落葉松-楊柵銹菌MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白互作關(guān)系初探

楊 冰,陳凱玥,李子曄,周顯臻,于 丹

(西北農(nóng)林科技大學 林學院,陜西 楊陵 712100)

微小染色體維持蛋白(minichromosome maintenance protein,MCM)是AAA ATPase大基因家族中一類獨特的亞群[1]。MCM蛋白在真核生物中高度保守,典型的MCM基因家族包括6個成員,即MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7,它們通常形成異源六聚體復合物[2]。MCM蛋白具有ATPase結(jié)構(gòu)域,也稱作MCM box,其中含有所有MCM蛋白具有的3個保守基序。第1個Walker A,對應MCM特異的序列GDPXX(S/A)KS;第2個Walker B,序列為IDEFDKM;第3個R-finger,序列較短,SRFD[1,3]。所有真核MCM蛋白具有鋅結(jié)合基序,具體序列因蛋白類型有一定差異[1]。在釀酒酵母中,MCM基因家族在DNA復制起始過程發(fā)揮重要作用,并且以0.4 M NaCl處理細胞10 min作為外源滲透壓脅迫,使用免疫共沉淀技術(shù)檢測HOG1蛋白是否與各種復制復合體組分相互作用,最終發(fā)現(xiàn)HOG1能夠與MCM4、CDC45、PSF2、DPB2及CDC7互作[4-5]。

在真菌中,MCM4基因的研究主要集中在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)兩大系統(tǒng),也被分別稱為CDC54和CDC21[1]。付靜等[3]在全基因組水平上鑒定了植物病原真菌葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)MCM基因家族成員,并分析了其對硫化物脅迫的響應特征,為闡明韭菜及其主要成分對蘋果輪紋病的防控機理提供了理論依據(jù)。專性寄生真菌落葉松-楊柵銹菌(Melampsoralarici-populina)能夠侵染楊樹引起楊樹葉銹病,該病害廣泛分布于世界各楊樹栽培區(qū),在我國對楊樹用材林和防護林的安全生產(chǎn)造成嚴重影響[6]。落葉松-楊柵銹菌MCM基因家族的研究目前尚未見報道。前期研究推斷MlpHOG1基因參與落葉松-楊柵銹菌侵染菌絲生長擴展和響應環(huán)境脅迫等生命活動[7-8]。本研究通過鑒定落葉松-楊柵銹菌標準菌株MCM基因家族成員和系統(tǒng)發(fā)育分析,從而確定MCM4候選基因,進而同源克隆獲得中國菌株MlpMCM4基因的CDS片段,并對目的蛋白的基本特征進行預測分析,最后借助2種技術(shù)分析目的蛋白與MlpHOG1蛋白的相互作用情況,為后續(xù)明確目的蛋白與MlpHOG1蛋白的互作關(guān)系提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

1.1.1 試驗材料 落葉松-楊柵銹菌中國菌株wh03為單孢菌系[9],使用太白楊(Populuspurdomii)在溫室進行人工擴繁,根據(jù)曹支敏等[10]的方法進行菌株的活化及保存。酵母雙雜交載體pDHB1、pPR3-N、pDHB1-largeT和pDSL-ΔP53以及熒光素酶試驗載體pCAMBIA1300-CLuc、pCAMBIA1300-NLuc分別由西北農(nóng)林科技大學植物保護學院劉慧泉教授和康振生教授實驗室惠贈。大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購自北京擎科生物科技有限公司。酵母感受態(tài)細胞NMY51和農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Phusion Plus DNA聚合酶和Taq酶購自Thermo Scientific公司;高保真聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase公司和Clon Express Ⅱ One Step Cloning Kit購自Vazyme;pMD19-T載體購自TAKARA公司;SC/-Leu/-Trp Broth、SC/-Ade/-His/-Leu/-Trp Broth和X-gal購自北京酷來搏科技有限公司;D-熒光素鉀鹽購自上海笛醫(yī)生物科技有限公司。引物序列合成和大腸桿菌轉(zhuǎn)化子測序在北京奧科鼎盛生物科技有限公司(楊陵分部)完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 候選基因分析 從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載MCM基因家族模型數(shù)據(jù)(PF00493),通過hmmer軟件在供試真菌(表1)全體蛋白序列中搜索鑒定,提取鑒定到的序列并在NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)中比對,從而去除不存在MCM(PF00493)保守結(jié)構(gòu)域的序列。將通過篩選的蛋白序列用軟件MEGA7.0對齊,用gblocks提取保守序列。最后,用iqtree構(gòu)建最大似然法(Maximum likelihood)樹,設(shè)置“-m”參數(shù)調(diào)用ModelFinder獲得氨基酸序列的最佳替代模型,設(shè)置“-b 1 000”采用1 000次重復計算的常規(guī)自展檢驗法(Bootstrap)對分支可靠性進行評估。生成的樹文件使用MEGA7.0軟件查看。

