吲哚丁酸對(duì)桃砧木GF677 不定根形成過(guò)程中生理生化指標(biāo)的影響*

張 帆，王 鴻 ，張雪冰，陳建軍

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 林果花卉研究所，甘肅 蘭州 730070)

“十四五”是桃(Prunus persicaL.)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵階段，新老果園將面臨大面積更新，產(chǎn)業(yè)亟需質(zhì)量較高的苗木[1]。桃砧木產(chǎn)業(yè)正在經(jīng)歷由傳統(tǒng)實(shí)生砧木向自根砧的變革[2]。中國(guó)長(zhǎng)期使用實(shí)生砧木，盡管嫁接育苗價(jià)格低廉，但存在易使后代發(fā)生變異、性狀分離、形成的新群體在遺傳上具有不穩(wěn)定性、苗木整齊度差和果品商品性低等問(wèn)題[1]，因此，實(shí)生砧木已不能滿足市場(chǎng)需求。無(wú)性系砧木不但可以克服實(shí)生嫁接苗生理年齡小、掛果遲的缺陷，而且樹(shù)體一致性強(qiáng)，果實(shí)商品性高，是發(fā)達(dá)國(guó)家主要的生產(chǎn)模式，也是中國(guó)桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)[3]。在歐洲國(guó)家，桃育苗已用無(wú)性系砧木代替實(shí)生砧木，在組培和扦插等無(wú)性繁殖技術(shù)方面取得了一定的進(jìn)展[2]。盡管?chē)?guó)外桃砧木組培快繁技術(shù)較為成熟，但國(guó)內(nèi)還沒(méi)有桃砧木無(wú)性繁殖生產(chǎn)技術(shù)體系，故尚未推廣普及；加之桃屬無(wú)性系繁育中較難生根的樹(shù)種之一，使桃砧木無(wú)性繁育技術(shù)發(fā)展受到限制，嚴(yán)重影響了桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，減慢了中國(guó)優(yōu)良桃砧木成為商品推廣應(yīng)用的進(jìn)程。桃砧木無(wú)性繁育技術(shù)研發(fā)是目前桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的重要問(wèn)題之一，因此，明確影響桃無(wú)性系砧木繁育不定根的關(guān)鍵因素，解決桃砧木無(wú)性繁殖生根率極低這一重大科學(xué)問(wèn)題，對(duì)現(xiàn)代可持續(xù)果業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。

不定根屬莖源根系，其形成受諸多因素影響，如激素、扦插環(huán)境和插穗性狀等。不定根從根原基發(fā)生、分化、發(fā)育、生根成活，其過(guò)程長(zhǎng)且復(fù)雜[1-2]。已有研究明確了扦插不定根形成受植物遺傳物質(zhì)、插條生理狀況和木質(zhì)化程度、扦插時(shí)間、環(huán)境、基質(zhì)及外源激素等綜合因素的影響[4]，但對(duì)桃無(wú)性系砧木 GF677 激素誘導(dǎo)不定根形成過(guò)程中生理生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道。本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以桃無(wú)性系砧木GF677 綠枝為試材進(jìn)行扦插試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)比分析吲哚丁酸(3-indole butyric acid，IBA)處理插穗生根過(guò)程中生理生化指標(biāo)的變化，進(jìn)而解決不定根發(fā)生困難的普遍問(wèn)題，對(duì)于提高桃優(yōu)良砧木品種的快速繁殖技術(shù)、加速不定根發(fā)生能力的遺傳改良和促進(jìn)桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022 年7 月中旬在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行。選取無(wú)病蟲(chóng)害的桃無(wú)性系砧木GF677 當(dāng)年生中部和中上部枝條(直徑0.5～1.0 cm)制成15～20 cm 的插穗，保留 3～5 個(gè)半葉，用裁紙刀在基部靠近基芽處削成40°～45°斜面，沿斜面向上削去長(zhǎng)1.5 cm 的韌皮，頂端削平。選擇透氣性和疏松性都較好的大顆粒珍珠巖，使用前用800 倍80% 代森錳鋅滅菌，裝至規(guī)格為50 穴、深 8 cm 的扦插育苗穴盤(pán)中。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)設(shè)置5 個(gè)處理，分別為清水對(duì)照(CK)、200 mg/L IBA (T1)、500 mg/L IBA (T2)、800 mg/L IBA (T3)和1 100 mg/L IBA (T4)。將削好的插穗基部用不同質(zhì)量濃度IBA 蘸根10 s，放置1 min后再速蘸5 s；扦插至育苗穴盤(pán)中，深度為3～5 cm。扦插完成后使用全光彌霧系統(tǒng)(2.2 kW、380 V 進(jìn)口ABB 電機(jī)直連原裝進(jìn)口英特泵12 L 流量帶時(shí)間控制器，浙江溫州)及時(shí)進(jìn)行霧化，霧化時(shí)間為15 s/3 min，配合葉面感應(yīng)器(濕度+溫度，RS458輸出，江蘇常州)，使插穗葉面始終保持濕潤(rùn)狀。

