青貯巨菌草乳酸菌的分離鑒定及其對蠶豆秸稈青貯發(fā)酵的效果*

廖雋銳，劉韶娜，霍金龍，楊福華,，李新榮，常雅潔，趙智勇**

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

青貯涉及復(fù)雜的微生物相互作用，其中乳酸菌在青貯過程中發(fā)揮重要作用[1]，它能酸化牧草并限制和破壞微生物(如霉菌和細(xì)菌)的生長，可最大限度保存飼料營養(yǎng)成分[2]。在眾多微生物添加劑中，乳酸菌添加劑由于其高效生產(chǎn)代謝物的能力及廉價(jià)、環(huán)保的特點(diǎn)，被認(rèn)為是動(dòng)物飼料生產(chǎn)的天然添加劑，廣泛應(yīng)用于牧草發(fā)酵[3]。添加乳酸菌的青貯飼料不僅乳酸含量高于傳統(tǒng)發(fā)酵的青貯飼料，還可有效提高飼料的干物質(zhì)回收率[4]。此外，青貯乳酸桿菌能產(chǎn)生3-羥基癸酸，抑制畢赤酵母、煙曲霉和婁地青霉的生長[5]，可抑制青貯飼料和反芻動(dòng)物瘤胃中的有害微生物，從而提高動(dòng)物的健康性能[6]。但由于青貯發(fā)酵過程中產(chǎn)生的微生物群體較為復(fù)雜，同一種微生物添加劑在不同地區(qū)、原料和氣候的影響下對實(shí)際生產(chǎn)的效果不同，因此根據(jù)具體情況從生產(chǎn)當(dāng)?shù)胤蛛x和篩選優(yōu)質(zhì)乳酸菌用于實(shí)踐對提高青貯品質(zhì)具有重大現(xiàn)實(shí)意義[7]。

青貯飼料具有原料來源廣的特點(diǎn)，因地制宜地選擇青貯飼料原料是降低飼料成本的有效方式[8]。秸稈是成熟農(nóng)作物莖葉(穗)部分的總稱，中國每年秸稈總產(chǎn)量超過7 億t，大部分被就地焚燒[9]。蠶豆秸稈具有較高的營養(yǎng)和飼喂價(jià)值，但目前有關(guān)蠶豆秸稈青貯料及其乳酸菌添加劑處理的研究較少[10]。因此，本研究從巨菌草青貯中分離鑒定具有較強(qiáng)抗菌性能的乳酸菌，并研究其菌株特性，使用優(yōu)勢乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，以期為蠶豆秸稈的發(fā)酵利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

巨菌草青貯產(chǎn)物來自云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院。MRS 培養(yǎng)基購自青島海博生物公司，革蘭氏染色試劑盒購自北京蘭杰柯公司；藥敏片購自杭州濱和公司；ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司。

1.2 方法

1.2.1乳酸菌的分離純化與保存

取青貯樣品5 g 與MRS 培養(yǎng)液100 mL 混勻，菌液接種至MRS 培養(yǎng)基，挑選單菌落接種培養(yǎng)，反復(fù)挑斑、劃板，直至在平板上形成單一純菌株，編號(hào)后貯存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2乳酸菌的鑒定

菌液接種至MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再接種到相應(yīng)液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)，之后進(jìn)行革蘭氏染色。待測菌接種到MRS 培養(yǎng)液30 ℃培養(yǎng)24 h，提取總DNA，采用細(xì)菌16S rDNA 通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R (5′-TAGGGTTACC-TTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR，產(chǎn)物送至昆明擎科有限公司測序。

1.2.3生長曲線和產(chǎn)酸特性的測定

按照1∶1 000 (體積比)將R-01 接種到MRS培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h 測定600 nm處的吸光度值(OD600)和pH 值，繪制生長曲線及產(chǎn)酸曲線。

1.2.4乳酸菌抑菌能力的測定

以金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coil)和鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)為指示菌配制105CFU/mL的4 mm 直徑孔平板，加入菌液5 μL，30 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.5抗生素敏感性的測定

