富士和新紅星蘋(píng)果虎皮病抗病性與生理生化特性關(guān)系比較研究

王燕 王建鋒 謝欣蔚 王穎 惠偉

摘? ?要? ?虎皮病是蘋(píng)果長(zhǎng)期貯藏過(guò)程中的主要生理病害，一般發(fā)生在冷藏的中、后期。為比較冷藏過(guò)程中富士和新紅星蘋(píng)果虎皮病抗病性與生理生化的關(guān)系，解析虎皮病發(fā)生機(jī)制，定期測(cè)定富士和新紅星蘋(píng)果在冷藏（0±0.5 ℃）期間的硬度、可溶性固形物、乙烯釋放速率、呼吸速率和虎皮病發(fā)病率、病情指數(shù)，以及果皮α-法尼烯合成酶基因（AFS1）表達(dá)量、α-法尼烯、共軛三烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）和總抗氧化性的變化。結(jié)果表明，冷藏過(guò)程中，富士的硬度和可溶性固形物含量均高于新紅星，而其呼吸速率和乙烯釋放速率整體低于新紅星；富士冷藏210天出庫(kù)時(shí)和10天（25 ℃）貨架期后，均無(wú)虎皮病發(fā)生；新紅星出庫(kù)時(shí)虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)分別為73.3%和51.1%，且經(jīng)過(guò)10天貨架期后，分別增至100%和87.8%。冷藏期間富士的AFS1基因表達(dá)量、α-法尼烯、共軛三烯和MHO含量均低于新紅星。兩個(gè)品種果皮的總酚、類(lèi)黃酮和花青苷含量在冷藏期間無(wú)顯著差異，但富士的DPPH自由基清除率整體高于新紅星。冷藏過(guò)程中，與新紅星相比，富士對(duì)虎皮病的抗病性表現(xiàn)為較低的果實(shí)乙烯釋放速率和果皮α-法尼烯代謝產(chǎn)物含量，以及相對(duì)較高的果皮抗氧化能力。

關(guān)鍵詞? ?虎皮??；抗氧化性；α-法尼烯代謝；抗病性；蘋(píng)果

中國(guó)是世界上最大的蘋(píng)果生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，2021年全國(guó)蘋(píng)果總產(chǎn)量4 579.34萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的54.7%。我國(guó)蘋(píng)果90%以上用于鮮食，貯藏保鮮在緩解果實(shí)賣(mài)難，實(shí)現(xiàn)季產(chǎn)年銷(xiāo)中起到了重要作用。由于貯藏期長(zhǎng)，一些蘋(píng)果品種在冷藏中、后期易發(fā)生虎皮病，造成嚴(yán)重的貯藏?fù)p失?；⑵げ“l(fā)病初期，病變部位呈不規(guī)則狀淡褐色，面積較小，后隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)，病斑擴(kuò)大，嚴(yán)重時(shí)連接成片。果實(shí)出庫(kù)后，病斑面積迅速擴(kuò)大，顏色加深，病果失去商品價(jià)值。前人研究表明，虎皮病的發(fā)生與品種、采收與處理、貯藏條件等有關(guān)。目前有關(guān)發(fā)病機(jī)理的研究主要集中在果實(shí)中α-法尼烯及代謝產(chǎn)物和抗氧化能力兩個(gè)方面。Mditshwa等發(fā)現(xiàn)，果實(shí)產(chǎn)生的乙烯誘導(dǎo)α-法尼烯合成，之后它自氧化成共軛三烯（CT）和6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO），誘發(fā)虎皮病。α-法尼烯通過(guò)甲羥戊酸途徑合成，其中α-法尼烯合成酶（AFS）是α-法尼烯合成過(guò)程中關(guān)鍵的限速酶，而AFS1是AFS基因家族中與蘋(píng)果虎皮病關(guān)系較為密切的基因。此外，蘋(píng)果虎皮病的發(fā)生與果皮中氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)。果實(shí)衰老過(guò)程中形成的活性氧參與α-法尼烯自氧化過(guò)程，降低了膜的完整性，讓處于細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的酚類(lèi)物質(zhì)與多酚氧化酶發(fā)生酶促反應(yīng)，形成醌，從而產(chǎn)生褐斑，導(dǎo)致虎皮病。蘋(píng)果多酚和類(lèi)黃酮具有抗氧化作用，通過(guò)清除自由基來(lái)保護(hù)果皮細(xì)胞，花色素苷是類(lèi)黃酮的主要組分，是紅色品種著色的物質(zhì)基礎(chǔ)，一般著色面具有良好的抗氧化性，虎皮病發(fā)病率較低。本文試圖通過(guò)比較不同虎皮病發(fā)生程度的富士（抗病性強(qiáng)）和新紅星（感病性強(qiáng)）兩個(gè)品種在冷藏期間果皮中α-法尼烯代謝以及抗氧化能力等變化，揭示紅色蘋(píng)果品種虎皮病發(fā)生的可能機(jī)理，為培育抗虎皮病蘋(píng)果品種提供依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料和處理? ?在陜西白水縣采收達(dá)到商業(yè)成熟度的富士和新紅星蘋(píng)果，采后當(dāng)天選取大小均勻、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害的果實(shí)作為試驗(yàn)材料，次日裝箱貯藏于冷庫(kù)，3天降溫至? ? ?0±0.5 ℃，相對(duì)濕度保持90%～95%。冷藏210天后轉(zhuǎn)移至25 ℃環(huán)境中進(jìn)行貨架貯藏。