1.3 生根效果的觀察和測(cè)定

扦插后定期觀察插條變化，每隔7 d 取樣觀察愈傷形成情況；35 d 時(shí)(移栽前)調(diào)查生根指標(biāo)，每次取樣100 個(gè)插穗，用水沖洗干凈，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)量和生根率，測(cè)量不定根長(zhǎng)度，重復(fù)3 次，取平均值。按公式計(jì)算根系效果指數(shù)：根系效果指數(shù)=平均根長(zhǎng)×生根數(shù)量×生根率/生根插穗數(shù)。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定

扦插前第 1 次采樣，扦插后每隔7 d 取樣 1次，試驗(yàn)至28 d 最后1 次取樣，試驗(yàn)期間共采樣4 次，每次取樣后迅速剝?nèi)〔逅牖? cm 范圍內(nèi)的皮層，混合后分為 9 組。其中3 組用液氮冷凍后于—20 ℃ 低溫冰箱保存，參考王小玲等[5]的方法，對(duì)吲哚乙酸氧化酶(indoleacetic acid oxidase，IAAO)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活性進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理重復(fù)3 次。另外3 組用自來(lái)水沖洗，再用去離子水沖洗3 遍，整個(gè)洗滌時(shí)間不超過(guò) 3 min；準(zhǔn)確稱取樣品50.0 g 陰干，參考盧楠等[6]的方法測(cè)定全氮(total nitrogen，TN)、全磷(total phosphorus，TP)和全鉀(total potassium，TK)含量，每處理重復(fù)3 次。最后3 組插穗皮層用于測(cè)定內(nèi)源激素生長(zhǎng)素吲哚乙酸(indole acetic acid，IAA)、細(xì)胞分裂素(cytokinin，CTK)和乙烯(ethylene，ETH)含量，每處理放入預(yù)冷研缽中，加入少許石英砂，加入提取液1 mL，冰浴研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL 離心管中，再用提取液4 mL 分2 次沖洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃ 冰箱保存3 h 以上備用[6]；再采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定各激素含量，試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供，每處理重復(fù)3 次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用WPS 2019 和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)；采用LSD 法比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生根效果

不同質(zhì)量濃度IBA 誘導(dǎo)無(wú)性系砧木 GF677扦插的生根效果存在差異。誘導(dǎo)期(0～7 d)，插穗保持鮮活狀態(tài)，大部分切口處未發(fā)生明顯變化，部分韌皮部開(kāi)始膨大；愈傷形成期(7～14 d)，切口處愈傷組織發(fā)生分化，愈傷組織形成；不定根形成期(14～21 d)，插穗葉片普遍色澤暗淡，部分有新葉長(zhǎng)出，切口處愈傷組織增多，并開(kāi)始有根尖露出；21 d 后，生出大量不定根，且生根類(lèi)型以愈傷組織生根為主，極少有皮部生根；28 d后，切口開(kāi)始大量生根，平均生根率達(dá)到36.48%(圖1)。50 d 的調(diào)查結(jié)果顯示：T1處理生根率達(dá)94.63%，平均根長(zhǎng)、最大根長(zhǎng)和根系效果指數(shù)均顯著大于其他處理(表1)。

表1 不同處理對(duì)插穗生根的影響Tab.1 Effects of different treatments on the rooting of cuttings

圖1 GF677 扦插的生根效果Fig.1 Rooting effect of GF677 cuttings

2.2 營(yíng)養(yǎng)成分動(dòng)態(tài)變化

由圖2 可知：GF677 扦插不定根的形成過(guò)程中，插穗全氮含量呈下降趨勢(shì)，4 個(gè)IBA 處理的降幅均大于CK，且下降幅度與IBA 質(zhì)量濃度呈反比，T1處理的下降幅度最大。插穗全磷和全鉀含量的變化趨勢(shì)與全氮一致。

圖2 GF677 不定根形成過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分變化Fig.2 Changes of nutrient components during the formation of GF677 adventitious root

2.3 激素動(dòng)態(tài)變化

GF677 扦插中，插穗激素在不同不定根形成時(shí)期的變化不盡相同(圖3)。隨著GF677 不定根發(fā)生至延長(zhǎng)，IAA 含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，21 d 時(shí)出現(xiàn)峰值，且T1處理峰值最大、CK 處理最小，28 d 時(shí)降至最低值，且以T1處理下降幅度最大。CTK 含量的變化趨勢(shì)與 IAA 不同，呈逐漸下降的趨勢(shì)，且T1處理較其他處理降幅大，CK 處理的降幅最小。在不定根形成和伸長(zhǎng)期，ETH 含量的變化與IAA 和CTK 含量的變化相反，呈緩慢上升趨勢(shì)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最大值，不同時(shí)期T1處理的值小于其他處理，且變幅最小。

