氚標(biāo)記化合物在放射生物學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用中的研究進(jìn)展

劉芬菊

蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院，放射醫(yī)學(xué)與輻射防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215123

氚標(biāo)記化合物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，如3H 標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine,3H-TdR）在淋巴細(xì)胞輻射效應(yīng)中生物大分子損傷的早期研究[1]、H3標(biāo)記的生物大分子用于研究物質(zhì)在體內(nèi)的代謝、擴(kuò)散、交換等。此外，氚還被用于標(biāo)記放射性化合物，追蹤某些生物分子的行蹤和代謝，以及新藥的藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)的研究[2]。通過上述方法能獲取藥物在生物體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測量生物吸收利用度、器官與組織分布，計(jì)算排泄的速度與途徑等數(shù)據(jù)資料，因此氚在新藥研發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用。應(yīng)用氚標(biāo)記方法還可以檢測機(jī)體免疫功能，觀察輻射后的生物效應(yīng)和藥物治療后的療效等[3-4]。

1 氚標(biāo)記化合物的合成方法

1.1 氚標(biāo)記化合物的化學(xué)合成法

氚標(biāo)記化合物的化學(xué)合成法包括直接化學(xué)合成法和生物化學(xué)合成法。直接化學(xué)合成法是以氚氣、氚水或金屬氚化物為原料，通過催化還原、氚-鹵取代等反應(yīng)來制備氚標(biāo)記化合物。其優(yōu)點(diǎn)是可以制取定位的和近于無載體的氚標(biāo)記化合物，反應(yīng)副產(chǎn)物少，產(chǎn)品易于純化；其缺點(diǎn)是有時(shí)化學(xué)合成步驟多，產(chǎn)品的化學(xué)和放射化學(xué)回收率低，難以制備多種復(fù)雜的天然產(chǎn)物和生物聚合物的氚標(biāo)記化合物，在分子重排和同質(zhì)異構(gòu)現(xiàn)象中容易出現(xiàn)氚標(biāo)記的轉(zhuǎn)移。而生物化學(xué)合成法是以氚標(biāo)記有機(jī)化合物或含氚無機(jī)化合物為作用物，利用特異酶反應(yīng)和非特異反應(yīng)來制備所需的氚標(biāo)記化合物[5]。由于其他氚標(biāo)記方法如非合成法能比較容易地獲得所需的氚標(biāo)記化合物，所以生物化學(xué)合成法對于制備氚標(biāo)記化合物來說，不如制備其他標(biāo)記化合物的應(yīng)用廣泛。

1.2 氚標(biāo)記分子化合物

氚標(biāo)記分子合成法是生物活性化合物結(jié)合和代謝特性的重要工具，特別是在藥物研發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用[6]。用T2氣體直接氚化惰性C-H 鍵是一種理想的氚標(biāo)記方法，但在標(biāo)記新藥化合物時(shí)，對具有不同官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜分子的直接氚化仍有很大的差距。特別是鈀（Ⅱ）C-H 活化化學(xué)在T2氣體氚化反應(yīng)中的應(yīng)用。與現(xiàn)有的氚化方法相比，這種氚化反應(yīng)實(shí)際的轉(zhuǎn)化顯示出新的底物范圍和更大的官能團(tuán)耐受性，并且已被應(yīng)用于直接氚化多種復(fù)雜藥物和未受保護(hù)的二肽。因此分離的氚標(biāo)記產(chǎn)物的比活性大，超過了應(yīng)用于分子相互作用和代謝研究的特殊要求。氚標(biāo)記的化合物合成包括以下5 類：芳烴、雜環(huán)、類固醇、手性化合物、多肽/蛋白質(zhì)。上述化合物均可以通過氚標(biāo)記氨基酸來實(shí)現(xiàn)，也可通過寡核苷酸、抗體藥物共軛物及其連接物的合成等，或者通過共價(jià)鍵結(jié)合的方法，用氚標(biāo)記生物大分子。同時(shí)，Pony 等[2]報(bào)道了一種鐵催化的藥物分子氚標(biāo)記方法，通過該方法研發(fā)出全新的藥物分子修飾技術(shù)，該修飾技術(shù)已經(jīng)用于抗癌藥物的研發(fā)和評估。

2 氚標(biāo)記化合物的應(yīng)用

2.1 氚的DNA 合成代謝作用

2.1.1 氚摻入的DNA 分子生物效應(yīng)

（1） DNA 合成的原理

DNA 合成是細(xì)胞分裂的物質(zhì)基礎(chǔ)，正常DNA 的合成有2 條途徑：一是主要途徑，即由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成；二是輔助途徑，即在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。在電離輻射作用下，DNA 合成途徑受到影響。在體外實(shí)驗(yàn)研究中，將3H-Urd 注入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過24 h 測量3H-TdR 摻入DNA 分子的量，從而了解其代謝產(chǎn)物的改變。氚標(biāo)記化合物廣泛應(yīng)用于新藥的藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)研究，其能提供藥物在生物體內(nèi)的物料平衡、生物吸收利用度、器官與組織分布、排泄的速度與途徑等數(shù)據(jù)資料，在新藥研發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。

