茶樹休眠相關(guān)基因CsAGL8 的克隆與表達(dá)分析*

胡小莉，付一丹，崔 懂，夏心杰，陳盛相，唐 茜，譚禮強(qiáng)**

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2.精制川茶四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

芽休眠是植物抵抗低溫和短日照等不利生長(zhǎng)環(huán)境的一種自我保護(hù)機(jī)制，受光照、溫度、激素和遺傳等調(diào)控[1-2]，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用。在遺傳調(diào)控方面，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族被廣泛證明參與了植物芽休眠、種子休眠和開花等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控[3-5]，其中，Dormancy Associated MADS-box (DAM)基因?qū)儆贛ADS-box家族的MIKCC型轉(zhuǎn)錄因子。BIELENBERG 等[6]證明桃樹(Prunus persica)缺失6 個(gè)串聯(lián)的DAM基因，導(dǎo)致無(wú)冬季休眠現(xiàn)象。近年來(lái)在蘋果、桃、梨、獼猴桃和茶樹等植物中克隆得到DAM基因，研究結(jié)果顯示其參與調(diào)控植物的芽休眠進(jìn)程，對(duì)芽生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制[7-11]。

MADS-box家族其他成員同樣在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要調(diào)控作用。其中，AGAMOUSlike (8AGL8)基因是AP1/SQUA-like亞家族的A類花器官特性基因，也稱為FUL，研究表明：該基因主要調(diào)控花器官發(fā)育，也能調(diào)控分裂組織分化、胚胎發(fā)育、促進(jìn)根形成以及調(diào)控種子和果實(shí)發(fā)育等[12-13]。在擬南芥中，過(guò)表達(dá)同源的桃樹PpMADS6、大豆GmAGL8基因會(huì)出現(xiàn)花期提前、單花器官增多和果莢成熟提前等表型[14-15]。茶樹[Camellia sinensis(L.) O.Kuntze]作為一種葉用經(jīng)濟(jì)作物，休眠期長(zhǎng)短及休眠解除時(shí)間直接影響其經(jīng)濟(jì)效益。峨眉問(wèn)春(Emei Wenchun，EW)是近年來(lái)新選育的特早生茶樹品種，在四川地區(qū)的種植面積較廣，但其特早生、冬季短休眠性狀的分子遺傳機(jī)制尚不清楚。課題組前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了1 個(gè)可能與EW 冬季休眠相關(guān)的基因(編號(hào)PB7211.1)，該基因在茶樹越冬休眠芽中的表達(dá)量顯著高于春季萌發(fā)芽，且在特早生品種中的表達(dá)量顯著低于常規(guī)品種[16]。根據(jù)與擬南芥蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，將該基因暫命名為CsAGL8。本研究通過(guò)分子克隆得到CsAGL8基因全長(zhǎng)序列，并利用生物信息學(xué)、基因表達(dá)及遺傳轉(zhuǎn)化等手段初步揭示其基因功能，以期為研究茶樹冬季芽休眠的分子調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為5 年生的特早生茶樹EW (比福鼎大白茶萌芽早20～30 d)[17-18]和對(duì)照品種川茶2 號(hào)(Chuancha2，CC2，比福鼎大白茶萌芽早2～4 d[19])。于2020 年11 月21 日—2021 年2 月22 日，在四川沐川一枝春基地(N28.55°，E103.58°)，每隔約15 d 采集腋芽和幼嫩葉(從上往下的1、2 葉)；于2021 年11 月下旬在四川雅安名山茶樹良種繁育 場(chǎng)(N30.21°，E103.21°)，從5 年 生EW 上 取8 個(gè)組織樣品(根、莖、花、花苞、頂芽、嫩葉、成熟葉和老葉)，液氮速凍后置于—80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。CsAGL8的克隆材料還包括龍井43 (Longjin43，LJ43)的休眠芽；轉(zhuǎn)基因材料為哥倫比亞野生型擬南芥(Co1-0)，在23 ℃、12 h光照/12 h 黑暗、相對(duì)濕度60%下培養(yǎng)。

