蚯蚓驅(qū)動的濱海鹽堿農(nóng)田土壤中多環(huán)芳烴生物降解的機(jī)制研究

吳煒龍，陳藝杰，衛(wèi)婷，楊貴瓊，陽長洪，甄珍，藺中

1. 廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088

土壤鹽堿化已成為全球性農(nóng)業(yè)和環(huán)境問題。中國具有農(nóng)業(yè)利用潛力的鹽堿荒地和鹽堿障礙耕地總面積約為1.33×107hm2（王佳麗等，2011），其中濱海鹽堿障礙耕地面積約1.1×106hm2（胡炎等，2023）。濱海鹽堿障礙耕地是中國重要的耕地資源，其合理的開發(fā)利用對中國的糧食安全具有重大戰(zhàn)略意義（牛東玲等，2002；孫池濤等，2018）。然而，濱海鹽堿障礙耕地鹽分高、物理結(jié)構(gòu)差、肥力水平低。加之，海洋污染和近岸人類活動導(dǎo)致土壤污染越來越嚴(yán)重，嚴(yán)重影響著濱海鹽堿障礙耕地的糧食安全和生態(tài)健康（Yang et al.，2015；Shi et al.，2021）。多環(huán)芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）含有兩個或兩個以上苯環(huán)，具有低溶解、耐熱解和難降解等特性，是典型的致畸、致癌、致突變的“三致”持久性有機(jī)污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）。其主要來源于環(huán)境中的焦?fàn)t廢氣排放、化石燃料不完全燃燒、灌溉污水和海洋原油開采滲漏等（蔡楊等，2021；丁家琪等，2023）。由于高疏水性和脂溶性，邊緣海岸帶中的多環(huán)芳烴很容易被土壤吸附固定，使濱海鹽堿農(nóng)田成為多環(huán)芳烴的重要儲存庫。16 種PAHs 在國際上被列為了優(yōu)先控制的有機(jī)污染物（Hawliczek et al.，2012；Hernández-Veg et al. ， 2017 ； Nzila ， 2018 ；Kariyawasam et al.，2022）。其中，蒽（Anthracene，Ant）作為PAHs 中典型的線性三環(huán)芳烴，自然環(huán)境中降解緩慢，在PAHs 家族中生態(tài)風(fēng)險相對較高。有研究表明，在廣東省許多地區(qū)不同利用方式的濱海鹽堿土壤PAHs 污染相對嚴(yán)重（Dai et al.，2022；Chen et al.，2023；）。且Zhao et al.（2023）研究了湛江灣海域中PAHs，得出PAHs 全年總濃度范圍為5.15—53.7 ng·L-1，這也間接加劇了湛江區(qū)域?yàn)I海鹽堿農(nóng)田土壤PAHs 的污染。因此，尋找一種生態(tài)、環(huán)保、可持續(xù)的技術(shù)促進(jìn)濱海鹽堿農(nóng)田土壤PAHs 的降解具有重要的研究意義。

自然條件下，PAHs 污染土壤中土著微生物的生物降解起主導(dǎo)作用，是PAHs 去除的主要途徑之一（Li et al.，2009）。微生物可以將PAHs 當(dāng)作唯一碳源或與其它有機(jī)質(zhì)進(jìn)行共代謝，轉(zhuǎn)換成生命活動所需物質(zhì)，達(dá)到降解PAHs 的效果（Lu et al.，2011）。然而，在實(shí)際的污染場地中，由于土著微生物“數(shù)量不多、活性不高和降解能力不足”等因素、難以達(dá)到較好的降解效果，導(dǎo)致土壤自凈效果欠佳（Lin et al.，2016a，2016b）。濱海鹽堿農(nóng)田中，鹽脅迫是影響土壤PAHs 降解的關(guān)鍵因素之一（Fernández-Luque?o et al.，2008）。鹽脅迫下土壤中的土著微生物的生長嚴(yán)重受到抑制，降解功能微生物種群結(jié)構(gòu)單一、數(shù)量不高、活性不強(qiáng)，致使PAHs 在濱海鹽堿地土壤中的降解變得更加困難（Wang et al.，2012）。另外，PAHs 易被土壤有機(jī)質(zhì)和團(tuán)聚體等吸附固定，大大降低了其生物有效性和微生物反應(yīng)接觸機(jī)會，更難以被微生物代謝利用（鐘茂生等，2012）。近年來，國內(nèi)外較多研究利用外源物質(zhì)激發(fā)土著微生物的降解效率，比如“添加營養(yǎng)物質(zhì)、表面活性劑”等方法（Bolan et al.，2023），但面臨費(fèi)用高昂、二次污染和可持續(xù)性不高等問題。因此，探尋一種環(huán)境友好、持續(xù)穩(wěn)定的低成本修復(fù)技術(shù)尤為重要。