除此之外，使用3H-TdR、3H-尿氨酸（3H-Urd）、3H-亮氨酸（3H-Leu）作為培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生物合成的前體物質(zhì)，不同劑量照射后經(jīng)過一定時(shí)間的培養(yǎng)，檢測其摻入到生物大分子的每分鐘放射性計(jì)數(shù)，從而得出生物大分子合成的百分率，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明生物大分子合成隨照射劑量的增加而逐漸降低[9]。進(jìn)一步DNA 摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電離輻射及異三尖杉酯堿對生物大分子的合成具有明顯地抑制作用[5]。

（2） DNA 損傷與修復(fù)

電離輻射可以導(dǎo)致細(xì)胞DNA 分子損傷，其損傷包括DNA 鏈的斷裂、堿基的損傷、氫鍵的斷裂等。損傷后的DNA 在一定條件下會(huì)得到修復(fù)。蘇燎原研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用3HTdR 摻入方法，將外周血淋巴細(xì)胞輻照后置于 37 ℃培養(yǎng)箱中保溫 30 min，測量發(fā)現(xiàn)DNA 雙鏈斷裂比例上升，說明經(jīng)過保溫后可重接 DNA 單鏈斷裂，在保溫 30 min 時(shí) DNA 修復(fù)達(dá)到高峰[1,3-4,8-10]。這一研究結(jié)果表明，細(xì)胞受照后在一定條件下DNA 單鏈斷裂可得到大部分修復(fù)。DNA 損傷修復(fù)包括光復(fù)合修復(fù)、酶的修復(fù)等。其修復(fù)程度取決于細(xì)胞輻射效應(yīng)的大小，反映出不同細(xì)胞的敏感性的差異，因此不同細(xì)胞修復(fù)能力的差異會(huì)增加對輻射的耐受性。在DNA 損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)中研究者還發(fā)現(xiàn)，在淋巴細(xì)胞受照射后40 min DNA 單鏈斷裂大部分已經(jīng)重接[10]。

2.1.2 氚標(biāo)記化合物用于DNA 合成的測定

DNA 合成是一個(gè)生命體進(jìn)化和繁殖的重要過程，是細(xì)胞分裂、遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。RNA 是在DNA 的模板基礎(chǔ)上合成的，其又決定了蛋白質(zhì)的合成，因此細(xì)胞內(nèi)3 種大分子的合成代謝相互聯(lián)系、相互制約[11]。在新藥研發(fā)、職業(yè)因素、電離輻射等環(huán)境因素的作用下，均會(huì)對細(xì)胞的生長分裂產(chǎn)生影響。首先影響的是細(xì)胞DNA 的合成能力下降，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。所謂DNA 合成抑制，是在DNA合成過程中受到阻滯，造成DNA 合成能力的下降。所以，一旦DNA 無法合成新的鏈，只能停留在G1 期，當(dāng)原來的G2 期細(xì)胞分裂完成后，也不能及時(shí)合成新的DNA 分子。因此，通過氚標(biāo)記化合物的檢測方法可判斷各種因素作用下引起的DNA 合成能力的改變。早在20 世紀(jì)60 年代初，原蘇州醫(yī)學(xué)院放射生物學(xué)科研人員就應(yīng)用同位素標(biāo)記生物大分子的實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究了各種因素對細(xì)胞DNA 合成的抑制作用，如電離輻射對淋巴細(xì)胞各亞群DNA 合成的抑制，不同劑量照射后可降低細(xì)胞DNA 的合成能力等[9]。

2.2 氚標(biāo)記化合物在蛋白質(zhì)標(biāo)記中的作用

在生命科學(xué)及生物學(xué)研究領(lǐng)域中，氚標(biāo)記化合物是必不可少的研究工具。其不僅可以應(yīng)用于酶的功能、作用機(jī)制和分析等，還可用于細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、受體結(jié)合及氚標(biāo)記甘氨酸等的研究中，也可在不同時(shí)期檢測放射性核素的位置及蛋白質(zhì)合成的過程。通過氚標(biāo)記化合物，可觀察到蛋白質(zhì)合成在細(xì)胞質(zhì)中的完成情況，早期的研究測量氚標(biāo)記的亮氨酸（3H-Leu），可以追蹤蛋白分子的分布、反應(yīng)和代謝過程，亦可分析得到其在核糖體中形成多肽鏈的量[12]，從而解釋生物系統(tǒng)中亮氨酸的行為和功能。

氚標(biāo)記化合物是用放射性核素氚取代化合物中穩(wěn)定同位素氫，在蛋白質(zhì)標(biāo)記中，用N-琥珀酰亞胺[2-3]、3H 丙酸酯標(biāo)記 IgG、過氧化氫酶和乙酰膽堿酯酶獲得[13]。該方法簡單、方便、易于操作，反應(yīng)條件溫和，可廣泛用于標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽及其他含有游離氨基分子的研究中。除此之外，氚標(biāo)記甘氨酸還用于蠶體蛋白質(zhì)摻入實(shí)驗(yàn)的研究，結(jié)果顯示蠶體蛋白質(zhì)的氨基酸組成中甘氨酸含量較高，約占15%，這表明應(yīng)用放射性同位素氚標(biāo)記甘氨酸摻入法對揭示家蠶蠶體蛋白質(zhì)的生理生化機(jī)制具有重要的作用。