1.2? ?測(cè)定指標(biāo)及方法

1）測(cè)定硬度與可溶性固形物。每次取10個(gè)果實(shí)，用FT327型硬度計(jì)測(cè)硬度，用WYT-J 型手持折光儀測(cè)可溶性固形物含量。

2）測(cè)定乙烯釋放速率與呼吸速率。參照高俊鳳方法，每個(gè)處理從冷庫(kù)中取10個(gè)果實(shí)，在真空干燥器中密封2小時(shí)，用注射器抽取1 mL氣體，用安捷倫6890N氣相色譜儀測(cè)定乙烯釋放速率（單位μL/kg·h），重復(fù)3次。

3）統(tǒng)計(jì)虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)。

4）AFS1基因的表達(dá)。采用改良后的CTAB法，提取-80 ℃蘋(píng)果果皮凍樣總RNA。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)已提純度較好的RNA進(jìn)行cDNA合成。通過(guò)上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)并合成引物，實(shí)時(shí)定量引物序列為Actin（F：5-ATCGTGGTCATTGGCCATGT-3R：5-AGCCTGTGAGGTTCCAGTAATCAT-3） AFS1（F：5-CACAAGAATGAAGATCTTTTGTΑ-3R：5-CAACAACGTTACAAACTGTAAAG-3）。將已轉(zhuǎn)錄成cDNA的樣品取出后，參照TaKaRa SYBR Premix ExTaq ll試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。

5）測(cè)定α-法尼烯、共軛三烯和MHO。參照Anet方法稍作改進(jìn)，用打孔器打取組織小圓片，隨機(jī)取20片，放入50 mL離心管中，加入10 mL純化的正己烷，在25 ℃，60 Hz搖床上震蕩提取2小時(shí)，之后過(guò)濾定容至10 mL，迅速在232 nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)定α-法尼烯含量。

另取提取液3 mL，于281 nm及290 nm處比色，測(cè)定共軛三烯含量。

參照J(rèn)u等方法稍作改進(jìn)，測(cè)定MHO含量。使用固相微萃取—?dú)庀嗌V法（SPME-GC），用直徑2 cm的打孔器隨機(jī)打20個(gè)果皮組織圓片（厚度3 mm），加入15 mL樣品瓶中，加2 mL NaCl溶液（200 g/L）密閉3小時(shí)。用老化后的萃取頭萃取20分鐘后進(jìn)行GC分析。進(jìn)樣口解析2分鐘。GC設(shè)置為不分流進(jìn)樣；柱初溫40 ℃保持2分鐘后，以50 ℃/min的速率升至250 ℃，運(yùn)行2分鐘；用氫離子火焰（FID）檢測(cè)器，溫度250 ℃。用外標(biāo)法定性，單位μL/kg·h。