蚯蚓被稱作“土壤生態(tài)系統(tǒng)工程師”，廣泛分布在世界不同土壤，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)力和繁殖力。蚯蚓習(xí)性等可以改善濱海鹽堿土壤PAHs 生物降解面臨的諸多限制因素。蚯蚓能夠在全鹽量較高的鹽堿土壤中生存（吳文良等，2001），并對土壤PAHs 污染表現(xiàn)出遠(yuǎn)高于微生物的耐性和抗性（潘政等，2020）。蚯蚓挖掘、擾動和吞食土壤，并在消化道和蚓糞中充分混合，增加有機(jī)污染物和土壤微生物間的表面接觸和傳播機(jī)會，進(jìn)而提高污染物的生物有效性。蚯蚓具有極強(qiáng)的分解有機(jī)質(zhì)的能力，在消化有機(jī)物過程中分解產(chǎn)生大量的氨基酸、多糖類和生物酶（Xiang et al.，2006），可為污染物的生物降解提供共代謝碳源，增強(qiáng)土著微生物的數(shù)量和活性。更為關(guān)鍵的是，蚯蚓挖掘可改善土壤通氣透水條件，從而使鹽堿地表層土壤中的鹽分更易淋溶（張濤等，2017），進(jìn)而緩解濱海鹽堿地的關(guān)鍵鹽脅迫障礙因素，改善濱海鹽堿地土壤健康質(zhì)量狀況。大量研究表明，蚯蚓可加速農(nóng)田土壤農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴和鄰苯二甲酸酯等有機(jī)污染物的生物降解（Lin et al.，2018；Lin et al.，2021）。但蚯蚓強(qiáng)化濱海鹽堿農(nóng)田土壤中PAHs 降解的效果和作用機(jī)制研究較少，降解過程中的強(qiáng)化效果主要源于非生物作用還是生物作用有待研究，且關(guān)鍵環(huán)境影響因子和降解功能微生物仍未可知。因此，深入了解蚯蚓對鹽堿土壤PAHs 污染的降解效果和微生物作用機(jī)制，可為豐富和發(fā)展濱海鹽堿農(nóng)田的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自廣東省湛江市麻章區(qū)廣東海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地（21°09′10.07″N、110°18′51.98″E），該基地長期種植海水稻。在不同地塊的4 個角落以及中心點(diǎn)采樣，用土壤采樣器采集表層土（0—20 cm），并將所有地塊所采的土壤混勻，室內(nèi)自然風(fēng)干后除去植物根系和石子等雜物，過20 目篩（孔徑0.85 mm）備用。供試土壤未發(fā)現(xiàn)蒽污染，土壤pH為7.73，有機(jī)質(zhì)含量為25.21 g·kg-1，胡敏素為13.05 g·kg-1，富里酸為2.30 g·kg-1，胡敏酸為1.57 g·kg-1，全鹽量為2.17 g·kg-1。

試驗(yàn)供試蚯蚓為赤子愛勝蚓，購自廣東省元輝蚯蚓養(yǎng)殖場。試驗(yàn)前將蚯蚓馴化，具體方法為：按每50 只放入1 kg 試驗(yàn)土壤中，保持土壤濕度為最大田間持水量的60%，且在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)兩周。試驗(yàn)時選取健壯、大小相當(dāng)、具有環(huán)帶的成年蚯蚓，用無菌水清洗干凈放置于裝有濕潤濾紙的燒杯中。在黑暗培養(yǎng)箱中，室溫25 ℃條件下培養(yǎng)24 h，使其排出體內(nèi)糞便。

蒽為分析純（ALFA，97%，中國醫(yī)藥公司）。用少量甲醇溶解蒽，再用正丁醇定容配制成500 mg·L-1的蒽的正丁醇溶液作為母液，避光保存，其他化學(xué)品均為分析純。

1.2 試供土壤處理與蚯蚓培養(yǎng)

