香辛料體外阻斷NDMA 及清除自由基的研究

陳瑤綿，羅詩(shī)茵，潘子強(qiáng)，李 琳

（1.電子科技大學(xué)中山學(xué)院，廣東中山 528402；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528200）

0 引言

N- 亞硝基化合物（NDMA） 是一類危害性極高的化學(xué)致癌物，流行病學(xué)調(diào)查表明，人類很多癌癥如胃腸癌[1]、食道癌[2]、肝癌[3]等可能與亞硝胺有關(guān)。因此，采用適宜且科學(xué)的方法有效阻斷亞硝胺的生成具有重要的健康效應(yīng)。

目前，雖有不少有關(guān)亞硝胺致癌機(jī)理的研究，但尚無(wú)成熟觀點(diǎn)，有學(xué)者提出自由基反應(yīng)可能與亞硝胺致癌機(jī)理有關(guān)[4]；亞硝酸鹽作為合成亞硝胺的重要前體物質(zhì)之一，有研究認(rèn)為抑制或降低亞硝酸鹽也可阻斷亞硝胺的合成。有研究表明，香辛料具有阻斷亞硝胺生成的效果，但其阻斷機(jī)理尚不明晰。香辛料在食品加工發(fā)揮著獨(dú)特的調(diào)味作用，并因其所含的生物活性物質(zhì)而表現(xiàn)出健康效應(yīng)[5]。因此，確定常見香辛料對(duì)亞硝胺的阻斷效應(yīng)并探討其抑制機(jī)理值得深入開展。

以常見的香辛料（丁香、石榴皮、烏梅、八角、鼠尾草、大蒜及生姜） 為原料，采用不同提取方式（水浸提法、醇浸提法） 對(duì)其活性成分進(jìn)行提取，在體外模擬胃液環(huán)境下，比較不同香辛料提取物對(duì)NDMA 的阻斷率，選出最適宜的提取方法。同時(shí)，通過(guò)香辛料提取液清除亞硝胺的前體物質(zhì)（亞硝酸鹽） 和抗氧化能力探索其可能存在的阻斷機(jī)理。在此基礎(chǔ)上，選擇阻斷率最佳的香辛料進(jìn)行復(fù)配，探索適宜的復(fù)配組合并考查其可能存在的協(xié)同效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八角、丁香、烏梅、石榴皮、鼠尾草、大蒜及生姜，廣東寶元堂藥業(yè)有限公司提供。

試驗(yàn)試劑：鹽酸二甲胺、鹽酸萘乙二胺、α - 萘胺、焦性沒(méi)食子酸、鄰苯三酚、α - 核糖，上海阿拉丁公司提供；鹽酸，廣州化學(xué)試劑廠提供；檸檬酸鈉、碳酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、無(wú)水乙醇、95%乙醇，天津市百世化工有限公司提供；亞硝酸鈉、EDTA，天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供；維C，天津市鼎盛鑫化工有限公司提供；硫酸亞鐵，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；磷酸緩沖液、過(guò)氧化氫，自配。

1.2 儀器與設(shè)備

N-1210B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、NVP-1000 型隔膜真空泵、CCA-1112A 型冷卻水循環(huán)裝置，上海愛朗儀器有限公司產(chǎn)品；HH-6 型恒溫水浴鍋，宏華儀器廠產(chǎn)品；YP6002 型電子天平，衡正電子儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，廣州格盧瑞生命科學(xué)有限公司產(chǎn)品；V1100 型可見分光光度計(jì)，上海三信儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香辛料提取物的制備

參照張強(qiáng)等人[6]的提取方法并略作修改，將各香辛料破碎成粉狀后過(guò)40 目篩，按所選提取溶劑分為水浸提法組和醇浸提法組（見圖1），制得的香辛料提取液質(zhì)量濃度相當(dāng)于100 mg 原藥/ mL。

圖1 香辛料的不同提取方法

香辛料的不同提取方法見圖1。

1.3.2 體外模擬硝化體系的制備和測(cè)定

參考馬驪珍等人[7]的方法，并略作修改，得到下述方法：反應(yīng)體系是10 mL，分為空白對(duì)照組和試驗(yàn)組。吸取1.0 mL 的香辛料提取液至10 mL 具塞試管中，加入0.5 mol/L 檸檬酸鈉- 鹽酸緩沖液5.0 mL， 1 mmol/L 亞硝酸鈉1.0 mL，1 mmol/L 二甲胺鹽酸鹽溶液0.5 mL，檸檬酸鈉- 鹽酸緩沖溶液將反應(yīng)體系定容至10 mL，于37 ℃下水浴反應(yīng)1 h（空白對(duì)照組用1.0 mL 去離子水代替香辛料提取液）。

