǎng)狀況、根長(zhǎng)、移栽環(huán)境的溫度都保持一致的情況下,各種基質(zhì)中植株的移入栽植的成活概率也存在著較大的差別,如表4所示.如果基質(zhì)是河砂的時(shí)候,移入栽植的成活概率最小,可達(dá)到20%;在蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土(1∶1)中,移栽成活率可達(dá)60%;蛭石中移栽成活率最高可達(dá)80%.由此可以得出,因河砂保水性太差,使剛剛移栽的新植株得不到充分的濕度,致使植株移栽成活率最低;蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土(1∶1)基質(zhì)環(huán)境的透氣性比單獨(dú)使用蛭石差,使移栽新植株的根得不到更好的呼吸,可能導(dǎo)致根部腐爛,從而致使植株死亡.移栽30天后,長(zhǎng)出新葉的植株移入溫室,可全部成活.

表4 不同的基質(zhì)對(duì)于酸櫻桃的成活概率產(chǎn)生的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

以酸櫻桃春季根孽苗的莖尖和帶腋芽的莖段為外植體,用濃度75%乙醇浸泡30 s,濃度0.1%升汞處理7 min,成活率可達(dá)83.2%;適合酸櫻桃初代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1,增殖系數(shù)為4.5;最佳生根方式為 200 mg·L-1IBA浸蘸無(wú)菌苗基部5 min,生根率高達(dá)100%,平均根長(zhǎng)8.6 cm;最佳移栽基質(zhì)為蛭石,成活率可達(dá)80%.

3.2 討論

3.2.1 植體的選擇及殺菌處理

在組織培養(yǎng)的過(guò)程中,得到無(wú)菌株系是建立離體快繁體系最基礎(chǔ),也是最關(guān)鍵的一步.外植體本身的情況,例如品類(lèi)特征、培育的階段、年齡與生理情況、大小情況和其處在樹(shù)體以及枝條部分的具體位置等等,都可以對(duì)外植體本身的細(xì)胞的全能屬性以及組織部分的器官再生屬性的表現(xiàn)產(chǎn)生影響.所以,篩選出比較適用的外植體,在繁殖微體的成功與否上有著非常關(guān)鍵的意義.

外植體常選用幼年型材料或成年樹(shù)上的幼態(tài)部分,如靠近基部的萌生枝條、根孽條等[12].取本試驗(yàn)的酸櫻桃的實(shí)生苗或者新生枝條等幼嫩材料作為外植體均能較快地建立起無(wú)菌培養(yǎng)體系.

常用的植物消毒滅菌劑有次氯酸鹽、升汞、漂白粉、過(guò)氧化氫及抗生素.升汞滅菌效果最好,但其殘留最難除去,而且對(duì)植物的組織來(lái)說(shuō)傷害也較為明顯,所以需要對(duì)它的消毒時(shí)長(zhǎng)加以嚴(yán)格管控,通常不能讓其消毒時(shí)長(zhǎng)多于10 min,且使用濃度為0.1%-0.2%.針對(duì)不同時(shí)期、種類(lèi)的外植體,應(yīng)選擇合適的消毒劑和消毒方法.

3.2.2 培養(yǎng)基的選擇

酸櫻桃和山杏的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,山桃和‘麗春’的基本培養(yǎng)基為G培養(yǎng)基,光核桃的基本培養(yǎng)基為MS-R培養(yǎng)基.

本試驗(yàn)選用常規(guī)F14培養(yǎng)基作為酸櫻桃的初代培養(yǎng)基,但出現(xiàn)了死亡和玻璃苗,這可能是因?yàn)樗釞烟姨厥獾幕蛐退鸬?但楊振國(guó)等[9]的研究表明,蔗糖濃度為20 g· L-1時(shí),可使1/5的酸櫻桃出現(xiàn)了玻璃化苗,而且蔗糖濃度與玻璃苗的數(shù)量呈負(fù)相關(guān).所以,也可以認(rèn)為,出現(xiàn)玻璃苗的原因是F14培養(yǎng)基蔗糖含量低.

本試驗(yàn)篩選出了適合酸櫻桃快繁的初代培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基,實(shí)現(xiàn)了試驗(yàn)預(yù)期目標(biāo),為建立酸櫻桃快繁體系打下了良好基礎(chǔ).但是,在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的一些問(wèn)題還亟待解決,例如培養(yǎng)基易被污染的問(wèn)題,這需要廣大同仁們持續(xù)努力,不斷優(yōu)化試驗(yàn)程序步驟.