將土壤分為兩個平行處理組，即不做處理的自然土壤（簡稱自然土）和在高壓滅菌鍋121 ℃條件下，滅菌3 h 的滅菌土壤（簡稱滅菌土）。滅菌土用平板劃線法判斷是否滅菌完全（羅舒文等，2020）。

在無菌操作臺上，取滅菌土和自然土各2 kg，分別裝入4 個滅菌的陶瓷盆（上口直徑28 cm、底座直徑18 cm、高度17 cm）中，每個陶瓷盆裝土1 kg，用無菌水將土壤保持在最大田間持水量的60%。通過對比試驗(yàn)前期設(shè)置的不同污染濃度土壤試驗(yàn)效果以及借鑒前人的研究經(jīng)驗(yàn)（井永蘋，2013；史志明，2014；Zhu，2022），土壤中蒽的濃度過低時，無法達(dá)到試驗(yàn)效果，過高時則對土壤生物存在不可忽略的影響。因此試驗(yàn)土壤中蒽的污染濃度設(shè)置為10 mg·kg-1。具體方法為：取每組少部分供試土壤分別加入20 mL 母液（500 mol·L-1蒽的正丁醇溶液），再采用逐級等份混合法充分混勻，待有機(jī)溶劑充分揮發(fā)后，將其分別拌入各組供試土壤中貼上標(biāo)簽，室溫平衡24 h 后放蚯蚓。試驗(yàn)設(shè)計如下：滅菌對照（SS）、自然對照（OS）、滅菌土壤+15 條蚯蚓（SE）、自然土壤+15 條蚯蚓（OE），每組處理設(shè)置3 個重復(fù)。

每組處理陶瓷盆均用紗布蓋上，放入溫度為25 ℃恒溫培養(yǎng)箱里通風(fēng)避光培養(yǎng)40 d；每天用無菌水補(bǔ)充因蒸發(fā)損失的水分一次，分別于培養(yǎng)第0、10、20、30 天及第40 天時取樣，測定土壤pH、有機(jī)質(zhì)（SOM）和腐殖質(zhì)組分胡敏酸（HA）、胡敏素（HM）和富里酸（FA）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及蒽的含量。在第40 天培養(yǎng)結(jié)束時，取SE、OE 處理組中的蚓糞，將其儲存于-80 ℃冰箱中，用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

采用電位法測定土壤pH（鮑士旦，2000）。將過2 mm 篩的風(fēng)干土樣5.00 g 置于25 mL 燒杯中，并加入12.5 mL 去二氧化碳蒸餾水，充分?jǐn)噭?，使土樣充分分散。靜置2 h 后，取上清液，用校準(zhǔn)后的雷磁pH 計（型號為PHSJ-3F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）測定pH 值。

土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱法進(jìn)行測定。取風(fēng)干土壤0.3 g 置于消煮管中，加入體積分?jǐn)?shù)為98%的硫酸和重鉻酸鉀溶液（0.8 mol·L-1）各5 mL，并在170—180 ℃下消煮5 min。消煮后，冷卻至室溫倒入錐形瓶中，用50 mL 蒸餾水多次沖洗消煮管，并將清洗液轉(zhuǎn)入錐形瓶。加入2—3 滴鄰菲羅啉作為指示劑，用0.2 mol·L-1的硫酸亞鐵滴定至磚紅色，按硫酸亞鐵的用量推算土壤有機(jī)質(zhì)的含量。

參照標(biāo)準(zhǔn)方法（中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007）對土壤中腐殖質(zhì)組分進(jìn)行測定。取10 g 風(fēng)干土樣研磨后過0.149 mm 篩，裝于小廣口瓶中備用。將5 g 土樣置于250 mL 錐形瓶并加入100 mL 浸提劑（均為0.1 mol·L-1的焦磷酸鈉和氫氧化鈉混合液），加塞震蕩5 min 后，用沸水煮1 h。搖勻并用離心機(jī)離心澄清，取上清液于錐形瓶中待測。隨后操作同有機(jī)質(zhì)的測定。

吸取10 mL 浸出液移入液試管中（盛有少量石英），用0.5 ml·L-1硫酸中和pH 為7，使溶液出現(xiàn)混濁為止。用水浴蒸發(fā)至近干，用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定胡敏酸和富里酸總碳。