圖3 GF677 扦插不定根形成過(guò)程中插穗激素變化Fig.3 Hormonal changes during cutting of adventitious roots formation of GF677

2.4 氧化酶活性動(dòng)態(tài)變化

由圖4 可知：經(jīng)激素誘導(dǎo)，插穗PPO 活性呈先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，21 d 時(shí)出現(xiàn)峰值，而CK 處理在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中變幅不大，處理間PPO活性從大到小為T(mén)1＞T2＞T3＞T4＞CK；插穗POD 活性也呈先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，21 d 時(shí)出現(xiàn)峰值，且T1處理的變幅最大，28 d 后各處理間差異不顯著(P＞0.05)；IAAO 活性也呈先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，除CK 處理外，其他處理均在21 d 達(dá)到峰值，且T1處理變幅最大。

圖4 GF677 扦插不定根形成過(guò)程中插穗氧化酶活性變化Fig.4 Changes of oxidase activity during cutting of adventitious root formation of GF677

2.5 扦插生根指標(biāo)間的相關(guān)性

由表2 可知：GF677 扦插生根指標(biāo)之間呈線性關(guān)系。插穗TN 與TP、TK、CTK 呈極顯著正相關(guān)，此外，TN 還與除愈傷率外的其他指標(biāo)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；TP 與TK、CTK、ETH 呈極顯著正相關(guān)，與其他指標(biāo)呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；TK 與CTK 呈顯著正相關(guān)，與ETH、PPO、POD、生根率呈極顯著負(fù)相關(guān)，與IAAO 呈顯著負(fù)相關(guān)；IAA 與各氧化酶活性、生根率呈極顯著正相關(guān)，與CTK 和ETH 呈顯著負(fù)相關(guān)；CTK與ETH 呈極顯著正相關(guān)，與PPO、生根率呈極顯著負(fù)相關(guān)；ETH 與平均根長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)；PPO 與POD、IAAO、生根率呈極顯著正相關(guān)；POD 與IAAO、愈傷率呈極顯著正相關(guān)；IAAO與生根率呈極顯著正相關(guān)；愈傷率與生根數(shù)、生根率、平均根長(zhǎng)、根系效果指數(shù)呈極顯著正相關(guān)。說(shuō)明桃無(wú)性系砧木GF677 屬愈傷組織生根。

表2 GF677 扦插生根指標(biāo)間的相關(guān)性Tab.2 Correlation analysis among rooting indexes of GF677 cuttings

3 討論

3.1 激素與不定根的關(guān)系

內(nèi)源激素IAA、CTK 和ETH 在桃無(wú)性系砧木GF677 不定根形成過(guò)程中具有重要作用。本研究中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度外源激素IBA 誘導(dǎo)，GF677插穗不定根形成過(guò)程中處理組IAA 含量逐漸升高，可能是由于IBA 刺激了插穗基部形成層細(xì)胞的活性，形成層細(xì)胞產(chǎn)生大量IAA，促進(jìn)韌皮產(chǎn)生大量愈傷組織，進(jìn)一步形成根原基；若IAA 含量無(wú)變化或較低，則只能形成愈傷組織，不能誘導(dǎo)不定根的形成，這一結(jié)果與敖紅等[7]的研究一致。待不定根延長(zhǎng)時(shí)，IAA 含量呈下降趨勢(shì)，分析其原因可能是IAA 在插穗愈傷組織和根原基形成過(guò)程中逐漸被氧化，不定根形成后含量逐漸減少。因此，推測(cè)IBA 誘導(dǎo)插條后不易被分解，但能刺激根原基生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞的活性繼而產(chǎn)生IAA。有研究表明：較低濃度的CTK 有利于不定根分化[8]，且根原基誘導(dǎo)初期CTK 含量下降[9]，不定根形成后CTK 含量增加[10]；而較高濃度的CTK有利于插穗不定根原基的誘導(dǎo)，促進(jìn)愈傷組織形成以及不定根的伸長(zhǎng)和生長(zhǎng)[11]。本研究中，桃砧木插穗在不定根誘導(dǎo)期和形成期CTK 含量呈下降趨勢(shì)，這可能與植物種類(lèi)差異有關(guān)，其機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。ETH 在植物IAA 含量較高時(shí)會(huì)隨之大量產(chǎn)生。有研究認(rèn)為：ETH 可抑制不定根的形成[12]，且生根數(shù)量與ETH 釋放量成正比，但與不定根的形成無(wú)關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)：ETH 含量隨扦插時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢上升，且不同處理的生根率有所差異，可能是高濃度的ETH改變了IAA 運(yùn)輸和代謝，從而影響IAA 對(duì)不定根形成的誘導(dǎo)效應(yīng)，ETH 僅是間接影響了不定根的形成，它與不定根的形成無(wú)直接關(guān)系。