將待測菌加入40 ℃的MRS 培養(yǎng)基中，接種量1%，搖勻后倒平板。將卡那霉素、慶大霉素和青霉素藥敏片貼至培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)24 h，使用電子游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，通過CLSI 指南確定其抗生素敏感性[11]。

1.2.6發(fā)酵試驗(yàn)

將蠶豆秸稈和磨碎米糠按照3∶1 (質(zhì)量比)混合，向其中加入R-01 菌液(1 mL/kg)作為試驗(yàn)組，對照組加入同體積無菌水。混勻后各組分裝3 份作為平行試驗(yàn)組，抽真空發(fā)酵35 d。發(fā)酵完成后每個(gè)平行組分別取1 個(gè)樣品，測定pH 值，根據(jù)《青貯飼料質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)》[12]進(jìn)行感官評價(jià)，并測定含水率以及中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、干物質(zhì)、粗灰分、粗蛋白、粗纖維和粗脂肪含量。

1.2.7飼料霉菌毒素含量的測定

使用ELISA 試劑盒構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定青貯飼料中嘔吐毒素、T2 毒素和黃曲霉毒素的含量。

1.2.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較用t-檢驗(yàn)，多組間比較用one-way ANOVA 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

從巨菌草青貯中分離出7 株可以抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的菌株，利用凝膠打孔法對7 株菌進(jìn)行對比，篩選出1 株抑菌圈直徑最大、透明度高的菌株，命名為R-01(圖1)。

圖1 乳酸菌對3 種病原菌的拮抗能力分析Fig.1 Analysis of antagonistic ability of lactic acid bacteria against three pathogens

2.2 菌落形態(tài)學(xué)特征

R-01 在MRS 培養(yǎng)基上生長時(shí)呈典型的乳酸菌特征：乳白色、圓形、凸起，革蘭氏陽性；單菌落鏡檢呈桿狀、單生或多個(gè)串生(圖2)。

圖2 菌落形態(tài)特征(a)和革蘭氏染色結(jié)果(b)Fig.2 Morphological characteristic (a) and Gram staining result (b)

2.3 菌種鑒定結(jié)果

經(jīng)測序和比對，R-01 與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) KJ026699.1、KX078316.1、ON-254155.1、AB904768.1、MT613642.1、MT61170-2.1、MT604643.1 和MT538617.1 的同源性高達(dá)100% (圖3 和圖4)。綜合形態(tài)學(xué)特征及染色結(jié)果，將R-01 鑒定為植物乳桿菌，命名為L.plantarumR-01，并獲得其GenBank 登錄號(hào)為OP-459306。

圖3 植物乳桿菌R-01 的16S rRNA 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequence of Lactobacillus plantarum R-01

圖4 植物乳桿菌R-01 的同源性比較Fig.4 Homology comparison of L. plantarum R-01

2.4 生長和產(chǎn)酸曲線

由圖5 可知：R-01 生長停滯期很短，0～2 h生長速度較緩慢，2 h 后進(jìn)入對數(shù)期，14 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后略有降低，但基本保持一致；隨著時(shí)間推移，R-01 的pH 值呈下降趨勢，18 h 達(dá)到最低值(3.6)，隨后略有浮動(dòng)，但基本保持一致。

圖5 植物乳桿菌R-01 的生長和產(chǎn)酸曲線Fig.5 Curve of growth and acid producing of L. plantarum R-01

2.5 乳酸菌對抗生素的敏感性

R-01 對青霉素產(chǎn)生的抑菌圈直徑為(4.40±0.16) mm，對卡那霉素和慶大霉素產(chǎn)生的抑菌圈直徑均為(0±0) mm。根據(jù)CLSI 耐藥性指南[11]的判斷標(biāo)準(zhǔn)(抑菌圈≤14 mm 即為具有耐藥性)，R-01 對上述3 種抗生素均具有耐藥性。

2.6 乳酸菌對蠶豆秸稈的發(fā)酵能力

由表1 可知：與對照組相比，試驗(yàn)組的pH值極顯著降低(P＜0.01)，粗蛋白含量顯著降低(P＜0.05)，粗纖維含量顯著增加(P＜0.05)，粗脂肪含量極顯著增加(P＜0.01)。青貯感官評價(jià)結(jié)果顯示：添加R-01 發(fā)酵后，蠶豆秸稈呈黃綠色，芳香酸味；對照組蠶豆秸稈呈黃褐色，有輕微刺鼻酸味；兩者的莖葉結(jié)構(gòu)均保持良好；試驗(yàn)組的等級優(yōu)于對照組。

