優(yōu)化潰結(jié)方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎氣滯血瘀模型大鼠的影響及其作用機(jī)制研究

張帥，李娜，沈江立，柳越冬，吳憲樹，王磊，盛天驕，徐紅俊，安勝軍*

1.050091 河北省石家莊市，河北中醫(yī)藥大學(xué)

2.712000 陜西省咸陽市中心醫(yī)院

3.110005 遼寧省沈陽市，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院

4.021008 內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市中蒙醫(yī)院肛腸科

5.110005 遼寧省沈陽市，解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科

相關(guān)統(tǒng)計(jì)資料顯示，近年來我國潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）患者數(shù)量持續(xù)增加，發(fā)病率約為13.3/100 萬［1］。對(duì)于UC，臨床常采用氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類藥物等進(jìn)行治療，雖然其近期療效尚可，但不良反應(yīng)較大，且經(jīng)治療后容易復(fù)發(fā)。優(yōu)化潰結(jié)方由黃芪、（炒）白術(shù)、蒼術(shù)、青黛、敗醬草、白頭翁、紅花組成，是柳越冬教授用以治療UC 脾虛濕熱證的經(jīng)驗(yàn)方，療效確切、證據(jù)成鏈［2-5］。實(shí)驗(yàn)研究表明，優(yōu)化潰結(jié)方可有效改善UC 模型大鼠癥狀，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signal regulated protein kinase，ERK）、白介素1β 等改善腸道炎癥［3］；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，優(yōu)化潰結(jié)方對(duì)腸道免疫應(yīng)答的調(diào)控涉及白介素17 免疫信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路［4-6］。此外，優(yōu)化潰結(jié)方含有益氣活血的常用對(duì)藥黃芪和紅花，但其對(duì)UC 氣滯血瘀型患者的作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討優(yōu)化潰結(jié)方對(duì)UC 氣滯血瘀模型大鼠的影響，并通過比較干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（transforming growth factor kinase 1，TAK1）表達(dá)水平而探索其作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用優(yōu)化潰結(jié)方治療UC 氣滯血瘀型患者提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

2023 年9—10 月，選取體質(zhì)量為200～240 g 的SPF級(jí)雄性SD 大鼠70 只（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：2018-001），采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為正常組、模型組、柳氮磺胺吡啶組、低劑量組、標(biāo)準(zhǔn)劑量組、益氣組、活血組，每組10 只。所有大鼠飼養(yǎng)于清潔系統(tǒng)內(nèi)，室溫保持在（20±2）℃，相對(duì)濕度保持在50%～60%；大鼠的飼養(yǎng)及觀察均在咸陽市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行；本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審議并批準(zhǔn)（審批號(hào)：SUCMDL20231316003）。

1.2 UC 氣滯血瘀型模型的建立

采用三硝基苯磺酸（thiobarbituric acid reactive substances，TNBS）/乙醇二次致炎法結(jié)合束縛法［2］建立UC 氣滯血瘀模型：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后限制其四肢活動(dòng)度（約8 h/d），造模前禁食不禁水24 h，稱重后采用戊巴比妥鈉3 mL/kg 進(jìn)行麻醉，然后將灌胃針自大鼠肛門插至距肛門8 cm 處，采用60 mg/kg TNBS/乙醇溶液緩慢灌腸以誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎；15 d 后（造模第16 天）采用同樣方法進(jìn)行30 mg/kg TNBS/乙醇溶液灌腸以誘導(dǎo)復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎。需要注意的是，兩次灌腸后均需注入空氣0.5 mL 并使大鼠保持倒立位3～5 min，然后放回飼養(yǎng)籠并保持仰臥位、正常飼養(yǎng)，造模過程中大鼠若有死亡則及時(shí)補(bǔ)足。依據(jù)大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)、疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分驗(yàn)證UC 氣滯血瘀模型大鼠造模是否成功［2］。

1.3 優(yōu)化潰結(jié)方的制備

本研究所用柳氮磺胺吡啶由上海福達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)，用量為6 g，使用前需加水浸泡一段時(shí)間并濃縮、定容至6 mL，之后灌入清潔玻璃容器中，封口、經(jīng)高壓滅菌后于4 ℃條件下冷藏備用，此時(shí)柳氮磺胺吡啶藥液濃度為1 g/mL。