表1 參與MCM基因家族鑒定的物種Table 1 Species used in the phylogenetic analysis of the MCM family

1.2.2 目的基因克隆 用Rneasy Plant Mini Kit試劑盒提取落葉松-楊柵銹菌夏孢子總RNA,消解基因組DNA后用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成第一鏈cDNA。根據(jù)落葉松-楊柵銹菌標準菌株98AG31(v1.0)[11]中Protein ID 48743的基因序列,利用軟件Primer Premier 5設(shè)計特異性擴增引物48743-uF1和48743-uR2(表2)。PCR 反應總體系50 μL,其中cDNA模板1.5 μL,10 μM上下游引物各2.5 μL,2×Phusion Plus PCR Master Mix 25 μL,ddH2O 18.5 μL。擴增程序:98 ℃預變性30 s;98 ℃變性7 s,60 ℃退火10 s,72 ℃延伸1 min 25 s,35個循環(huán);72 ℃延伸 5 min,16 ℃保存。擴增完成后,在PCR產(chǎn)物中加入0.5 μLTaqDNA聚合酶和0.5 μL dNTP,72 ℃延伸30 min,16 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物,然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化目的片段,再連接至pMD19-T載體骨架,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,PCR檢測篩選后將陽性轉(zhuǎn)化子送公司測序。

1.2.3 目的基因編碼蛋白生物信息學分析 利用在線軟件ProtParam預測和分析目的基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)。使用軟件Clustalx1.83對供試蛋白序列進行多序列比對,然后使用GeneDoc軟件進行查看。使用SOPMA在線工具預測目的基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)。借助3種在線軟件EuK-mPLoc 2.0、WOLFPSORT和PROTCOMP預測分析目的蛋白的亞細胞定位區(qū)域。

1.2.4 酵母雙雜交 使用高保真聚合酶擴增目的片段,擴增引物見表2。NcoⅠ單酶切pDHB1載體,BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切pPR3-N載體。用重組克隆試劑盒,將MlpMCM4(wh03)基因片段和MlpHOG1(wh03)基因片段分別連接至pDHB1載體質(zhì)粒和pPR3-N載體質(zhì)粒,測序確認后獲得bait載體pDHB1-MlpMCM4和prey載體pPR3-N-MlpHOG1。將獲得的重組載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細胞NMY51,觀察30 ℃條件下整合外源片段的酵母轉(zhuǎn)化子在缺陷培養(yǎng)基SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His-Ade上培養(yǎng)3 d的生長情況,并檢測以X-gal為反應底物時能否發(fā)生藍色反應。其中pDHB1-largeT與pDSL-ΔP53共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化子為陽性對照,pDHB1-largeT與pPR3-N共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化子為陰性對照,pDHB1-MlpMCM4與pPR3-N共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化子為自激活組。

1.2.5 螢火蟲熒光素酶互補試驗 使用高保真聚合酶擴增目的片段,擴增引物見表2。KpnⅠ和SalⅠ酶切空載體pCAMBIA1300-CLuc和pCAMBIA1300-NLuc。用重組克隆試劑盒將目的基因片段分別連接至載體骨架,測序確認后獲得重組載體pCAMBIA1300-CLuc-MlpMCM4和pCAMBIA 1300- NLuc-MlpHOG1。選取生長3～4周、長勢良好的本氏煙(Nicotianabenthamiana)作為煙草瞬時表達系統(tǒng)的材料。將獲得的重組載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101,參考Chen等[12]的方法進行菌液處理,在煙草葉片上分別注射不同的菌液組合。2 d后在每個接種點均勻涂抹D-熒光素鉀鹽溶液,室溫黑暗靜置5 min。在多光譜動態(tài)熒光顯微成像系統(tǒng)(PlantView 100)中觀察其注射煙草葉片區(qū)域是否有熒光出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選基因的確定

借助hmmer軟件將下載獲得的MCM基因家族模型數(shù)據(jù)在10個供試物種的蛋白序列中進行搜索鑒定,共獲得65條序列。其中2個基因序列太短,不具有保守結(jié)構(gòu)域,進而使用63條序列構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)進化樹,結(jié)果表明,進化樹具有6個分支,分別代表MCM基因家族的MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6和MCM7(圖1)。ID 48743(v1.0)為釀酒酵母MCM4基因在落葉松-楊柵銹菌標準菌株98AG31中的直系同源基因,命名MlpMCM4。