取40 mL 浸出液移入錐形瓶中，加熱近沸，用0.5 mol·L-1硫酸調(diào)pH 至2—3，出現(xiàn)絮狀沉淀后，用80 ℃水浴保溫半小時，靜置過夜。取細(xì)孔濾紙用0.025 mol·L-1硫酸濕潤，過濾上述清液，再用0.05 mol·L-1硫酸洗滌沉淀多次。用熱的0.05 mol·L-1氫氧化鈉洗滌溶解沉淀，經(jīng)細(xì)孔濾紙過濾移入100 mL容量瓶，用水定容并搖勻。取20 mL 溶液移入試管中，用0.5 mol·L-1硫酸調(diào)到pH 為7，出現(xiàn)渾濁為止。用水浴蒸發(fā)至近干，用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定胡敏酸碳量。

胡敏素含量采用差減法計算。

采取殘?jiān)娓?質(zhì)量法測定（鮑士旦，2000），取過篩風(fēng)干土樣15 g 配置水土比為5∶1 的土壤浸出液，吸取50 mL 土壤浸出液放于烘干的瓷蒸發(fā)皿內(nèi)，在水浴中蒸干。用150 g·L-1的H2O2使殘?jiān)鼭駶?，繼續(xù)蒸干，反復(fù)用H2O2處理，使殘?jiān)珵榘咨?。再將殘?jiān)驼舭l(fā)皿放于105 ℃烘箱中烘干1 h，取出冷卻后稱質(zhì)量。將蒸發(fā)皿和殘?jiān)俅魏娓?.5 h，取出放在干燥器中冷卻稱質(zhì)量。用兩次質(zhì)量計算出土壤水溶性鹽總量。

1.4 土壤中蒽含量的測定及相關(guān)計算

土壤中提取蒽參照姚炎紅等（2016）的方法，采用索氏提取法提取和濃縮。樣品中蒽的含量測定參照代軍帥等（代軍帥等，2018）的方法，用高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity II）測定。測定條件為：Φ4.6mm×250mm C18柱，進(jìn)樣量為10 μL，甲醇（A 相）和超純水（B 相）作為流動相，流速0.6 mL·min-1，色譜柱維持在30 ℃下進(jìn)行色譜分析，分析波長274 nm。配置濃度為50、100、200、500和1 000 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.995。該方法下回收率為82.6%—97.7%，檢出限為4.2 μg·kg-1，（信噪比S/N=3）。

1.5 土壤微生物群落的高通量測序

采用BioFast Soil Genomic DNA Extraction Kit（BIOEER，中國杭州）試劑盒對培養(yǎng)40 d 的不同處理土壤微生物總DNA 進(jìn)行提取，利用核酸蛋白定量檢測儀測定DNA 的濃度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳評價DNA 質(zhì)量。提取的土壤總DNA 利用引物（338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對V3—V4 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×Tap PCR Master Mix 10.0 μL、引物2.0 μL、模板DNA 1.0 μL，超純水（用于將體積補(bǔ)至20.0 μL）。擴(kuò)增條件為：95 ℃下，進(jìn)行3 min 預(yù)變性，再進(jìn)行30 s 變性，隨后55 ℃下進(jìn)行30 s 退火，最后在72 ℃下進(jìn)行45 s 延伸，循環(huán)27 次，最后于72 ℃下進(jìn)行10 min 的延伸。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠回收擴(kuò)增后的產(chǎn)物并進(jìn)行檢測，最后送至美吉測序平臺進(jìn)行測序。使用Flash 軟件對高通量所得數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，過濾拼接得到的序列，再使用Uchime 軟件鑒定并去除嵌合體序列，獲得最終有效數(shù)據(jù)。使用QIIME 軟件對序列在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OUT。所有的OTUs 分類學(xué)注釋在Silva數(shù)據(jù)庫（https://www.arbsilva.de/）平臺完成。使用QIIME 中核糖體數(shù)據(jù)庫獲得科水平上的細(xì)菌群落物種豐富圖。使用QIIME 基于Euclidean 算法得到聚類熱圖。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