6）測(cè)定總酚和類(lèi)黃酮含量。參照陳瑋琦等的方法，采用 Folin-ciocalteu 法測(cè)定總酚。取研磨后的果皮凍樣于1%HCL-甲醇溶液中避光浸提24小時(shí)，70 ℃超聲波提取60分鐘，9 000 rpm/min離心10 分鐘，取上清液用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法測(cè)定果皮類(lèi)黃酮含量，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

7）測(cè)定花青苷相對(duì)含量。參照宋哲等的方法測(cè)定花青苷含量，稍作改進(jìn)。取10個(gè)樣果，將果皮切碎充分混合，取0.5 g鮮樣，加入20 mL HCL-甲醇溶液，4 ℃下浸提24小時(shí)，用分光光度法測(cè)定提取液657 nm和530 nm處吸光? ? 度值，兩者吸光度值之差即為花青苷的相對(duì)? 含量。

8）測(cè)定DPPH自由基清除率。參照陳瑋琦等的方法測(cè)定DPPH自由基清除率，稍作改進(jìn)。向0.5 mL樣品提取液中加入4.5 mL DPPH溶液，搖勻，暗處室溫放置30分鐘，于517 nm處測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

9）數(shù)據(jù)處理與作圖。所有處理和測(cè)定指標(biāo)均重復(fù)3次，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、作圖。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?冷藏期間富士和新紅星蘋(píng)果硬度、可溶性固形物含量變化? ?由圖1A可知，冷藏期間，富士和新紅星的硬度皆隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸降低趨勢(shì)。除在第120 天時(shí)兩種蘋(píng)果的硬度達(dá)到相同值6 kg/cm2外，在整個(gè)冷藏過(guò)程中富士的硬度整體高于新紅星，且差異顯著（P ＜0.05）。由圖1B可知，富士在整個(gè)冷藏期間的可溶性固形物含量始終高于新紅星，兩者差異極顯著（P ＜0.01）。冷藏7個(gè)月時(shí)，它們的可溶性固形物含量分別由16.8%、12.4%降到14%、10%。

2.2? ?冷藏期間富士和新紅星蘋(píng)果乙烯釋放速率和呼吸速率的變化? ?由圖2A可知，整個(gè)冷藏期間，富士在第120天達(dá)到乙烯釋放峰值，而新紅星在冷藏第90天即達(dá)到乙烯釋放峰值，比富士提前30天，而且峰值極顯著高于富士（P ＜ 0.01）。由圖2B可知，整個(gè)冷藏期間，富士和新紅星呼吸速率皆于冷藏第90天達(dá)到峰值，富士呼吸速率始終低于新紅星，兩者差異顯著（P ＜0.05）。

2.3? ?冷藏期間富士和新紅星蘋(píng)果虎皮病發(fā)病率和病情指數(shù)的變化? ?由圖3A可知，冷藏結(jié)束（210 天）時(shí)，富士未發(fā)生虎皮病，出庫(kù)室溫下（25 ℃）放置10 天后，仍沒(méi)有發(fā)生虎皮病。冷藏結(jié)束（210天）時(shí)，新紅星虎皮病果率為73.3%，出庫(kù)室溫下放置10天后，新紅星病果率增至100%，相比冷藏期剛結(jié)束時(shí)，發(fā)病率增加26.7%，差異顯著（P ＜0.05）。由圖3B可知，冷藏結(jié)束（210 天）時(shí)新紅星虎皮病病情指數(shù)為51.1%，出庫(kù)室溫下放置10天后，病情指數(shù)升高到87.8%，相比冷藏期剛結(jié)束時(shí)增加了36.7%，差異極顯著（P ＜0.01）。

2.4? ?冷藏期間富士和新紅星蘋(píng)果果皮內(nèi)AFS1基因相對(duì)表達(dá)量的變化? ?由圖4可知，整個(gè)冷藏期間，富士和新紅星果皮內(nèi)AFS1基因的表達(dá)量與乙烯的變化趨勢(shì)相似，富士比新紅星推遲1個(gè)月，分別在第120天和90天達(dá)到峰值，且峰值差異顯著（P ＜0.05）

