右美托咪定對膿毒癥小鼠認知功能及HSP70表達的影響*

趙園園， 邱高林， 蔡雯， 周靜文， 李元海， 夏曉瓊， 張夢英

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院 麻醉科， 安徽 巢湖 238000； 2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 麻醉科， 安徽 合肥 230031）

膿毒癥是機體對感染反應(yīng)失調(diào)所致的臟器功能障礙綜合征，膿毒癥相關(guān)性腦?。╯epsis-associated encephalopathy, SAE）是膿毒癥的中樞系統(tǒng)并發(fā)癥，與腦內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激有關(guān)，病死率較高，幸存者多存在長期認知缺陷，但目前尚無有效的治療方式[1]。熱休克蛋白70（heat shock protein70, HSP70）是熱休克蛋白家族的重要成員，是一種高度保守的蛋白，作用廣泛，能協(xié)助蛋白正確地折疊、促進異常蛋白的降解、阻止Tau 蛋白和Aβ 聚集、抑制神經(jīng)炎癥與氧化應(yīng)激，在神經(jīng)退行性疾病、血管性腦病中發(fā)揮腦保護作用[2-5]。

右美托咪定（Dexmedetomidine, Dex）是一種高選擇性的α2 受體激動劑，兼具鎮(zhèn)靜與鎮(zhèn)痛作用，廣泛用于臨床麻醉和重癥監(jiān)護室鎮(zhèn)靜。有研究顯示，Dex 定能通過抗炎、抗氧化、抗交感、降低氨基酸毒性、減少神經(jīng)元凋亡等機制改善膿毒癥患者認知功能[6-7]，但HSP70 是否參與其腦保護過程目前尚不清楚。本研究以脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）復(fù)制膿毒血癥相關(guān)的認知障礙模型，探討Dex 對膿毒癥小鼠認知功能的影響和HSP70 表達的調(diào)控，為其腦保護機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（皖）2022-001，實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2020-001]80 只，周齡7～8 周，體重20～25 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 鹽酸右美托咪定注射液（揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號：22041031），LPS（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，批號：abs42020800），BCA 蛋白定量試劑盒（愛必信生物科技股份有限公司，批號：abs9232），過氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性、谷胱甘肽（Glutathione, GSH）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A001-1-3-2、A006-2-1、A003-1-2），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：PI303、PT512），RNA 提取液、Synthesis Super Mix for qPCR 和2×SYBR Green qPCR Master Mix（武漢賽維爾科技有限公司，批號：G3013、G3337、G3320），HSP70 單克隆抗體、免疫組織化學(xué)染色試劑盒（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：66183-1-lg、PK10018）。

1.2.2 主要儀器 低速冷凍離心機（型號：KDC-2046，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），酶標儀[型號：Multiskan FC，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]，熒光定量PCR 儀[型號：CPX96 Touch，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]，生物顯微鏡（型號：DM2500，德國徠卡公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型復(fù)制 將C57BL/6 小鼠隨機分為對照組（CON 組）、單純Dex 組（Dex 組）、膿毒血癥組（LPS 組）和Dex + 膿毒血癥組（D + L 組），每組20 只。首先，Dex 組和D + L 組按照參考文獻[8]方法，腹腔注射Dex 25 μg/kg，CON 組和LPS 組腹腔注射等劑量的生理鹽水；30 min 后LPS 組和D+L 組參 照 文 獻[9] 腹 腔 注 射 5 mg/kg 脂 多 糖（Lipopolysaccharide, LPS）復(fù)制膿毒血癥模型，CON 組和Dex 組腹腔注射等劑量的生理鹽水。

1.3.2 Morris 水迷宮實驗 每組給藥后24 h 隨機選8 只小鼠進行實驗。Morris 水迷宮為直徑100 cm，深30 cm 的圓形水池，水溫控制在（22±1）℃，將直徑10 cm 的圓形平臺放入目標象限，并隱匿于水面下1 cm。第1～5 天進行定位航行實驗，每日將小鼠面向池壁從4 個象限依次放入水中，記錄每次爬上平臺的時間（逃避潛伏期），若60 s 內(nèi)未爬上平臺則按60 s 計算，并引導(dǎo)其至平臺上停留30 s。第6 天進行空間探索實驗，撤離平臺，將小鼠從原平臺對側(cè)的象限放入水中，記錄小鼠60 s 內(nèi)在目標象限的停留時間及穿越平臺的次數(shù)。