表1 化學(xué)成分分析Tab.1 Chemical composition analysis

2.7 飼料霉菌毒素的含量

通過ELISA 試劑盒構(gòu)建的嘔吐毒素、黃曲霉毒素和T2 毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2分別為0.999、0.987和1.000。使用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出飼料中3 種霉菌毒素的含量(表2)均顯著或極顯著低于對照組(P＜0.05 或P＜0.01)。

表2 霉菌毒素含量Tab.2 Mycotoxin content ng/mL

3 討論

3.1 生長和產(chǎn)酸特性

生長速度和產(chǎn)酸能力是評價(jià)乳酸菌在相同條件下利用資源能力的主要參數(shù)，是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo)[13]。MCDONALD 等[14]認(rèn)為乳酸菌添加劑應(yīng)具有生長速度快、產(chǎn)酸量大、能降低pH 值和競爭能力強(qiáng)等優(yōu)勢，可抑制有害微生物生長并提升飼料營養(yǎng)。袁潔等[15]研究表明：生長2～12 h 乳酸菌處于對數(shù)期，最大OD600值小于1.6；YANG 等[16]研究顯示：生長3 h 乳酸菌進(jìn)入對數(shù)期，最大OD600值小于1.1，pH 值大于4.5；徐媛[17]的研究中，乳酸菌生長2～8 h 處于對數(shù)期，pH 值大于4。DAUGHTRY 等[18]和AGUIRREEZKAURIATZA 等[19]研究發(fā)現(xiàn)：乳酸菌生長達(dá)到峰值后，先降低再進(jìn)入穩(wěn)定期。以上研究與本研究結(jié)果相似，但本研究的R-01 具有更短的生長遲滯期、更大的菌液濃度、更強(qiáng)的產(chǎn)酸能力和更快的產(chǎn)生速度，因此，R-01 在作為乳酸菌接種劑方面具有更大潛力。R-01 生長14 h 到達(dá)峰值后，先有一定程度降低再進(jìn)入穩(wěn)定期，這可能是因?yàn)槿樗峋L過程中不斷地發(fā)酵產(chǎn)出乳酸，隨著乳酸濃度增大，pH 值降低，乳酸菌的生長受到抑制；當(dāng)乳酸菌凋亡速度大于乳酸菌生長速度時(shí)，乳酸菌的活菌數(shù)量開始降低。

3.2 抑菌和耐藥特性

已有研究發(fā)現(xiàn)：乳酸菌的拮抗活性與青貯發(fā)酵品質(zhì)相關(guān)[20]，食物鏈?zhǔn)强股啬退幘趧?dòng)物和人類之間傳播的關(guān)鍵途徑之一[21]，拮抗活性和抗生素耐藥性也是篩選乳酸菌的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。研究證明：乳酸菌可抑制金黃色葡萄球菌[22]、大腸桿菌[23]和鼠傷寒沙門氏菌[24]，與本研究結(jié)果一致。本研究中，R-01 對3 種抗生素產(chǎn)生的抑菌圈大于已有研究[22-24]，說明R-01 具有更強(qiáng)的拮抗能力。在耐藥性方面，馮偉等[25]的研究表明大部分乳桿菌對慶大霉素和青霉素敏感；萬倩等[26]的研究結(jié)果顯示乳桿菌對慶大霉素和青霉素敏感，小部分對卡那霉素有耐藥性；陳大衛(wèi)等[27]的耐藥性試驗(yàn)中，所有菌株對卡那霉素耐藥，僅少數(shù)菌株對慶大霉素中等敏感。本研究中，R-01 在青霉素、卡那霉素和慶大霉素下產(chǎn)生的抑菌圈均小于5 mm，表明R-01 具有很好的廣譜抗生素耐藥性。