取1.0 mL 上述反應(yīng)的溶液至玻璃器皿中，加入0.5%碳酸鈉溶液0.5 mL 終止其反應(yīng)，紫外燈下放置15 min（液面距燈約15 cm），取出立即加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸溶液1.5 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的α - 萘胺溶液1.5 mL，用去離子水精確定容至5.0 mL，搖勻，室溫下靜置20 min 顯色，于波長(zhǎng)525 nm 處測(cè)定其吸光度。再測(cè)出空白對(duì)照組的吸光度，空白對(duì)照組為不加香辛料的濃縮液，每組平行測(cè)定3 次。阻斷率的計(jì)算見公式（1）。

式中：A0——空白組的吸光度；Ax——樣品的吸光度。

1.3.3 抑制亞硝胺的當(dāng)量體系的制備和測(cè)定

以維C 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別按照0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，1.8，2.0 mg/mL 的質(zhì)量濃度加入在體外硝化體系，比較不同質(zhì)量濃度維C 抑制亞硝胺的情況并繪制其抑制曲線，建立抑制曲線模型。

1.3.4 清除亞硝酸鹽的體系制備和測(cè)定

參考黃仕彬等人[8]的試驗(yàn)方法并稍作修改：吸取0.2 mL 的7 種香辛料提取液分別加入25 mL 的具塞試管中，先后加入1.0 mL 檸檬酸鈉- 鹽酸緩沖溶液（pH 值為3） 和1.0 mL 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻后放置于37 ℃的恒溫水浴鍋中水浴30 min。取出后立即加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的對(duì)氨基苯磺酸溶液1.0 mL，4 min 后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液0.5 mL，并用去離子水定容到刻度線，混勻放置15 min。用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)546 nm 處測(cè)其吸光度，根據(jù)公式（2） 計(jì)算：

式中：A1——未加香辛料提取液時(shí)亞硝酸鈉的吸光度，即對(duì)照值；

A——加入各香辛料提取液的吸光度。

1.3.5 不同香辛料提取液的抗氧化活性

（1） 不同香辛料清除DPPH 自由基能力的研究。取1.5 mL DPPH（1 mmol/L） 溶液置于具塞試管中，加入1.5 mL 待測(cè)液（去離子水1.3 mL 和1 mg/mL 香辛料提取液0.2 mL），振蕩混勻，室溫避光放置45 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)其吸光度（Ax），空白調(diào)零是體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇1.5 mL 加1.5 mL 去離子水，對(duì)照為1.5 mL DPPH 溶液加1.5 mL 去離子水，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)其吸光度（Ac）。分別以2，1，0.2，0.1 mg/mL 的維C 為參照。樣品液對(duì)DPPH 自由基的清除能力用清除率A*表示。

（2） 不同香辛料清除·OH 能力的研究。運(yùn)用Deoxyribose 篩選法，取1.0 mL 香辛料提取液（質(zhì)量濃度50 mg/mL） 于具塞試管中，加入濃度為5 mmol/L FeSO4·EDTA 混合溶液0.2 mL，再加入0.5 mL α-核糖（10 mmol/L），然后加pH 值7.4 的磷酸緩沖液1 mL，用5 mmol/L H2O2定容至2.9 mL，搖勻開啟反應(yīng)，于37 ℃條件下水浴反應(yīng)1 h 后，取出加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%的TCA 溶液1 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的TBA 溶液1 mL，冷卻后于波長(zhǎng)532 nm 處測(cè)定吸光度Rx，對(duì)照組不加香辛料提取液R'，空白管用磷酸緩沖液2 mL 加去離子水2 mL 調(diào)零。