1)物種后的數(shù)字代表在相應物種數(shù)據(jù)庫中的蛋白序號(Protein ID); 2)自展支持率標注于節(jié)點。

2.2 目的基因的克隆

以落葉松-楊柵銹菌中國毒性菌株wh03(圖2A)夏孢子cDNA為擴增模板,根據(jù)ID 48743(v1.0)序列設(shè)計特異引物進行同源克隆,擴增結(jié)果呈現(xiàn)一個較為特異且濃度較高的大小約2.5 kb的條帶(圖2B)。通過TA克隆及測序分析結(jié)果表明,成功獲得wh03菌株ID 48743基因的CDS片段,長度為2 460 bp,將該基因命名為MlpMCM4(wh03)(GenBank OR751401)。

A.落葉松-楊柵銹菌中國毒性菌株wh03接種楊樹葉片后的寄主表型;B.從wh03菌株夏孢子cDNA中擴增MlpMCM4基因片段

2.3 目的基因編碼蛋白特征

使用在線軟件ProtParam分析蛋白理化性質(zhì),結(jié)果顯示MlpMCM4(wh03)基因編碼819個氨基酸,相對分子量90.31 ku。負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為110個,正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為97個,帶負電荷的數(shù)目略多于正電荷。MlpMCM4(wh03) 基因編碼蛋白理論等電點(pI)為5.78,即偏酸性。預測的不穩(wěn)定指數(shù)為44.56,超過40,推測屬于不穩(wěn)定蛋白。

將MlpMCM4(wh03)基因編碼蛋白序列和釀酒酵母MCM4蛋白序列進行比對分析,發(fā)現(xiàn)目的蛋白具有MCM蛋白共有的3個重要基序,即Walker A(GDPXX(S/A)KS)、Walker B(IDEFDKM)和 R-finger(SRFD),還具有MCM4類型鋅結(jié)合基序(CX2CX18CX2-4C)(圖3)。

1)深綠色橫線區(qū)域隸屬釀酒酵母MCM4的MCM box結(jié)構(gòu)域,其中淺藍色橫線表示W(wǎng)alker A、Walker B和 R-finger基序;2)*表示鋅結(jié)合基序。

運用SOPMA在線預測目的蛋白二級結(jié)構(gòu),顯示MlpMCM4 (wh03)蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由4種形式組成(圖4),分別為41.64%的α-螺旋(Alpha helix)、6.23%的β-轉(zhuǎn)角(β-turn)、15.26%的延伸鏈(Extended strand)和36.87%的無規(guī)則卷曲(Random coil),其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要二級結(jié)構(gòu)。

藍色:α螺旋;綠色:β-轉(zhuǎn)角;紅色:延伸鏈;紫色:無規(guī)則卷曲

使用EuK-mPLoc、WOLFPSORT和PROTCOMP這3種在線軟件對MlpMCM4 (wh03)蛋白進行亞細胞定位預測分析。EuK-mPLoc預測目的蛋白定位在細胞核(Nucleus)區(qū)域。WOLFPSORT和PROTCOMP均預測顯示細胞核(Nuclear)區(qū)域數(shù)值明顯高于其他區(qū)域(26/27和8.84)。綜合3種軟件預測結(jié)果,推斷MlpMCM4 (wh03)蛋白定位在細胞核區(qū)域。

2.4 MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白的互作關(guān)系

借助酵母雙雜交技術(shù)分析落葉松-楊柵銹菌MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白是否相互作用。在SD-Leu-Trp培養(yǎng)基上,陽性對照(pDHB1-largeT+pDSL-ΔP53)、陰性對照(pDHB1-largeT+pPR3-N)及自激活組(pDHB1-MlpMCM4+pPR3-N)均能正常生長。在SD-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上,陽性對照正常生長,陰性對照不能生長,自激活組也不能生長;X-gal染色顯示陽性對照變藍,陰性對照沒有變藍,自激活組也沒有變藍(圖5A)。因此,MlpMCM4(wh03)基因編碼蛋白不具有自激活能力。陽性對照、陰性對照及試驗組(pDHB1-MlpMCM4+pPR3-N-MlpHOG1)在SD-Leu-Trp培養(yǎng)基上均能正常生長。在SD-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上,陽性對照正常生長,陰性對照不能生長,試驗組也不能生長;X-gal染色顯示陽性對照變藍,陰性對照沒有變藍,試驗組也沒有變藍(圖5B)。因此,利用本研究中分離泛素酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)MlpMCM4(wh03)基因編碼蛋白和MlpHOG1(wh03)基因編碼蛋白二者不存在相互作用關(guān)系。