2.3 氚標(biāo)記化合物在放射生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用

氚標(biāo)記化合物在放射生物學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。其主要原因是由于氚標(biāo)記化合物合成的成本相對較低，且更容易獲得[14]，因此其可以為反應(yīng)性代謝物的形成提供早期評估的重要工具，而反應(yīng)性代謝物的形成被認(rèn)為與特殊的藥物不良反應(yīng)有關(guān)，在放射生物學(xué)領(lǐng)域的研究中具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、放射免疫學(xué)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、新藥的篩選及腫瘤的診斷和治療學(xué)的研究中，氚標(biāo)記化合物是不可缺少的應(yīng)用工具[15-16]。除此之外，3H-雌二醇-17β-葡萄糖醛酸還可用于有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OATP1B1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)[17]。另外，生活在相同環(huán)境中的群體，其各種疾病的發(fā)病率差異很大，說明一個(gè)人的遺傳背景及對癌的易感性各異，而易感性本身又與DNA 修復(fù)有著密切的關(guān)系，DNA 及其序列的完整性在生命全過程中起著十分重要的作用，任何損傷DNA 的物質(zhì)都具有潛在致癌和致基因突變的危險(xiǎn)，無論何種原因引起的DNA 損傷，都可以通過酶系統(tǒng)的作用進(jìn)行非順序合成。氚標(biāo)記化合物的方法可以評價(jià)DNA 和RNA 合成能力等。由此可見，DNA 修復(fù)能力高低可有效地反映個(gè)體的免疫功能，以及是否處于疾病易感狀態(tài)。

Loh 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，一種光氧自由基介導(dǎo)的氫原子轉(zhuǎn)移方法，可以有效選擇性利用同位素標(biāo)記的水作為氫同位素的來源，將氘和氚采用一步法摻入至α-氨基sp3 碳?xì)滏I上。多種藥物分子中氘和氚的高摻入，可滿足配體結(jié)合分析、吸收、分布、代謝和排泄研究的要求，有益于藥物的篩選。

由于氚發(fā)射的β 粒子在水介質(zhì)中傳播距離＜8 μm，是有限距離傳播，只有結(jié)合的放射性配體足夠靠近才會(huì)激活閃爍劑，而引起光發(fā)射，因此無需分離即可直接進(jìn)行測量。單光子吸收法（SPA）是高通量抑制劑的篩選重要工具，并且已成功用于不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能表征的分析，如對于L-[3H]精氨酸或D-[3H]葡萄糖與固定在氟微球（包含閃爍劑）上的受體蛋白結(jié)合進(jìn)行測定[19]等。

除此之外，在氚標(biāo)記化合物的研究中，還可通過氫同位素交換氚標(biāo)記藥物的鐵催化方法。將鐵催化劑的位置選擇性地與目前使用的銥催化劑相互交換，并且允許對藥物分子中的互補(bǔ)位置進(jìn)行同位素標(biāo)記，為藥物研發(fā)提供了一種新的評價(jià)工具[2]。氚標(biāo)記的分子也可用于闡明生物活性化合物結(jié)合和代謝的特性，在新藥的研發(fā)過程中可以發(fā)揮重要作用[20]。

3 小結(jié)與展望

早在20 世紀(jì)60 年代初，氚標(biāo)記化合物的方法就用于淋巴細(xì)胞輻射生物效應(yīng)及藥效學(xué)的研究領(lǐng)域，放射性核素標(biāo)記TdR 的方法常用于研究細(xì)胞及動(dòng)物整體照射后細(xì)胞周期和DNA 合成能力改變的實(shí)驗(yàn)研究，氚標(biāo)記在體外細(xì)胞、分子及蛋白質(zhì)水平的研究中發(fā)揮著重要作用。臨床腫瘤患者放療前后免疫功能的恢復(fù)驗(yàn)證也應(yīng)用氚標(biāo)記技術(shù)[3-4]。隨著生命科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和生物工程的發(fā)展，氚標(biāo)記核酸的制備有助于研究其在動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布、代謝以及排泄的機(jī)制，為新藥的研制提供藥理及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)[21-22]。

目前，氚標(biāo)記化合物3H-TdR 摻入實(shí)驗(yàn)已廣泛用于多種生物DNA 合成能力的測定，判斷生物體損傷程度及細(xì)胞的增殖能力、自然殺傷細(xì)胞（NK）活性和轉(zhuǎn)化程度的變化[23-24]。根據(jù)細(xì)胞的放射性活度測出標(biāo)記化合物的摻入率，該摻入方法對于研究活細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA 和蛋白質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)過程具有簡便、迅速、直觀、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以免除對DNA、RNA、蛋白質(zhì)分離提純及定量測定等復(fù)雜過程。未來氚標(biāo)記化合物在醫(yī)學(xué)及放射生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用會(huì)更加廣泛，亦為氚的醫(yī)學(xué)防護(hù)提供重要的理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。