香辛料提取液對(duì)于·OH 的清除能力用R 表示：

（3） 不同香辛料清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的研究。采用鄰苯三酚自氧法研究超氧陰離子自由基的清除能力，在試管中加入2.8 mL pH 值8.2，50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，其中空白組加0.1 mL去離子水，25 ℃下保溫10 min，取出后加入0.1 mL 10 mmol/L HCl 溶液；對(duì)照組（F'） 加0.1 mL 去離子水，25 ℃保溫10 min，取出后加0.1 mL 鄰苯三酚溶液；樣品組（Fx） 加入0.1 mL 香辛料提取液（50 mg/mL），在25 ℃條件下保溫10 min，取出后加入0.1 mL 鄰苯三酚溶液。

香辛料提取液對(duì)于超氧陰離子自由基（O2-·） 的清除能力用F 表示：

1.3.6 復(fù)配香辛料提取液

綜合香辛料對(duì)自由基、在模擬體系及對(duì)亞硝酸鹽的清除率結(jié)果，確定石榴皮、丁香、鼠尾草和八角4 種香辛料進(jìn)行1∶1 復(fù)配，分別考查復(fù)配香辛料對(duì)NDMA 的阻斷效果及其對(duì)亞硝酸鹽的清除效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 香辛料對(duì)NDMA 的阻斷能力

2.1.1 不同提取方式對(duì)NDMA 的阻斷效應(yīng)

不同香辛料不同提取溶劑的提取液抑制NDMA生成的影響見圖2。

圖2 不同香辛料不同提取溶劑的提取液抑制NDMA 生成的影響

活性物質(zhì)具有不同的溶解性，圖2 比較了不同提取溶劑對(duì)香辛料提取液在NDMA 抑制率的影響。由圖2 可知，石榴皮無(wú)論采用水浸提法還是醇浸提法，對(duì)NDMA 的生成均有較好的阻斷效果（阻斷率＞90%）；鼠尾草、八角和丁香的水浸提液對(duì)NDMA 的阻斷率較高；烏梅、生姜和大蒜等的醇浸提液表現(xiàn)出更好的NDMA 抑制作用。

不同香辛料提取液抑制亞硝胺生成（X±s） 見圖3。

圖3 不同香辛料提取液抑制亞硝胺生成（X±s）

將香辛料用最適的溶劑進(jìn)行提取，比較不同香辛料提取液對(duì)NDMA 的作用。由圖3 可知，7 種香辛料提取液的抑制率均＞50%，其中鼠尾草、丁香、八角和石榴皮4 種提取液均達(dá)到90%以上，石榴皮含有大量的多酚類物質(zhì)，對(duì)于N - 亞硝胺有抑制的作用；八角含有的茴香醛具有抗氧化性，可能抑制NDMA 生成；丁香中含有丁香酚，鼠尾草中含有迷迭香酸、單寧酸等黃酮類化合物，這些活性物質(zhì)可能是抑制NDMA 生成的原因。

2.1.2 香辛料抑制NDMA 的維C 當(dāng)量水平

維C 抑制率曲線及其S 型擬合曲線見圖4。

圖4 維C 抑制率曲線及其S 型擬合曲線

選擇維C 為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定不同質(zhì)量濃度維C對(duì)NDMA 的阻斷能力并建立數(shù)學(xué)模型，得到Logistic擬合曲線為Y=88.37-73.91/(1+X/0.88)(R2=0.973 5)，利用該模型確定不同香辛料在阻斷NDMA 生成方面的維C 當(dāng)量水平。

不同香辛料在阻斷NDMA 的維C 當(dāng)量見表1。

表1 不同香辛料在阻斷NDMA 的維C 當(dāng)量

2.1.3 不同香辛料對(duì)亞硝胺前提物質(zhì)- 亞硝酸鹽的清除效應(yīng)

亞硝酸鹽作為亞硝胺的前體物質(zhì)之一，清除亞硝酸鹽可能是香辛料具有阻斷NDMA 生成的原因。

不同香辛料提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率（X±s）見圖5。

圖5 不同香辛料提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率（X±s）

由圖5 可知，7 種香辛料提取液在體外對(duì)亞硝酸鹽具有不同的清除能力，說(shuō)明香辛料提取液中的活性物質(zhì)均能夠與體系中的亞硝酸根發(fā)生相互作用，清除NDMA 最強(qiáng)的是石榴皮提取液，而清除亞硝酸鹽能力最強(qiáng)的是丁香，清除能力最弱的是生姜。