2.5? ?冷藏期間富士和新紅星蘋(píng)果果皮中α-法尼烯、共軛三烯和MHO含量的變化? ?由圖5A可知，整個(gè)冷藏期間，富士和新紅星果皮內(nèi)α-法尼烯含量變化類(lèi)似AFS1基因表達(dá)量變化，富士于150天達(dá)到峰值，新紅星于120天達(dá)到峰值，富士峰值低于新紅星，二者差異顯著（P ＜0.05）。由圖5B可知，整個(gè)冷藏期間，富士和新紅星果皮內(nèi)共軛三烯含量皆呈增加趨勢(shì)，富士共軛三烯含量始終低于新紅星，二者差異顯著（P ＜0.05）。由圖5C可知，冷藏90天后新 紅星果皮內(nèi)MHO含量呈快速增加趨勢(shì)，而富士果皮中MHO的含量保持相對(duì)穩(wěn)定水平，且冷藏第120天后均低于新紅星，二者差異顯著（P ＜0.05）。

2.6? ?冷藏期間富士和新紅星蘋(píng)果抗氧化能力的變化? ?由圖6A可知，整個(gè)冷藏期間，富士果皮內(nèi)類(lèi)黃酮含量波動(dòng)較大，在150天時(shí)出現(xiàn)峰值達(dá)到0.34 mg/g，而新紅星果皮內(nèi)類(lèi)黃酮含量較富士變化平穩(wěn)，二者差異不顯著（P? ＞0.05）。

由圖6B可知，整個(gè)冷藏期間，兩個(gè)品種果實(shí)花青苷含量都呈現(xiàn)先短暫升高后降低的變化趨勢(shì)。在冷藏初期（0～60天），富士花青苷含量變化不明顯，第90天前有過(guò)短暫增加，此后開(kāi)始降低；果皮內(nèi)花青苷含量0～60天時(shí)較高，峰值出現(xiàn)在冷藏第60天，此后開(kāi)始降低。冷藏120天后，富士和新紅星果皮內(nèi)花青苷含量差異不顯著（P? ＞0.05）。

如圖6C所示，整個(gè)冷藏期間，富士和新紅星果皮內(nèi)總酚含量皆呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，富士于冷藏120天達(dá)到峰值（6.98 mg/g），新紅星于150天達(dá)到峰值（6.6 mg/g），整個(gè)冷藏期間富士果皮內(nèi)總酚含量整體高于新紅星，二者差異顯著（P ＜0.05）。

自由基清除能力是蘋(píng)果總抗氧化能力的一個(gè)指標(biāo)，由圖6D可知，整個(gè)冷藏期間，兩個(gè)品種果皮內(nèi)DPPH自由基清除能力都呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，但富士的下降速度相對(duì)緩慢。在冷藏初期（30天），兩個(gè)品種DPPH自由基清除能力差異不顯著（P? ＞0.05），30天后，富士DPPH自由基清除能力始終高于新紅星，二者差異顯著（P? ＜0.05）。由此說(shuō)明，冷藏期間富士果皮抗氧化能力高于新紅星。

3? ?討論

虎皮病是一種生理性病害，不影響果肉顏色，但會(huì)造成果實(shí)風(fēng)味下降，失去商品價(jià)值。富士和新紅星都是紅色蘋(píng)果品種，新紅星冷藏4個(gè)月就開(kāi)始發(fā)生虎皮病，富士發(fā)病期在冷藏7個(gè)月以后，程度較輕。

Ding等研究發(fā)現(xiàn)，青香蕉蘋(píng)果冷藏90天虎皮病隨乙烯釋放速率上升而加重。本研究發(fā)現(xiàn)，冷藏過(guò)程中新紅星乙烯釋放速率、呼吸速率整體高于富士（圖2）；兩個(gè)品種冷藏后期虎皮病發(fā)病差異極顯著（P ＜0.01），富士始終未發(fā)病而新紅星發(fā)病率極高（圖3A），這與品種耐貯性差異有關(guān)，新紅星果肉容易發(fā)綿，而富士則能夠一直保持較高的硬度（圖1A）。