1.2 CsAGL8 的克隆

以EW、CC2 和LJ43 的休眠芽為材料，采用EASYspin PLUS 多糖多酚復(fù)雜植物RNA 提取試劑盒(RN53，北京Aidlab)提取總RNA；用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸蛋白檢測(cè)儀(analytikjena，德國(guó))檢測(cè)RNA 完整性和濃度；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix Fastking (KR118-02，北京天根)合成cDNA。

以課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的CsAGL8預(yù)測(cè)ORF 序列為模板，設(shè)計(jì)特異引物(表1)，按照2×High Fidelity Master Mix (I5 HM-OEM，北京擎科)說(shuō)明書進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并用DNA 純化回收試劑盒(DP214-02，北京天根)進(jìn)行提純回收。連接pMDTM19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性單克隆菌液，送至擎科生物科技有限公司測(cè)序。

表1 用于基因克隆和實(shí)時(shí)熒光定量的引物序列Tab.1 Primer sequences used for the gene cloning and qRT-PCR

1.3 CsAGL8 的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 10.0 預(yù)測(cè)基因編碼的氨基酸序列；利用Expasy-protparam (https://web.expasy.org/protparam/)分析編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；利用ExPASy-ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)疏水性/親水性；利用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)；利用SignalP-6.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；利用SoftBerry ProtComp (https://www.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；利用ExPASy-PROSITE(https://prosite.expasy.org/)和NCBI 的CDD 保守域數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cg)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)。

從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TeaPGDB V1.0[20](http://eplant.njau.edu.cn/tea/)下載黃旦(HD)、龍井43(LJ43)、野生大毫(DASZ)和舒茶早(SCZ)等茶樹品種或資源的CDS、GFF 和Genome 序列，從TAIR 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥的相關(guān)序列，利用TBtools 提取CsAGL8在不同茶樹品種中的cDNA 和基因序列；通過(guò)本地BLAST，再利用DNAMAN 10.0進(jìn)行序列比對(duì)和多態(tài)性分析；利用MEME (http://meme-suite.org/)預(yù)測(cè)保守基序；利用PlantCARE (http://webtools/plantcare/html/)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子順式元件；按照序列相似程度，選取18 個(gè)其他物種的AGL、SVP以及FLC 等Ⅱ型MADs-box 蛋白，利用MEGA 11.0 以鄰接法(Bootstrap 設(shè)為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 CsAGL8 的表達(dá)分析

分別提取茶樹EW 和CC2 在不同越冬期和不同組織中的RNA 樣品，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR 檢測(cè)CsAGL8在不同樣品中的表達(dá)量。操作方法按照2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaqplus (with Tli RNaseH)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，熒光定量引物見(jiàn)表1。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。使用2—ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化

將CsAGL8的CDS 與載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選鑒定并測(cè)序，獲得重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體(35S：CsAGL8-pCAMBIA1302)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，PCR 鑒定后獲得陽(yáng)性農(nóng)桿菌。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法進(jìn)行擬南芥的轉(zhuǎn)化。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株表型觀測(cè)及開花相關(guān)基因的分析

對(duì)篩選得到的T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系進(jìn)行表型分析。篩選出與擬南芥開花相關(guān)的FLC、SOC、FT、CO和FD等基因[21]，采用qRT-PCR 對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)。引物見(jiàn)表1，方法同1.4 節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsAGL8 的克隆及序列

以EW 休眠頂芽為模板，PCR 擴(kuò)增后獲得1 條約800 bp 的電泳條帶(圖1a)。測(cè)序分析結(jié)果表明該基因的CDS 序列長(zhǎng)度為720 bp，編碼239 個(gè)氨基酸(圖1b)，命名為CsAGL8。

圖1 CsAGL8 的克隆(a)、氨基酸序列(b)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和CDD 保守域(d)Fig.1 Gene cloning (a),amino acid sequence (b),tertiary structure (c) and conserved domain of CDD (d) of CsAGL8