蒽的降解效率通過公式來計算：

式中：

E——蒽的降解效率；

A0——第0 天土壤蒽含量（g·kg-1）；

Ai——第i天土壤蒽含量（g·kg-1）；

i——培養(yǎng)時間（d）。

利用SPSS 25.0 對試驗(yàn)理化數(shù)據(jù)（蒽的降解效率、土壤理化性質(zhì)）進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊檢驗(yàn)，并且對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。用Duncan’s 法對不同處理間進(jìn)行多重比較（P＜0.05）檢驗(yàn)不同處理間的顯著差異性。利用Origin 2022 完成環(huán)境因子（pH、有機(jī)質(zhì)等）的柱形圖繪制。以Spearman 和Pearson 為基礎(chǔ)，采用Cytoscape 軟件將微生物、蒽殘留濃度和環(huán)境因子之間的相互作用通過共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下蒽的降解效率

整個培養(yǎng)期內(nèi)，所有處理中土壤蒽的降解效率均呈顯著上升趨勢（圖1）。自然對照（OS）中蒽的降解效率始終高于滅菌對照（SS），添加蚯蚓可顯著提升自然土壤（SE）和滅菌土壤（OE）中蒽的降解效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時（40 d），SS 處理中蒽的殘留濃度最高（8.67 g·kg-1），降解效率僅為17.7%。OS 處理中蒽的殘留濃度為6.29 g·kg-1，降解效率為40.7%。OS 處理中蒽的降解效率比SS 處理中蒽的降解效率高23.0%，表明沒有蚯蚓的自然土壤中蒽的降解以生物降解為主（23.0%），而不是非生物降解（17.7%）。添加蚯蚓可以顯著加速土壤中蒽的降解，自然土壤中添加蚯蚓處理（OE）的蒽的殘留濃度最低為3.94 g·kg-1，降解效率高達(dá)62.1%，滅菌土壤添加蚯蚓處理（SE）的殘留濃度最低為5.27 g·kg-1，降解效率為50.4%。結(jié)果表明：蚯蚓強(qiáng)化非生物降解和腸道菌群作用共同的效果（32.7%）高于蚯蚓強(qiáng)化土著微生物降解的效果（21.4%）。

圖1 不同處理蒽降解效率隨時間的變化Figure 1 Variation of anthracene degradation efficiency with time for different treatments

2.2 土壤理化性質(zhì)在不同處理下的變化

圖2 顯示了土壤pH 值、有機(jī)質(zhì)、富里酸、胡敏酸、胡敏素和全鹽量的在整個培養(yǎng)過程中的變化情況。土壤pH 值（圖2a）在處理SE 和OE 中始終呈下降趨勢，而對照SS 和OS 中土壤pH 值變化不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時（40 d），添加蚯蚓的處理（SE 和OE）土壤pH 值分別為7.52 和7.34，均顯著低于對照SS 和OS（7.77 和7.70）的pH 值（P＜0.05）。添加蚯蚓可以顯著降低土壤的有機(jī)質(zhì)含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時（40 d），自然土壤添加蚯蚓處理（OE）中有機(jī)質(zhì)含量為（19.6 g·kg-1），顯著低于滅菌土壤添加蚯蚓處理（SE）中的有機(jī)質(zhì)含量（21.7 g·kg-1），二者均顯著低于自然和滅菌土壤對照中的有機(jī)質(zhì)含量（25.4 g·kg-1和24.6 g·kg-1）。添加蚯蚓顯著提升了土壤腐殖質(zhì)各組分胡敏素、胡敏酸和富里酸的含量（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，處理OE 中胡敏素、胡敏酸和富里酸的含量分別增加了2.94、0.14 和0.63 g·kg-1，處理SE 中胡敏素、胡敏酸和富里酸的含量分別增加了2.40、0.34 和0.68 g·kg-1。

圖2 不同處理土壤理化性質(zhì)隨時間的變化Figure 2 Variation of soil physicochemical properties with time for different treatments