優(yōu)化潰結(jié)方藥物組成：黃芪20 g、（炒）白術(shù)15 g、蒼術(shù)10 g、青黛3 g、敗醬草20 g、白頭翁15 g、紅花10 g。自咸陽市中心醫(yī)院中藥房購買上述中藥材后加水浸泡45 min，文火煎煮40 min 后濾取藥液，然后加入藥渣同體積水繼續(xù)煎煮30 min 并再次濾取藥液，將2 次所得濾液混合并濃縮、定容至93 mL，之后灌入清潔玻璃容器中，封口、經(jīng)高壓滅菌后于4 ℃條件下冷藏備用，此時(shí)優(yōu)化潰結(jié)方藥液濃度為1 g/mL。60 kg 人與200 g 大鼠藥物劑量折算比為 6.25∶1，據(jù)此換算得出優(yōu)化潰結(jié)方標(biāo)準(zhǔn)劑量為1.674 g·kg-1·d-1［6-7］。

單獨(dú)自咸陽市中心醫(yī)院中藥房購買黃芪、紅花各10 g，各加水浸泡30 min，文火煎煮40 min 后濾取藥液，然后加入藥渣同體積水繼續(xù)煎煮30 min 并再次濾取藥液，各將2 次所得濾液混合并濃縮、定容至10 mL，之后灌入清潔玻璃容器中，封口、經(jīng)高壓滅菌后于4 ℃條件下冷藏備用，此時(shí)黃芪、紅花藥液濃度均為1 g/mL。

1.4 干預(yù)方法

正常組大鼠在造模時(shí)使用0.9%氯化鈉溶液灌腸，并與其他組大鼠進(jìn)行同步抓取、固定，在造模成功后給予等體積水灌胃，1 次/d，共灌胃14 次；模型組大鼠在造模成功后給予等體積水灌胃，1 次/d，共灌胃14 次；柳氮磺胺吡啶組、低劑量組、標(biāo)準(zhǔn)劑量組、益氣組、活血組大鼠分別在造模成功后給予柳氮磺胺吡啶藥液0.54 g/kg、低劑量?jī)?yōu)化潰結(jié)方藥液0.837 g/kg、標(biāo)準(zhǔn)劑量?jī)?yōu)化潰結(jié)方藥液1.674 g/kg、黃芪藥液1.8 g/kg、紅花藥液0.9 g/kg 灌胃，均為1 次/d，均灌胃14 次。

1.5 大鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)變化

造模后第15 天處死7 組大鼠并鉗取其結(jié)腸組織2～3 塊（大小：1 mm×1 mm×1 mm），采用2.5%戊二醛、1%鋨酸依次固定，切片后采用高精度透射電鏡觀察結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)變化并攝片、保存。

1.6 大鼠結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白表達(dá)水平

采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)7 組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白表達(dá)水平：將鉗取的大鼠結(jié)腸組織塊用預(yù)冷的磷酸鹽（PBS）緩沖液洗滌數(shù)次后剪成小塊（大?。? mm×1 mm）并置于勻漿管中，再放入1～2 個(gè)3 mm 的勻漿珠并倒入提前制備的10 倍于結(jié)腸組織塊體積的裂解液，并進(jìn)行勻漿處理；若要制備高濃度蛋白，放入少量裂解液即可。上述操作結(jié)束后及時(shí)取出勻漿管，放置于冰上0.5 h，每隔3～5 min 震蕩1 次以使樣本充分裂解，然后于4 ℃條件下低速離心10 min，離心力為14000×g；最后收集蛋白溶液并進(jìn)行濃度測(cè)定、蛋白變性、電泳等。大鼠結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白表達(dá)水平以灰度比值表示。

1.7 大鼠結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA表達(dá)水平

采用熒光定量PCR 檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 表達(dá)水平：將大鼠結(jié)腸組織勻漿、研磨后提取總RNA，測(cè)定濃度及純度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR 檢測(cè)；采用2-??Ct法計(jì)算CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，CXCR4、VEGFA、TAK1 PCR 引物序列見表1。