CsAGL8 蛋白分子式為C1177H1912N354O377S13，理論分子質(zhì)量為27.47 ku，等電點(diǎn)為6.67。富含谷氨酰胺(Gln，9.6%)、亮氨酸(Leu，9.6%)和谷氨酸(Glu，9.2%)；正電荷殘基(Arg+Lys) 34 個(gè)，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu) 35 個(gè)。脂肪系數(shù)為74.64，不穩(wěn)定指數(shù)為48.30，總平均親水性值為—0.805，是親水不穩(wěn)定蛋白。TMHMM Server v.2.0 推測(cè)該蛋白不是跨膜蛋白。SignalP-6.0 預(yù)測(cè)顯示該蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽，不是分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)該蛋白可能位于細(xì)胞核中。

CsAGL8 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α 螺旋(54.39%)、無(wú)規(guī)則卷曲(26.78%)和β 折疊(4.18%)構(gòu)成。預(yù)測(cè)該蛋白三維立體結(jié)構(gòu)(圖1c)，以擬南芥MADS 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子SEPALLATA 3 為模板[22]，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相符。ExPASy-PROSITE保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示：CsAGL8 包含2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為位于1～61 位的MAD-BOX 2 (PS50066)和位于86～176 位的K-BOX (PS51297)，NCBI 的CDD 保守域預(yù)測(cè)結(jié)果(圖1d)也顯示在1～154 位包含MADS-MEF 2 結(jié)構(gòu)域和K-box 結(jié)構(gòu)域。

2.2 CsAGL8 基因在不同茶樹品種間的多態(tài)性

EW 的CsAGL8基因序列與茶樹品種HD、DASZ 和LJ43 的CDS 文庫(kù)有高度相似序列，其中與HD 的GWHTAZTZ003949 序列完全一致；與DASZ 的GWHTABKB017500 一致性高達(dá)98.89%；與LJ43 的GWHTACFB015156 一致性為91.60%，變異主要為L(zhǎng)J43 在187～240 位增加了54 bp 的序列。同時(shí)克隆得到LJ43 和CC2 序列的CsAGL8序列，它們與EW 的序列一致性高達(dá)98.94%，僅存在5 個(gè)單堿基替換和2 個(gè)三堿基缺失(圖2a)。

圖2 CsAGL8 的多態(tài)性和基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Polymorphism and gene structure analysis of CsAGL8

不同茶樹品種的CsAGL8共具有10 個(gè)保守基序，分布于整個(gè)序列的不同位點(diǎn)(圖2b)；不同品種的保守基序分布情況相對(duì)保守，變化程度較小。根據(jù)4 個(gè)茶樹品種的CsAGL8全長(zhǎng)序列，繪制基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果(圖2c)顯示：CsAGL8基因在茶樹品種DASZ、HD 和LJ43 上的外顯子數(shù)量為7～8，內(nèi)含子數(shù)量為6～7，基因全長(zhǎng)、外顯子和內(nèi)含子的位置均呈一定的多態(tài)性。

2.3 不同物種同源性與系統(tǒng)進(jìn)化

經(jīng)比對(duì)，CsAGL8與擬南芥AtAGL8(AT5G-60910.1)的相似度最高(32%)。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示：不同植物來(lái)源的MADs-box基因在氨基酸組成上存在不同程度的差異，但在1～75 位氨基酸上相對(duì)保守。EW 的CsAGL8基因與茶樹SCZ的CAULIFLOWER A-like 蛋白(XP_028107381.1)、印度茶樹品種Teenali 的MADs-box 蛋白(AFO10-123.1)等聚在同一分支；與已報(bào)道茶樹LJ43 的CsMADs-box1、CsMADs-box2 以及黃金芽的CsDAM2相似度為23%～24%；與中華獼猴桃AGL 蛋白(PSS30323.1)、松下蘭FLC 蛋白(AQM52294.1、AQM52293.1)、杜鵑(KAF7129901.1、KAF71358-24.1)、常綠葉菊(KAH7852335.1)等MADs-box蛋白的相似度均高于65%。