2.3 不同處理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

在科水平上，將相對豐富度前27 的細(xì)菌科選為優(yōu)勢細(xì)菌科，剩余歸為其他（Others）。從圖3a 中可以看出，在 OS 處理中以 unclassified_p__Acidobacteria、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）、unclassified_c__Betaproteobacteria、unclassified_p__Gemmatimonadetes_d__Bacteria、黃色單胞菌科（ Xanthomonadaceae）、嗜甲基菌科（Methylophilaceae）和環(huán)狀菌科（Cyclobacteriaceae）為主，約占樣品總豐度的38.2%，其中土壤中的假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、伯克氏菌科（ Burkholderiaceae）和氣單胞菌科（Aeromonadaceae）等微生物均占較低的樣品總豐度。在OE 處理中以unclassified_p__Acidobacteria、unclassified_c__Betaproteobacteria、unclassified_p__Gemmatimonadetes_d__Bacteria、伯克氏菌科、黃色單胞菌科和氣單胞菌科為主，約占樣品總豐度的34.7%。與OS 處理相比，OE 處理使伯克氏菌科、氣單胞菌科的豐度分別提高了238%、730%。在蚯蚓糞（SE-cast）中，以叢毛單胞菌科、假單胞菌科、環(huán)狀菌科、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、伯克氏菌科和氣單胞菌科為主，占樣品總豐度的38.3%。圖3b 為不同處理及蚓糞的細(xì)菌科水平微生物群落結(jié)構(gòu)聚類熱圖。其中樣品SE 處理土壤和SE_cast 的微生物群落結(jié)構(gòu)相近，但與OE_cast（蚯蚓糞）、OE處理和OS 處理分離。其中氣單胞菌科、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、伯克氏菌科在OS 處理中的豐度較低，而在OE、OE_cast 中的豐度逐級增加。綜上結(jié)果表明，自然土中土著微生物伯克氏菌科、氣單胞菌科等微生物豐度均比較低，而添加蚯蚓后，改變了土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)以及提升了土壤中土著微生物伯克氏菌科、氣單胞菌科等微生物的豐度。同時蚯蚓腸道中還存在伯克氏菌科、鞘脂單胞菌科、黃桿菌科和氣單胞菌科等腸道微生物，這些微生物通過蚓糞從蚯蚓腸道定植到土壤當(dāng)中，進(jìn)一步的改變了土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度。

圖3 不同處理微生物在科水平上的相對豐度與群落結(jié)構(gòu)Figure 3 Relative abundance and community structure of microorganisms at the family level in different treatments

2.4 蚯蚓影響下環(huán)境因子、土壤微生物及蒽的殘留濃度的相關(guān)性

通過網(wǎng)絡(luò)分析圖（圖4）來探討了土壤中的微生物、環(huán)境因子和土壤中蒽的殘留濃度之間的聯(lián)系。該網(wǎng)絡(luò)圖由17 個節(jié)點(diǎn)（10 種微生物科、蒽殘留濃度和6 個環(huán)境因子）和16 個邊緣組成。網(wǎng)絡(luò)分析圖中顯示，微生物均與蒽的殘留濃度呈負(fù)相關(guān)，其中氣單胞菌科、鞘脂單胞菌科、黃桿菌科和伯克氏菌科與蒽的殘留濃度為顯著負(fù)相關(guān)（P=0.02）。環(huán)境因子中，胡敏酸、胡敏酸和富里酸與與蒽的殘留濃度呈負(fù)相關(guān)，pH、有機(jī)質(zhì)和含鹽量與蒽的殘留濃度呈正相關(guān)，其中pH、有機(jī)質(zhì)與蒽的殘留濃度呈顯著正相關(guān)（P=0.03 和P=0.04）。

圖4 環(huán)境因子、土壤微生物與蒽的殘留濃度間的網(wǎng)絡(luò)分析圖Figure 4 Network analysis diagram of the residual concentration of anthracene among environmental factors,soil microorganisms

3 討論

本試驗(yàn)探討添加蚯蚓對濱海鹽堿土壤中蒽降解效率的影響，以及蚯蚓在PAHs 污染土壤修復(fù)中的作用機(jī)制。在試驗(yàn)第40 天時，不同處理之間蒽的降解效率依次排序?yàn)椋篠S (17.7%)＜OS (40.7%)＜SE(50.4%)＜OE (62.1%)（圖1），表明添加蚯蚓可顯著促進(jìn)濱海鹽堿土壤中蒽的降解（P=0.001）。蚯蚓能夠?qū)τ袡C(jī)污染物產(chǎn)生富集作用，并且挖掘和吞食等生命活動改變土壤理化性質(zhì)、微生物數(shù)量和活性，對蒽在土壤中的降解產(chǎn)生影響。在我們前期的研究結(jié)果證明，蚯蚓通過富集在體內(nèi)的有機(jī)污染物量較少，對污染物總體的去除效果產(chǎn)生的影響較?。↙in et al.，2016b），降解效果主要來源于非生物降解和微生物降解。并且有研究表明，蚯蚓對PAHs 等有機(jī)污染物的富集能力較弱，其體內(nèi)富集量只占去除總量的很少一部分，并不是去除污染物的主要途徑（Ma et al.，1998；井永蘋，2013）。在試驗(yàn)中，蒽進(jìn)入土壤后，與土壤組分容易緊密結(jié)合，限制了蒽在土壤中遷移、傳質(zhì)和衰減（蔣緒洋，2022），降低了蒽的可提取性和生物有效性（Kelsey et al.，1997）。并且，在濱海鹽堿土壤中，微生物的生長由于鹽脅迫的影響受到抑制，使PAHs 在鹽堿土中的微生物降解變得更為困難（Wang et al.，2012）。