A.自激活檢測結(jié)果;B.試驗組檢測結(jié)果

同時,借助螢火蟲熒光素酶互補試驗進行分析。在植物活體熒光成像系統(tǒng)中觀察不同組合煙草葉片注射區(qū)域,陽性對照pCAMBIA1300-CLuc-X與pCAMBIA1300-NLuc-Y共表達的葉片區(qū)域呈現(xiàn)熒光(結(jié)果未報道),3組陰性對照pCAMBIA1300-CLuc+pCAMBIA1300-NLuc、pCAMBIA1300-CLuc-MlpMCM4+pCAMBIA1300-NLuc、pCAMBIA1300-CLuc+pCAMBIA1300-NLuc-MlpHOG1,以及試驗組pCAMBIA1300-CLuc-MlpMCM4+pCAMBIA1300-NLuc-MlpHOG1共表達的葉片區(qū)域都沒有檢測到熒光信號(圖6)。表明該系統(tǒng)中MlpMCM4(wh03)基因編碼蛋白和MlpHOG1(wh03)基因編碼蛋白也不存在相互作用。

圖6 螢火蟲熒光素酶互補試驗分析MlpMCM4蛋白和MlpHOG1蛋白的互作關(guān)系Fig.6 The interaction between MlpMCM4 andMlpHOG1 detected by the firefly luciferase complementary assay

3 結(jié)論與討論

MCM4基因是MCM家族成員之一,一對一比對涉及的序列相似度較高,因此根據(jù)家族模型在全基因組水平鑒定落葉松-楊柵銹菌MCM基因家族成員,進而通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹來確定成員直系同源基因。本研究發(fā)現(xiàn)ID 48743是釀酒酵母MCM4基因的直系同源基因,因此命名為MlpMCM4。同時,也鑒定出其他成員,ID76084是釀酒酵母MCM2基因的直系同源基因,ID34519是釀酒酵母MCM3基因的直系同源基因,ID74054是釀酒酵母MCM5基因的直系同源基因,ID86241、115157和42573是釀酒酵母MCM6基因的直系同源基因,ID95211是釀酒酵母MCM7基因的直系同源基因。這為后續(xù)研究該銹菌MCM基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。本研究使用MCM模型在供試擔子菌和子囊菌中均鑒定到MCM2-7,沒有其他成員如MCM8和MCM9,這與MCM8和MCM9僅存在于高等生物體內(nèi)的報道是一致的[13]。

比對分析顯示MlpMCM4 (wh03)蛋白具有3個保守的亞結(jié)構(gòu)域,即Walker A、Walker B和R-finger,它們與MCM蛋白利用ATP的能力密切相關(guān)[13]。同時,目的蛋白還具有MCM4類型特有的鋅指結(jié)構(gòu)(CX2CX18CX2-4C),研究顯示在許多MCM蛋白中該結(jié)構(gòu)與酵母菌株的存活密切相關(guān)[14-15]。因此,比對預測分析顯示目的蛋白較為保守。大多數(shù)MCM4蛋白還具有一個保守的CDK激酶作用位點(S/T)PX(K/R)[1]。但沒有在目的蛋白中預測出該位點,推斷可能CDK激酶通過新的途徑或者作用復合體其他基因來發(fā)揮作用。釀酒酵母6個MCM蛋白成員在G1期主要集中在細胞核區(qū)域,在S期逐漸從核內(nèi)輸出,到了G2/M期則完全從核內(nèi)排出[16]。本研究亞細胞定位預測顯示目的蛋白定位于細胞核,這與報道具有吻合度,有待于后續(xù)開展相關(guān)試驗進行分析。

落葉松-楊柵銹菌是專性寄生真菌,目前還沒有穩(wěn)定遺傳操作體系,導致致病分子機理研究明顯落后于模式植物病原真菌?；谇捌谘芯窟M展,期望能夠理清落葉松-楊柵銹菌HOG途徑在該病原菌侵染致病和響應脅迫方面的作用機制。釀酒酵母中在外源滲透壓處理下HOG1和MCM4蛋白具有特異的互作關(guān)系[5]。本研究酵母雙雜交系統(tǒng)和螢火蟲熒光素酶互補試驗中,落葉松-楊柵銹菌中國菌株HOG1蛋白和MCM4蛋白沒有表現(xiàn)相互作用,推斷可能因為沒有外源滲透壓刺激。后續(xù)考慮增加外源滲透壓脅迫條件及借助多種互作檢測方法,來繼續(xù)分析2個蛋白的互作關(guān)系。