圖3 CsAGL8 在不同植物的系統(tǒng)進(jìn)化分析 (a)與同源氨基酸序列對(duì)比 (b)Fig.3 Phylogenetic analysis (a) and homologous amino acid sequence alignment (b) of CsAGL8 in different plants

2.4 啟動(dòng)子順式作用元件

提取起始密碼子前2 000 bp 序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式元件功能分析，結(jié)果(圖4)顯示：CsAGL8的啟動(dòng)子區(qū)含有光響應(yīng)、激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)等相關(guān)元件。光響應(yīng)元件主要是Box 4、G-box、TCT-motif、Sp1、TCCC-motif 和GATA-motif 等；激素響應(yīng)元件為ABRE (脫落酸響應(yīng))、CGTCAmotif 和TGACG-motif (茉莉酸甲酯響應(yīng))、TGAelement (生長(zhǎng)素響應(yīng))及TCA-element (水楊酸響應(yīng))等；脅迫響應(yīng)元件則包含ARE (厭氧誘導(dǎo))、MBS (干旱誘導(dǎo))、LTR (低溫響應(yīng))和CCAATbox (MYB 結(jié)合位點(diǎn))等。

圖4 CsAGL8 基因啟動(dòng)子順式元件結(jié)構(gòu)Fig.4 CsAGL8 gene promoter cis-element structure

2.5 CsAGL8 的表達(dá)特性

2.5.1CsAGL8在不同組織的表達(dá)特性

qRT-PCR 結(jié)果(圖5)表明：CsAGL8在EW和CC2 各組織中均有表達(dá)，頂芽中的表達(dá)水平顯著高于其他組織部位；在EW 和CC2 的花苞以及和CC2 的花中表達(dá)量最低。

2.5.2CsAGL8在茶樹越冬過(guò)程中的表達(dá)特性

不同越冬時(shí)期，CsAGL8在 EW 葉片中的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，于1 月8 日達(dá)到最大值；在CC2 葉片中則呈升高—降低—升高—降低的趨勢(shì) (圖6a)。在整個(gè)越冬期間，EW芽的CsAGL8相對(duì)表達(dá)量明顯低于CC2，一直維持在相對(duì)較低的水平，且表達(dá)量下降的時(shí)間比CC2 早約15 d (圖6b)。

圖6 CsAGL8 基因在茶樹葉(a)和芽(b)越冬過(guò)程中的表達(dá)Fig.6 Expression of CsAGL8 gene during overwintering of tea plant leaves (a) and buds (b)

2.5.3在擬南芥中異源過(guò)表達(dá)后的功能

由圖7 可知：2 個(gè)過(guò)表達(dá)CsAGL8的轉(zhuǎn)基因株系提前開花10～15 d。轉(zhuǎn)基因擬南芥中FT的相對(duì)表達(dá)量顯著低于野生型，SOC的表達(dá)量無(wú)差異，其余擬南芥開花相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯的變化規(guī)律。

圖7 CsAGL8 異源轉(zhuǎn)化擬南芥表達(dá)分析Fig.7 Overexpression analysis of CsAGL8 in Arabidopsis

3 討論

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育和休眠調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[23]。本研究從茶樹EW 休眠芽中克隆得到1 個(gè)新的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因CsAGL8，它與已報(bào)道可能調(diào)控茶樹冬季休眠的同一家族轉(zhuǎn)錄因子CsMADs-box1、CsMADsbox2和CsDAM2的相似度僅為23%～24%[24-26]?；谝寻l(fā)布的多個(gè)茶樹全基因組測(cè)序和注釋結(jié)果，茶樹品種DASZ、HD 和LJ43 中均有與CsAGL8高度相似的CDS 序列，應(yīng)為同一基因位點(diǎn)。序列比對(duì)在CsAGL8的編碼區(qū)共檢測(cè)到8 個(gè)變異位點(diǎn)，包括5 個(gè)單堿基替換、2 個(gè)三堿基缺失和1 個(gè)長(zhǎng)片段插入，這些多態(tài)性可能會(huì)引起CsAGL8的功能差異，使茶樹形成表型差異[26]。