表1 CXCR4、VEGFA、TAK1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences of CXCR4，VEGFA and TAK1

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD-t 分析，方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)變化

造模后第15 天正常組大鼠腸上皮細(xì)胞未見明顯腫脹，細(xì)胞膜完整，胞內(nèi)基質(zhì)電子密度均一，細(xì)胞器豐富；微絨毛排列整齊，局部區(qū)域稀疏；腸屏障結(jié)構(gòu)尚可；胞核異染色質(zhì)增加，核膜模糊；線粒體數(shù)量適中，結(jié)構(gòu)尚可；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見明顯擴(kuò)張（圖1A）。

圖1 7 組大鼠造模后第15 天結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)變化（投射電鏡，×5000）Figure 1 Change of ultra microstructure in colonic tissue in the seven groups after 15 days of the establishing

造模后第15天模型組大鼠腸上皮細(xì)胞中重度水腫，細(xì)胞器豐富、明顯腫脹；微絨毛局部稀疏、紊亂、大量缺失，部分明顯腫脹；細(xì)胞間緊密連接及中間連接結(jié)構(gòu)不明顯，未見明顯橋粒結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隙明顯增加（圖1B 箭頭所示），腸屏障結(jié)構(gòu)異常。

造模后第15 天柳氮磺胺吡啶組大鼠腸上皮細(xì)胞未見明顯腫脹，細(xì)胞膜完整，胞內(nèi)基質(zhì)電子密度均一，細(xì)胞器豐富；微絨毛排列整齊，長短均一；細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)模糊，中間連接張力絲少量減少，橋粒數(shù)量豐富（圖1C）。

造模后第15天低劑量組大鼠腸上皮細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞膜完整，胞內(nèi)基質(zhì)電子密度均一，細(xì)胞器豐富；微絨毛排列整齊，數(shù)量豐富，略顯腫脹；細(xì)胞間緊密連接、中間連接及橋粒局部可見、結(jié)構(gòu)清晰，腸屏障結(jié)構(gòu)受損（圖1D）。

造模后第15 天標(biāo)準(zhǔn)劑量組大鼠腸上皮細(xì)胞線粒體數(shù)量適中、未見明顯腫脹、基質(zhì)較為均勻，個(gè)別腫脹線粒體基質(zhì)較多溶解；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見明顯擴(kuò)張、表面可見核糖體附著，腸屏障結(jié)構(gòu)尚可（圖1E）。

造模后第15 天益氣組大鼠腸上皮細(xì)胞中度水腫，微絨毛略顯腫脹，排列不整齊，普遍較短；細(xì)胞間緊密連接及中間連接結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞間隙狹窄，連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)正常，腸屏障結(jié)構(gòu)尚可；部分基質(zhì)較多溶解，嵴部分?jǐn)嗔?、消失（圖1F）。

造模后第15 天活血組大鼠腸上皮細(xì)胞未見明顯腫脹，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富、結(jié)構(gòu)正常；微絨毛排列整齊、長短均一，無明顯萎縮、脫落，局部區(qū)域略顯稀疏；細(xì)胞間可見緊密連接、中間連接、橋粒，多處細(xì)胞間隙明顯增寬（圖1G 箭頭所示），連接復(fù)合體張力微絲略減少。

2.2 大鼠結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白表達(dá)水平

7 組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1蛋白灰度比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2、表2。模型組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；柳氮磺胺吡啶組、低劑量組、標(biāo)準(zhǔn)劑量組、益氣組、活血組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；標(biāo)準(zhǔn)劑量組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值低于柳氮磺胺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 7 組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

表2 7 組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值（±s）Table 2 Comparison of gray ratios of proteins of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

表2 7 組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值（±s）Table 2 Comparison of gray ratios of proteins of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