1.3.3 ELISA 檢測血清TNF-α 和IL-1β 水平 每組給藥后24 h 取8 只小鼠眼球取血，室溫靜置2 h，4℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書操作，采用ELISA 檢測小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平。處死小鼠取海馬組織，置入-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 化學(xué)比色法檢測海馬組織SOD 活性和GSH、MDA 水平 取備用的海馬組織清洗稱重，按質(zhì)量∶體積=1∶9 加入生理鹽水，用組織勻漿器在冰上充分研磨制備10%海馬組織勻漿，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min 后取上清液，采用BCA 法測定海馬組織蛋白濃度，化學(xué)比色法測定SOD 活性和GSH、MDA 水平。

1.3.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染色觀察小鼠海馬組織病理變化 每組給藥后24 h 取4 只小鼠斷頸處死，冰上分離出完整的海馬組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋和切片制備成4 μm 厚的切片，烘干備用。每只取3 張切片，經(jīng)二甲苯和酒精脫蠟至水后進行HE 染色，于400 倍顯微鏡下觀察海馬CA1 區(qū)組織形態(tài)變化。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色檢測海馬組織HSP70 蛋白的表達 取制備的海馬切片，每只3 張切片，常規(guī)脫蠟和水化后抗原熱（96～98 ℃）修復(fù)20 min，ddH20潤洗、緩沖液浸泡；滴加封閉液濕盒內(nèi)封閉30 min；滴加2 μg/mL 的HSP70 一抗50 μL 濕盒中孵育1 h，緩沖液洗滌2 次，1 min/次；滴加2～4 滴二抗?jié)窈兄蟹跤?0 min，緩沖液洗滌3 次，1 min/次；滴加DAB，變色后緩沖液沖洗，ddH20 浸泡3～4 次、30 s/次；滴加信號加強液，孵育5 min，緩沖液潤洗，復(fù)染、封片。顯微鏡下觀察海馬CA1 區(qū)，應(yīng)用Image J 軟件分析免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，陽性細胞率=視野內(nèi)陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測海馬組織HSP70 mRNA表達 取適量海馬組織，按10 mg組織中加100 μL RNA 提取液的比例研磨均勻，提取總RNA，根據(jù)試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和qRTPCR。HSP70 正向引物：5'-CCGACAAGGAGGAGTTC GTG-3'，反向引物：5'-ACAGTAATCGGTGCCCAAGC-3'，長度均為249 bp；GAPDH 正向引物：5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'，反向引物：5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3'，長度均為133 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性15 s、60 ℃退火并延伸30 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算HSP70 mRNA 相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠Morris水迷宮實驗指標比較

各組小鼠第1、2、3、4、5 天逃避潛伏期比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的逃避潛伏期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=206.485，P=0.000）；②各組小鼠的逃避潛伏期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.576，P=0.000），LPS 組較CON 組延長，D+L 組較LPS 組縮短；③各組小鼠逃避潛伏期變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.877，P=0.020）。見表1。

表1 各組小鼠不同時間點逃避潛伏期比較 （n =8， s， ±s）

表1 各組小鼠不同時間點逃避潛伏期比較 （n =8， s， ±s）

組別第1天第2天第3天第4天第5天CON組Dex組LPS組D + L組46.66±9.27 46.86±10.04 48.92±11.24 47.98±9.52 29.47±4.49 30.88±3.76 33.56±4.47 33.45±3.18 22.30±4.78 21.31±5.97 30.21±3.72 24.78±2.93 11.33±2.93 14.53±5.79 22.69±2.56 17.18±6.08 5.23±1.49 6.67±2.09 20.05±2.34 11.18±2.95

空間探索實驗結(jié)果顯示，各組小鼠游泳速度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組小鼠目標象限停留時間、穿越平臺次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LPS 組目標象限停留時間短于CON組，D+L 組長于LPS 組；LPS 組穿越平臺次數(shù)少于CON 組，D+L 組多于LPS 組。見表2。