MADS-box家族基因作為芽休眠調(diào)控的核心基因，受光周期、溫度和激素等調(diào)控，能通過(guò)抑制FT或類似基因推遲萌芽，抑制分生組織生長(zhǎng)[9]，如：MdDAMa和MdDAMc調(diào)控蘋果秋季停止生長(zhǎng)，MdDAMb維持芽休眠；過(guò)表達(dá)日本杏Pm-DAM6能推遲轉(zhuǎn)基因蘋果的芽萌發(fā)并減少其側(cè)枝生長(zhǎng)等[7-11]；郝心愿[24]從茶樹LJ43 中克隆得到CsMADs-box1和CsMADs-box2基因，在楊樹中過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn)CsMADs-box1通過(guò)光周期和溫度信號(hào)通路在休眠及生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本課題組在EW 中發(fā)現(xiàn)CsAGL8與CsMADs-box1基因有相同的組織表達(dá)特性[15]，證實(shí)CsAGL8可能參與茶樹芽生育的調(diào)控。對(duì)多種植物的季節(jié)性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：與休眠相關(guān)的MADS-box基因在生理休眠期表達(dá)量升高，在生態(tài)休眠期和休眠解除時(shí)表達(dá)量降低[11,27-30]。本研究表明：CsAGL8在茶樹越冬過(guò)程中的表達(dá)變化呈現(xiàn)與休眠相關(guān)MADSbox基因相同的趨勢(shì)，在休眠形成和生理休眠階段的表達(dá)量顯著上升，而在休眠解除階段下調(diào)。在整個(gè)越冬期間，特早生茶樹EW 芽中的CsAGL8表達(dá)量都低于CC2，且下調(diào)時(shí)間早于CC2，符合EW 冬季休眠時(shí)間短的特性。這說(shuō)明CsAGL8是調(diào)控茶樹冬季芽休眠的相關(guān)基因，但其調(diào)控的信號(hào)途徑及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需進(jìn)一步研究。

AGL8參與擬南芥的開花進(jìn)程，調(diào)控芽頂端分生組織向花序分生組織的轉(zhuǎn)變，并與SOC1和FT共同表達(dá)誘導(dǎo)花器官發(fā)育，從而調(diào)控開花時(shí)間[31]，前人對(duì)擬南芥中過(guò)表達(dá)桃樹的AGL8同源基因研究[14]也得到了類似結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)CsAGL8的擬南芥開花時(shí)間可提前10～15 d，說(shuō)明CsAGL8作為AGL8的同源基因同樣具有促進(jìn)開花的作用。擬南芥的開花性狀與多年生植物的芽休眠調(diào)控共享部分調(diào)控通路[3]，異源表達(dá)結(jié)果也在一定程度上間接表明CsAGL8參與茶樹的休眠調(diào)控。后續(xù)課題組將研究CsAGL8的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)和靶基因，以進(jìn)一步證實(shí)CsAGL8參與茶樹的休眠調(diào)控，并了解其作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究成功克隆得到1 個(gè)新的茶樹MADSbox轉(zhuǎn)錄因子基因CsAGL8的編碼區(qū)序列，該序列與擬南芥AtAGL8(AT5G60910.1)的相似度最高。越冬期間，CsAGL8基因的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，且在休眠頂芽中的表達(dá)量顯著高于其他組織；該基因在特早生茶樹品種峨眉問(wèn)春芽中的表達(dá)量顯著低于對(duì)照品種川茶2 號(hào)，且下調(diào)時(shí)間也早于對(duì)照品種。過(guò)表達(dá)CsAGL8的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株早花10～15 d。推測(cè)該基因可能調(diào)控茶樹越冬芽的生長(zhǎng)休眠進(jìn)程。