注：a 表示與正常組相比P<0.05；b 表示與模型組相比P<0.05；c 表示與柳氮磺胺吡啶組相比P<0.05。

組別 只數(shù) CXCR4 VEGFA TAK1正常組 101.27±0.030.87±0.170.98±0.29模型組 101.90±0.06a 1.46±0.27a 1.94±0.52a柳氮磺胺吡啶組 101.51±0.18ab 0.98±0.27b 1.58±0.48ab低劑量組 100.36±0.14abc 0.10±0.09abc 1.03±0.26bc標(biāo)準(zhǔn)劑量組 100.10±0.09abc 0.05±0.06abc 0.74±0.18abc益氣組 101.09±0.08abc 0.40±0.25abc 1.45±0.10ab活血組 101.50±0.15ab 1.10±0.20ab 1.50±0.09ab F 值 989.373203.94253.058 P 值 <0.001 <0.0010.001

2.3 大鼠結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA表達(dá)水平

7 組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。模型組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低劑量組、標(biāo)準(zhǔn)劑量組、益氣組、活血組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于模型組，活血組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織VEGFA、TAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于柳氮磺胺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 7 組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of relative mRNA expression quality of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

表3 7 組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of relative mRNA expression quality of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

注：a 表示與正常組相比P<0.05；b 表示與模型組相比P<0.05；c 表示與柳氮磺胺吡啶組相比P<0.05。

組別 只數(shù) CXCR4 VEGFA TAK1正常組 1021.13±0.1225.75±0.4922.31±0.43模型組 1033.88±1.19a 37.40±0.79a 33.43±0.81a柳氮磺胺吡啶組 1021.34±0.26b 27.48±0.28ab 23.14±0.76ab低劑量組 1021.21±1.11b 25.94±0.63bc 23.06±0.67ab標(biāo)準(zhǔn)劑量組 1021.76±1.10b 27.79±0.63ab 22.49±0.21bc益氣組 1021.80±1.22b 27.02±0.80ab 23.89±0.97ab活血組 1018.90±3.09b 25.93±0.55bc 21.84±0.70bc F 值 115.073453.648347.877 P 值 <0.001 <0.001 <0.001

3 討論

UC 是一種慢性腸道炎性疾病，患者主要臨床表現(xiàn)包括腹瀉、黏液膿性或血性大便、里急后重、腹痛等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前，UC 的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，臨床上尚無根治UC 的藥物［3］，對(duì)于活動(dòng)期UC 患者，臨床治療以提高患者生活質(zhì)量、誘導(dǎo)維持臨床緩解、促進(jìn)腸黏膜愈合、預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥為主。

優(yōu)化潰結(jié)方是柳越冬教授根據(jù)UC 的主要病因病機(jī)研制的［7-12］，貫穿健脾、祛濕、益氣、活血的治則，臨床用以治療UC 脾虛濕熱證取得良好療效，已成為治療UC 的經(jīng)驗(yàn)方。優(yōu)化潰結(jié)方中敗醬草具有清熱解毒、祛瘀排膿功效，白頭翁具有清熱解毒、涼血止痢功效，共為君藥；黃芪具有補(bǔ)氣固表、托毒排膿、利尿、生肌功效，為臣藥；紅花具有活血通經(jīng)、去瘀止痛功效，青黛具有清熱解毒、涼血功效，共為佐藥；（炒）白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水功效，蒼術(shù)具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒功效，共為使藥；全方藥物配伍，共奏健脾除濕、行氣活血、清熱、止痛之功。

CXCR4 屬于趨化因子受體亞家族，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞和組織。CXCR4激活后不僅可通過核因子（nuclear factor，NF）-κB 信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞遷移和炎性細(xì)胞活化，也可促進(jìn)JAK/STAT 信號(hào)通路的激活并進(jìn)一步調(diào)控免疫細(xì)胞的遷移和活化；此外，CXCR4 與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）結(jié)合后還會(huì)趨化炎性細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮到達(dá)炎癥部位。研究表明，UC 患者外周血CD4+T 淋巴細(xì)胞CXCR4 表達(dá)水平明顯高于健康人，通過SDF-1/CXCR4 信號(hào)軸可促進(jìn)表達(dá)CXCR4 的CD4+T 淋巴細(xì)胞沿著受損結(jié)腸組織中的SDF-1 濃度梯度遷移至損傷部位，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用，而CXCR4 的特異性拮抗劑T140 可通過阻斷SDF-1/CXCR4 信號(hào)軸減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠的炎性反應(yīng)，并抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［6］。VEGFA 是促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵因子，也是UC發(fā)生發(fā)展過程中的重要促炎性細(xì)胞因子之一。有研究表明，UC 患者體內(nèi)活化血小板的α 顆粒釋放血管生成調(diào)節(jié)蛋白可促進(jìn)VEGF 的表達(dá)，進(jìn)而加重炎性反應(yīng)［4］。TAK1 屬于MAP3K 家族，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，是NF-κB 信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)因子。研究表明，TAK1 激活后不僅可促使NF-κB 核轉(zhuǎn)位并調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引發(fā)炎性反應(yīng)，還可通過激活JAK/STAT 信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞激活及炎性反應(yīng)［5］。上述信號(hào)通路之間的交叉調(diào)控與相互作用使得VEGFA、TAK1、CXCR4 在UC 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但具體的信號(hào)通路交叉機(jī)制可能因細(xì)胞類型、疾病狀態(tài)和微環(huán)境不同而有所變化［6，13-15］。