表2 各組小鼠空間探索結(jié)果比較 （n =8， ±s）

表2 各組小鼠空間探索結(jié)果比較 （n =8， ±s）

注：①與CON組比較，P ＜0.05； ②與LPS組比較，P ＜0.05

組別穿越平臺次數(shù)游泳速度/（cm/s）目標象限停留時間/s CON組Dex組LPS組D + L組F 值P 值8.13±1.55 6.75±2.12 4.13±1.13①6.38±1.19②9.190 0.000 23.99±2.67 23.10±1.66 24.59±2.17 23.24±2.27 0.779 0.515 31.65±5.63 29.06±5.96 20.33±3.74①28.05±4.28②7.632 0.001

2.2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較

各組小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LPS 組較CON 組升高，D+L組較LPS 組降低。見表3。

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較（n =8， pg/mL， ±s）

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比較（n =8， pg/mL， ±s）

注：①與CON組比較，P ＜0.05； ②與LPS組比較，P ＜0.05。

組別IL-1β TNF-α CON組Dex組LPS組D + L組F 值P 值25.50±5.90 26.26±6.58 65.85±9.05①41.94±4.58②63.101 0.000 57.12±12.29 57.38±15.07 154.80±17.50①86.13±9.15②88.232 0.000

2.3 各組小鼠海馬組織SOD、GSH、MDA水平比較

各組小鼠海馬組織中SOD、GSH、MDA 水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LPS 組GSH、SOD 水平較CON 組降低，MDA 水平較CON 組升高，D+L 組GSH、SOD 水平較LPS 組升高，MDA 水平較LPS 組降低。見表4。

表4 各組海馬組織中氧化應(yīng)激水平比較 （n =8， ±s）

表4 各組海馬組織中氧化應(yīng)激水平比較 （n =8， ±s）

注：①與CON組比較，P ＜0.05； ②與LPS組比較，P ＜0.05。

組別MDA/（nmol/mg·prot）SOD/（u/mg·prot）GSH/（nmol/mg·prot）CON組Dex組LPS組D + L組F 值P 值1.11±0.27 1.25±0.24 2.60±0.32①1.85±0.26②49.576 0.000 127.41±17.22 126.21±15.98 56.58±6.80①97.79±8.42②52.816 0.000 26.72±4.62 23.60±4.74 9.75±2.29①16.50±3.02②31.614 0.000

2.4 各組小鼠海馬CA1區(qū)病理變化

HE 染色結(jié)果顯示，CON 組和Dex 組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，核染色清晰；LPS 組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，排列紊亂，大量細胞染色加深、核固縮；D+L 組海馬CA1 區(qū)上述病理改變較LPS 組減輕，受損細胞明顯減少。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬CA1區(qū)病理變化 （HE染色×400）

2.5 各組小鼠海馬組織HSP70 蛋白陽性表達率比較

CON 組、Dex 組、LPS 組、D + L 組小鼠海馬CA1區(qū)HSP70 蛋白陽性表達率分別為（15.55±1.67）%、（17.80±3.13）%、（43.13±2.55）%、（63.63±3.17）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=285.419，P=0.000），LPS 組較CON 組升高（P＜0.05），D+L 組較LPS 組升高（P＜0.05），Dex 組與CON 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠海馬CA1區(qū)HSP70蛋白陽性表達情況 （免疫組織化學(xué)×400）

2.6 各組小鼠海馬組織HSP70 mRNA 相對表達量比較

CON 組、Dex 組、LPS 組、D+L 組小鼠海馬組織HSP70 mRNA相對表達量分別為（1.03±0.29）、（1.30±0.19）、（1.97±0.11）、（3.24±0.54），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.024，P=0.000），LPS 組較CON 組升高（P＜0.05），D+L 組較LPS 組升高（P＜0.05），Dex 組與CON 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