有關(guān)蘋(píng)果虎皮病發(fā)病機(jī)理的研究表明，α-法尼烯及代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)了虎皮病的發(fā)生。蘋(píng)果冷藏期間產(chǎn)生大量α-法尼烯，之后極易被氧化生成共軛三烯，共軛三烯又氧化成MHO，這些揮發(fā)性物質(zhì)是誘導(dǎo)虎皮病發(fā)生的關(guān)鍵。索江濤等認(rèn)為，α-法尼烯和共軛三烯的積累與紅富士蘋(píng)果虎皮病的發(fā)生有顯著正相關(guān)性。Sabban等證實(shí)了澳洲青蘋(píng)虎皮病的發(fā)生與其內(nèi)源MHO含量有關(guān)。Farneti等對(duì)澳洲青蘋(píng)果皮中非靶向代謝物進(jìn)行研究，共發(fā)現(xiàn)3種代謝產(chǎn)物，其中MHO與虎皮病關(guān)系極為密切。蘋(píng)果的α-法尼烯合成酶基因AFS1對(duì)α-法尼烯合成起著至關(guān)重要的作用，而且AFS1基因受到乙烯調(diào)控，感病品種的AFS1基因表達(dá)水平更高。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雖然冷藏過(guò)程中兩個(gè)品種果皮的α-法尼烯含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)（圖5A），但富士AFS1基因表達(dá)量和α-法尼烯含量的峰值都比新紅星推遲1個(gè)月；新紅星果皮共軛三烯和MHO含量在冷藏過(guò)程中均保持上升趨勢(shì)，而富士共軛三烯和MHO含量一直低于新紅星（圖5），這可能與富士蘋(píng)果較強(qiáng)的抗病性能有關(guān)。

虎皮病的發(fā)生與果實(shí)抗氧化能力有關(guān)，富士和新紅星都是紅色果皮品種，且果皮中都富含類(lèi)黃酮等多酚類(lèi)物質(zhì)，它們對(duì)虎皮病的抗病性差異是否與這些物質(zhì)含量有關(guān)，目前未見(jiàn)報(bào)道。伴隨α-法尼烯大量氧化，細(xì)胞膜透性增大，果皮細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性及多酚氧化酶（PPO）與底物的區(qū)域分布遭到破壞，最終導(dǎo)致虎皮病發(fā)生。索江濤等研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理顯著抑制了紅富士蘋(píng)果乙烯形成，并降低了多酚氧化酶（PPO）活性，進(jìn)而保持了多酚等抗氧化物質(zhì)的含量，最終降低了蘋(píng)果虎皮病發(fā)病率。蘋(píng)果富含多酚類(lèi)物質(zhì)，其中黃酮類(lèi)和花青素類(lèi)物質(zhì)是其重要組成，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性，并能延緩果實(shí)衰老褐變。本研究發(fā)現(xiàn)，整體上富士和新紅星的類(lèi)黃酮含量沒(méi)有顯著差異（圖6A）；富士前期花青苷比新紅星還要低一些（圖6B），可能與新紅星乙烯和呼吸高峰更早出現(xiàn)有關(guān)。宋哲等人發(fā)現(xiàn)，伴隨著蘋(píng)果果實(shí)的衰老，花青苷迅速降解；楊小幸等研究發(fā)現(xiàn)，DPPH自由基清除能力減弱? ?可能是酚類(lèi)物質(zhì)減少的重要原因。所以，本研究中富士DPPH自由基清除能力高于新紅星（圖6D）。富士蘋(píng)果的抗病性與它總的抗氧化能力高有關(guān)。

4? ?結(jié)論

新紅星蘋(píng)果的感病性與其乙烯釋放速率高有關(guān)。富士對(duì)虎皮病的抗性與其低乙烯釋放速率和低α-法尼烯及代謝產(chǎn)物含量有關(guān)，尤其是共軛三烯、MHO一直維持低水平，并且在冷藏過(guò)程中保持了較高的抗氧化能力。

針對(duì)不同蘋(píng)果品種的果實(shí)虎皮病與乙烯釋放速率、抗氧化能力和α-法尼烯及代謝產(chǎn)物的相關(guān)性，仍需進(jìn)一步研究。

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