實(shí)驗(yàn)研究表明，優(yōu)化潰結(jié)方能有效降低TNBS/乙醇誘導(dǎo)的UC 大鼠結(jié)腸組織促炎性細(xì)胞因子白介素1β、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-β1 表達(dá)水平，提高結(jié)腸組織VEGF 表達(dá)水平，進(jìn)而抑制腸道炎性反應(yīng)，促進(jìn)腸道受損黏膜修復(fù)與潰瘍愈合［16］?；谝阎鞍踪|(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)或分子相互作用數(shù)據(jù)庫的預(yù)測(cè)算法表明，優(yōu)化潰結(jié)方中藥物成分主要通過CXCR4、VEGFA、TAK1 等靶蛋白及炎癥、免疫等相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。本研究結(jié)果顯示，柳氮磺胺吡啶組、低劑量組、標(biāo)準(zhǔn)劑量組、益氣組、活血組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值及mRNA 相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，活血組大鼠干預(yù)后結(jié)腸組織VEGFA、TAK1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于柳氮磺胺吡啶組，提示優(yōu)化潰結(jié)方及其益氣、活血組分可有效降低UC 氣滯血瘀模型大鼠CXCR4、VEGFA、TAK1 表達(dá)水平，分析其作用機(jī)制可能如下：黃芪含有黃酮類化合物、多糖類、氨基酸、三萜類化合物等活性成分，不僅可通過抑制VEGFA 而減少結(jié)腸組織血管供應(yīng)，還可通過抑制TAK1 信號(hào)通路而減輕結(jié)腸組織損傷；紅花含有羥基香豆素、蕓香甙、胡蘿卜素、紅花黃酮等活性成分［17］，對(duì)血管生成過程中關(guān)鍵信號(hào)分子VEGF 和血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達(dá)水平具有調(diào)節(jié)作用［18-19］，可通過下調(diào)VEGF 和VCAM-1 表達(dá)水平而抑制新生血管形成、氧化應(yīng)激反應(yīng)等［20-21］。需要指出的是，由于前期研究已證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)劑量的優(yōu)化潰結(jié)方即具最佳療效，增加劑量不僅不會(huì)明顯提升療效，反而會(huì)增加皮膚發(fā)紅、皮疹等不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［7-12］，因此本研究不再進(jìn)一步探討優(yōu)化潰結(jié)方的劑量問題，更多的是關(guān)注其藥物組成、配伍及作用機(jī)制等，未再設(shè)置加倍劑量組等。