SAE 是膿毒血癥最常見的器官功能障礙之一，病理機制復(fù)雜，主要表現(xiàn)為認知功能和意識受損。據(jù)統(tǒng)計，9%～71% 膿毒癥患者伴有不同程度的SAE，給患者及其家庭造成極大痛苦[10]。HSP70 是細胞在應(yīng)激刺激下分泌的自我保護性蛋白，細胞內(nèi)的HSP70 能降低膿毒癥的氧化應(yīng)激水平，減少LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化，降低活性氧和TNF-α 生成，減少神經(jīng)細胞壞死和凋亡，緩解膿毒癥相關(guān)的中樞炎癥與認知能力下降[5,11-13]。研究顯示，Dex 對SAE具有腦保護作用，但具體作用機制不詳[14]。ZHANG等[8]發(fā)現(xiàn)Dex 可通過上調(diào)海馬組織HSP70，抑制神經(jīng)元凋亡，改善腦缺血大鼠的認知障礙；LU 等[15]發(fā)現(xiàn)，使用常規(guī)藥物聯(lián)合腹腔注射Dex 進行CPR 時，顯著提高了復(fù)蘇大鼠的神經(jīng)功能，并且證實與Dex 增加海馬組織HSP70 的表達有關(guān)。這些研究提示Dex 可能通過HSP70 改善SAE 的認知功能。

海馬是學(xué)習(xí)和記憶形成的重要位置，CA1 區(qū)是海馬中的缺血缺氧脆弱區(qū)，與空間學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，LPS 是G-桿菌細胞壁主要成分，腹腔注射后能迅速提高血清炎癥因子，并誘發(fā)海馬組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激跡象，導(dǎo)致神經(jīng)元萎縮和降低損傷空間認知能力[16-18]，因此筆者選擇腹腔注射LPS 復(fù)制SAE 模型。結(jié)果顯示，LPS 組小鼠腹腔注射LPS 后血清中IL-6、TNF-α 明顯升高，海馬組織中SOD 活性和GSH 水平降低、MDA 水平升高，海馬CA1 區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，并且在Morris 水迷宮實驗中逃避潛伏期延長，目標象限停留時間和穿越平臺次數(shù)減少，說明SAE 模型復(fù)制成功。而D + L 組預(yù)先給予Dex 降低膿毒癥小鼠體內(nèi)的炎癥和氧化應(yīng)激水平，減輕海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元損傷，縮短了逃避潛伏期，增加目標象限停留時間和穿越平臺次數(shù)，說明Dex 在膿毒癥中具有一定的腦保護作用，但是否與HSP70 相關(guān)尚不清楚。本研究通過qRT-PCR 和免疫組織化學(xué)實驗檢測了各組小鼠海馬組織內(nèi)HSP70 mRNA 和蛋白的表達，結(jié)果顯示，與對照組比較，LPS 組小鼠海馬組織HSP70 mRNA 相對表達量及蛋白陽性表達率升高，這可能與LPS 的刺激有關(guān)[19]。文獻顯示，LPS 暴露2～6 h 后細胞內(nèi)HSP70 表達增加，但增加量相對較少并且多在12 h 后開始下降，不足以抵抗LPS 所致的損傷[20-21]，故可解釋LPS 組小鼠體內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激水平的升高及SAE 的發(fā)生。而與LPS 組比較，D+L 組小鼠海馬組織HSP70 mRNA、蛋白表達被進一步上調(diào)，說明預(yù)先腹腔注射Dex 可增加膿毒癥小鼠海馬內(nèi)的HSP70 轉(zhuǎn)錄與表達。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP70 能通過抑制核因子-κB，降低炎癥因子釋放、干擾誘導(dǎo)型一氧化碳合酶合成與提高核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2/血紅素氧合酶1，減少活性氧產(chǎn)生，從而提高細胞應(yīng)激耐受能力，減少神經(jīng)細胞損傷[3，22]，與本研究結(jié)果一致。因此，筆者推測Dex 可能通過上調(diào)HSP70 改善SAE 小鼠的認知功能。

綜上所述，本研究初次在膿毒癥模型中探討Dex 的認知保護作用與海馬組織HSP70 表達的關(guān)系，推斷Dex 可能通過上調(diào)HSP70 緩解膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，減輕海馬組織損傷程度，改善膿毒癥小鼠的認知障礙，為探討Dex 腦保護的新機制提供參考。但是，本研究未就Dex 調(diào)控HSP70 表達做劑量相關(guān)性研究，且未對其具體過程進一步探究，將在后期的實驗中繼續(xù)補充。