3.3 發(fā)酵特性

青貯接種劑是近年來反芻動(dòng)物飼料保存研究的熱點(diǎn)之一，目前普遍認(rèn)為優(yōu)質(zhì)的青貯飼料pH 值小于4.2[28]。本研究中，添加R-01 的蠶豆秸稈青貯pH 值降至4.2 以下，發(fā)酵結(jié)果與添加乳酸菌發(fā)酵花生[29]、甘薯藤[30]、玉米[31]、大豆[32]和紫花苜蓿[33]青貯飼料相似，且R-01 的產(chǎn)酸能力更強(qiáng)；此外，與上述研究相比，蠶豆秸稈青貯飼料的多種營養(yǎng)物質(zhì)表現(xiàn)出不同的變化，這可能是由于蠶豆秸稈中化學(xué)成分的含量、菌株的分解能力以及發(fā)酵時(shí)間不同所致。本研究中，R-01 處理后的蠶豆秸稈青貯粗蛋白含量顯著低于未處理的蠶豆秸稈青貯，這可能是由于R-01 利用非蛋白氮的能力較差或蠶豆秸稈中非蛋白氮含量較少所致。本研究處理后的蠶豆青貯粗纖維和粗脂肪含量顯著或極顯著增加，但在上述前人研究中并未發(fā)現(xiàn)類似情況，這可能與R-01 較強(qiáng)的產(chǎn)酸和抑菌能力有關(guān)，R-01 能更快地抑制青貯飼料中的腐敗微生物，減少了粗脂肪和粗脂肪的消耗。從蠶豆秸稈青貯的發(fā)酵結(jié)果可以看出，添加R-01 的青貯飼料有良好的產(chǎn)酸能力和拮抗活性。

青貯飼料的氣味、顏色和結(jié)構(gòu)評估是確定青貯飼料物理質(zhì)量的最佳方法[34]。本研究中，相較于自然發(fā)酵，使用R-01 乳酸菌添加劑的青貯蠶豆秸稈飼料保持了青貯原料的顏色，減少了刺鼻酸味，與ERGIN 等[34]和YAN 等[35]的研究結(jié)果一致。ZHANG 等[36]研究表明：青貯飼料中產(chǎn)生的刺鼻酸味與乙酸含量有關(guān)，乙酸的產(chǎn)生與葡糖醋桿菌屬和腸桿菌屬在青貯中的生長有關(guān)，它們會(huì)將乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸和其他有機(jī)酸，從而導(dǎo)致pH 值升高和發(fā)酵質(zhì)量受損[37]。因此，抑制葡糖醋桿菌屬和腸桿菌屬在青貯蠶豆飼料中的生長，可能是R-01 乳酸菌添加劑使青貯蠶豆秸稈感官評價(jià)提高的原因。

3.4 脫毒特性

消除食品或飼料中的霉菌毒素備受關(guān)注。在田間、收獲前、收獲和青貯階段，常采取多種措施來限制青貯飼料產(chǎn)生霉菌毒素[38]，其中，使用微生物或酶進(jìn)行生物凈化和生物降解是消除霉菌毒素的最佳解決方案。已有研究[39-41]發(fā)現(xiàn)：乳酸菌可降低飼料中的黃曲霉毒素，但對嘔吐毒素和T2 毒素的抑制效果不顯著。GB 12078.3-2006和GB 21693-2008 規(guī)定飼料中嘔吐毒素和T2 毒素的含量不能大于1 000 ng/mL；世界衛(wèi)生組織建議飼料中黃曲霉毒素總量小于15 ng/mL，本研究青貯飼料中霉菌毒素含量均低于限定值，且R-01 可使青貯飼料中黃曲霉毒素、嘔吐毒素和T2 毒素含量顯著或極顯著降低，表明R-01 具有更廣譜的霉菌抑制能力。

4 結(jié)論

R-01 具有生長快、pH 值下降速度快、拮抗活性強(qiáng)和抗生素耐藥性強(qiáng)的特性。添加R-01 進(jìn)行發(fā)酵可有效改善飼料化學(xué)成分和感官評價(jià)等指標(biāo)，降低飼料中霉菌毒素含量，是優(yōu)良的青貯接種劑菌種。