細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)線粒體數(shù)目和核糖體脫顆粒變化可以反映細(xì)胞活性與活力變化。一般情況下，細(xì)胞能量代謝減弱或細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致線粒體數(shù)目減少或結(jié)構(gòu)破壞，而蛋白質(zhì)合成減緩或停止則會(huì)導(dǎo)致核糖體脫顆粒。因此，通過透射電鏡觀察結(jié)腸組織線粒體數(shù)目和核糖體脫顆粒變化可用以評(píng)估和監(jiān)測(cè)腸黏膜損傷情況。此外，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)高爾基體的主要功能是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾和分泌，高爾基體囊膜輕度擴(kuò)張可能是細(xì)胞負(fù)荷過大或發(fā)生某些病理變化的表現(xiàn)，常見于蛋白質(zhì)分泌增加、感染或缺氧等。本研究結(jié)果顯示，造模后第15 天模型組大鼠腸上皮細(xì)胞中重度水腫，細(xì)胞器豐富、明顯腫脹；微絨毛局部稀疏、紊亂、大量缺失，部分明顯腫脹；細(xì)胞間緊密連接及中間連接結(jié)構(gòu)不明顯，未見明顯橋粒結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隙明顯增加，腸屏障結(jié)構(gòu)異常，提示UC 氣滯血瘀模型大鼠造模成功；低劑量組、標(biāo)準(zhǔn)劑量組大鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)趨于正常，但存在不同程度的腸屏障結(jié)構(gòu)受損；益氣組大鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)中存在線粒體損傷，但活血組大鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)線粒體損傷，分析其原因如下：黃芪活性成分黃芪素等可能會(huì)誘發(fā)線粒體損傷，而紅花活性成分具有抗氧化、抗炎和保護(hù)細(xì)胞膜等作用，優(yōu)化潰結(jié)方中同時(shí)使用黃芪、紅花，在保證療效的前提下減少了對(duì)線粒體的損傷，配伍科學(xué)、合理，安全性較高。

中醫(yī)理論認(rèn)為，氣血是人體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。《血證論》陰陽水火氣血論有言：“人之一身，不外陰陽，而陰陽二字，即是水火，水火二字，即是氣血”?！夺t(yī)林改錯(cuò)》［21］中有言：“治病之要訣，在明白氣血，無論外感、內(nèi)傷，要知初病傷人何物，不能傷臟腑，不能傷筋骨，不能傷皮肉，所傷者無非氣血?！痹赨C 等胃腸疾病治療過程中，中醫(yī)重視調(diào)暢氣血，常會(huì)在具有活血化瘀功效的方劑（如血府逐瘀湯、膈下逐瘀湯）中加用一些補(bǔ)氣行氣之品，如當(dāng)歸、黃芪、黨參、甘草、白術(shù)等，也會(huì)在具有益氣功效的方劑中加用一些活血化瘀之品，如桃仁、紅花、乳香、沒藥、蒲黃、五靈脂、麝香、赤芍、丹皮等。腸道免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，有研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞分化和免疫球蛋白A 的生成，進(jìn)而增強(qiáng)腸道屏障功能，保護(hù)腸道黏膜免受有害物質(zhì)、細(xì)菌等的侵襲［22］；此外，黃芪多糖還可以提高小鼠腸道前列腺素E2 含量，進(jìn)而促進(jìn)腸道免疫細(xì)胞生長和增殖［23］。因此，筆者推測(cè)優(yōu)化潰結(jié)方中的益氣組分具有調(diào)理脾胃、增強(qiáng)腸道免疫功能及腸道屏障功能等作用，活血組分具有改善腸道黏膜微循環(huán)、平調(diào)氣血等作用，配伍使用有利于促進(jìn)UC 患者結(jié)腸組織損傷及腸上皮細(xì)胞的修復(fù)，益氣組分與活血組分具有一定協(xié)同增效作用。

綜上所述，優(yōu)化潰結(jié)方及其益氣、活血組分可有效降低UC 氣滯血瘀模型大鼠結(jié)腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 表達(dá)水平，其治療作用可能是益氣組分、活血組分通過協(xié)同調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中CXCR4、VEGFA、TAK1 表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的。目前優(yōu)化潰結(jié)方的具體化學(xué)成分尚未完全明確，需要進(jìn)一步探索，而隨著近年來對(duì)腸道菌群與腸道炎癥、腸道屏障功能關(guān)系的研究深入，優(yōu)化潰結(jié)方對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用也是未來研究方向之一，并有可能為深入了解其治療作用及作用機(jī)制研究等提供新的思路。

作者貢獻(xiàn)：張帥、李娜提出研究目標(biāo)，負(fù)責(zé)研究的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)收集與論文撰寫；沈江立、柳越冬、吳憲樹、王磊、盛天驕負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計(jì)分析；徐紅俊負(fù)責(zé)文章的審校；張帥、李娜、安勝軍負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制與審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。