3.2 氧化酶活性與不定根的關(guān)系

氧化酶可影響插穗不定根的發(fā)生[1]。PPO 可通過(guò)酚類(lèi)化合物的氧化作用影響不定根形成，與插穗不定根的發(fā)生密切相關(guān)[2]。研究表明PPO 對(duì)不定根的形成具有雙重作用[12]。TAHIR 等[13]研究認(rèn)為：PPO 活性與根原基形成極顯著相關(guān)；尚文倩等[14]研究發(fā)現(xiàn)：扦插后，插穗的PPO 活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)扦插生根過(guò)程中PPO 活性呈逐漸上升趨勢(shì)[15]。曹幫華等[16]研究發(fā)現(xiàn)：桑樹(shù)插穗的PPO 活性與不定根密切相關(guān)，不易生根的插穗中PPO 保持較低水平，影響不定根形成，分析其原因可能是插穗中PPO 與酚類(lèi)形成醌類(lèi)，導(dǎo)致插穗褐變，從而抑制不定根的發(fā)生。本研究中，在不定根誘導(dǎo)期和形成期，桃砧木GF677 插穗的PPO 活性成增加趨勢(shì)，在不定根延長(zhǎng)期呈下降趨勢(shì)，與前人研究結(jié)果基本一致。BRITO 等[17]認(rèn)為插穗POD 活性與不定根關(guān)系密切。研究表明：在長(zhǎng)柄扁桃嫩枝扦插的插穗生根過(guò)程中，POD 活性在不定根的誘導(dǎo)期和表達(dá)期有2 個(gè)活性高峰[13]；也有研究認(rèn)為：難以生根的樹(shù)種可能與扦插發(fā)生不定根時(shí)期的低POD 活性有關(guān)[18]。本研究表明：在不定根誘導(dǎo)期和形成期，桃砧木GF677 插穗的POD 活性成增加趨勢(shì)，在不定根延長(zhǎng)期呈下降趨勢(shì)，這與前人研究結(jié)果相似。研究發(fā)現(xiàn)：不易生根的插穗中具有較高的IAAO 活性，導(dǎo)致更多的IAA 被降解，不利于生根[2]。曹幫華等[16]研究發(fā)現(xiàn)：插穗IAAO 活性越高，生根率越低。顏廷武等[19]研究發(fā)現(xiàn)：插穗愈傷組織形成階段，IAAO 活性逐漸升高；但I(xiàn)AAO 活性在不定根的誘導(dǎo)和表達(dá)期間下降，可促進(jìn)插穗不定根的誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)。本研究中，無(wú)性系砧木GF677 屬難生根樹(shù)種，經(jīng)IBA 誘導(dǎo)，插穗不定根誘導(dǎo)期和形成期IAAO 活性保持較低水平，有利于插穗愈傷形成和不定根表達(dá)；隨著插穗時(shí)間的延長(zhǎng)，IAAO 活性在不定根形成期出現(xiàn)峰值，即不定根伸長(zhǎng)期需要較高的IAAO 氧化過(guò)多IAA，使IAA 含量降低，促進(jìn)不定根伸長(zhǎng)。

3.3 營(yíng)養(yǎng)成分與不定根的關(guān)系

LAKEHAL 等[10]認(rèn)為插穗生根需要消耗大量營(yíng)養(yǎng)成分和能量，特別是插穗生根和生長(zhǎng)所必需的碳水化合物和氮素。已有研究認(rèn)為：插穗TN含量與生根率呈正比，而與TP 含量成反比[7]；外源激素處理能夠促進(jìn)插穗TN 的再分配[20]。本研究中，隨著不定根的形成，插穗 TN、TP 和TK 含量均呈下降趨勢(shì)，且與生根率呈極顯著負(fù)相關(guān)，與MURTHY 等[21]的研究結(jié)果一致。此外，TK 有助于貯藏物質(zhì)的活化移動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞和器官主動(dòng)吸水，為插穗不定根的孕育提供能量物質(zhì)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)，有利于不定根形成[21-22]。

4 結(jié)論

扦插不定根的發(fā)生涉及外源信號(hào)感知與內(nèi)外信號(hào)級(jí)聯(lián)耦合，屬極其復(fù)雜的非根器官發(fā)生過(guò)程。200 mg/L IBA 處理可顯著提高桃插穗的酶活性，加速I(mǎi)AA 合成，通過(guò)調(diào)節(jié)插穗氧化酶和內(nèi)源激素水平促進(jìn)不定根的形成。