2.2 不同香辛料對(duì)不同自由基的清除效應(yīng)

自由基是生命活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的一種帶有未成對(duì)電子的基團(tuán)，對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)能的平衡方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，香辛料提取物對(duì)清除自由基有一定作用，如生姜汁對(duì)亞硝胺的合成有顯著的阻斷作用且具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性[9]，還能減少由亞硝胺代謝產(chǎn)生的自由基[10]。姚瑤等人[11]發(fā)現(xiàn)丁香、桂皮和生姜的水浸提物對(duì)于醬牛肉抗氧化能力也較強(qiáng)，其中香辛料水浸提物的總酚含量與抗氧化能力呈正相關(guān)。朱妙琴等人[12]發(fā)現(xiàn)大蒜和生姜提取液在中性或偏酸性條件下對(duì)自由基有一定的清除率。敬小波[13]研究發(fā)現(xiàn)常見的花椒、生姜及丁香均有良好的抗氧化能力。

比較7 種樣品液對(duì)3 種自由基（DPPH·、·OH 、O2-·） 的清除能力.

不同樣品液對(duì)DPPH·的清除能力（X±s） 見表2，不同香辛料提取液對(duì)自由基的清除能力（X±s）見圖6。

表2 不同樣品液對(duì)DPPH·的清除能力（X±s）

圖6 不同香辛料提取液對(duì)自由基的清除能力（X±S）

由表2 可知，7 種香辛料提取液在一定程度上都具有清除DPPH 自由基的效果，其中1 mg/mL 的丁香和石榴皮效果最好，分別為（46.18±0.78） %，（61.46±2.53） %，與0.1 mg/mL 的維C 相當(dāng)。

由圖6 可知，7 種香辛料（50 mg/mL） 對(duì)于生成速度快且壽命短的·OH 具有清除能力，其中生姜和大蒜的醇提液對(duì)于羥基自由基的清除效果最好，清除率分別為87.89%和87.31%；對(duì)于O2-·清除率從大到小依次為鼠尾草＞石榴皮＞丁香＞烏梅＞生姜＞八角＞大蒜（50 mg/mL）。

2.3 復(fù)配香辛料的交互作用

研究發(fā)現(xiàn)，很多天然提取物復(fù)配時(shí)可產(chǎn)生協(xié)同增效作用，因此復(fù)配成為了天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。陳文靜等人[14]發(fā)現(xiàn)花椒、八角、丁香、麻椒及迷香組成的復(fù)配混合液可抑制亞硝胺。馬儷珍等人[7]研究發(fā)現(xiàn)桂皮、柚子皮、八角和花椒提取液在復(fù)配時(shí)阻斷NDMA 的效果明顯。付麗等人[15]研究表明，當(dāng)八角、桂皮和生姜混合液復(fù)配比為1∶1∶2 時(shí)，對(duì)亞硝酸鹽的清除率高達(dá)88.17%。還有研究發(fā)現(xiàn)，花椒與八角按質(zhì)量比1∶2 復(fù)配對(duì)亞硝酸鈉的清除具有協(xié)同增效作用[16]。

將具有阻斷NDMA 生成的4 種香辛料按照1∶1進(jìn)行復(fù)配，考查其阻斷NDMA 生成的效果。

單一及復(fù)配香辛料提取液阻斷效果對(duì)比見圖7。

圖7 單一及復(fù)配香辛料提取液阻斷效果對(duì)比

其中，復(fù)配后的混合提取液對(duì)NDMA 的阻斷效果最好的組合為石榴皮+鼠尾草（1∶1），阻斷率為70.12%?？赏茢喑鰪?fù)配香辛料對(duì)抑制NDMA 生成具有比較理想的效果；4 種香辛料復(fù)配后對(duì)于亞硝酸鹽的清除率均高于單一香辛料，其中清除效果最好的組合是石榴皮+鼠尾草，清除率達(dá)到75.28%。

3 結(jié)論

7 種香辛料提取液在抑制NDMA 生成和清除亞硝酸鹽方面均具有一定的作用，同時(shí)也具有清除自由基的能力；初步的復(fù)配試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，石榴皮和鼠尾草的結(jié)合可能存在協(xié)同增效作用；香辛料阻斷NDMA 生成的機(jī)理尚不明顯，值得進(jìn)一步研究。