在40 d 時，OE 處理和SE 處理的含鹽量分別下降了0.12、0.16 g·kg-1，顯著低于OS 處理和SE處理（P=0.03），說明蚯蚓降低了土壤含鹽量。有研究表明，蚯蚓能夠在含鹽量較高的鹽堿土中存活（吳文良等，2001），具有改良鹽堿地的效果（伍玉鵬等，2013）。這可能是因?yàn)轵球镜纳顒娱g接的促進(jìn)了土壤鹽分自然淋洗的過程（張濤等，2017），以及蚓糞中的Ca2+與土壤中的Na+交換量增加，降低了土壤中Na+含量，進(jìn)而導(dǎo)致土壤全鹽量下降（Oo et al.，2015），與于英釵等（2019）的研究結(jié)果一致。此外，SE 處理中蒽的降解效率比SS 處理提高了32.7%，說明蚯蚓能夠在滅菌條件下促進(jìn)蒽的降解，這主要為蚯蚓強(qiáng)化非生物降解和腸道菌群共同作用的效果。在SE 處理中有機(jī)質(zhì)比SS 處理顯著下降了3.67 g·kg-1（圖2b）（P=0.001），胡敏素、富里酸和胡敏酸分別顯著提升了1.65、0.66 和0.40 g·kg-1（圖2c—e）（P=0.04、P=0.01 和P=0.011）。這主要是因?yàn)轵球靖纳仆寥澜Y(jié)構(gòu)、通氣性和疏水性，使土壤孔隙度變大，增加土壤中的O2含量和濕度（井永蘋，2013），并且促進(jìn)土壤腐殖質(zhì)的形成和富集（張與真等，1981；王慶洲等，2013），使土壤可溶性有機(jī)碳增加（Kalbitz et al.，2006）。而在可溶性有機(jī)碳中含有羧基等活性官能團(tuán)（Zhang et al.，2022），羧基等活性官能團(tuán)被Tian et al.（2023）證明在PAHs的氧化降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。并且Xu et al.（2013）研究發(fā)現(xiàn)土壤中O2、水分的增加，均能增強(qiáng)土壤表層的PAHs 光解。這就表明添加蚯蚓影響土壤中O2含量和水分，并且增加土壤中活性官能團(tuán)的含量，進(jìn)而影響PAHs 在土壤中的非生物降解。在本實(shí)驗(yàn)中，土壤有機(jī)質(zhì)含量與土壤中蒽的殘留濃度呈顯著正相關(guān)（P=0.04）（圖4），表明隨著有機(jī)質(zhì)含量的下降，土壤中蒽的降解效率增加，這很好的吻合了我們的研究結(jié)果。此外，土壤pH 是影響土壤污染物修復(fù)的重要因素。在第40 天時（圖2a），不同處理間的pH 值差異顯著（P=0.001）。OE 處理的pH 比OS 處理下降0.36 個單位，SE 處理的pH比SS 處理下降0.25 個單位。這主要是因?yàn)轵球痉置隗w表粘液等生命活動對土壤的酸堿性起到調(diào)節(jié)作用（Hao et al.，2018；Luo et al.，2022）。蚯蚓可以沉積pH 值較高的土壤顆粒，顯著改變土壤微環(huán)境，中和土壤pH 值（Lin et al.，2016b），提高土壤的保水能力。已有研究表明，PAHs 類污染物在偏中性土壤中具有較高的生物有效性，從而促進(jìn)PAHs 的生物降解（K?stner et al.，1998）。例如，Kim et al.（2005）研究表明，將土壤的pH 值調(diào)整到7.0 后，PAHs 的降解得到了有效的加強(qiáng)，甚至一單位的pH 值變化能使菲的降解效率增加了4 倍。在本實(shí)驗(yàn)中，土壤pH 與土壤中蒽的殘留濃度呈顯著正相關(guān)（P=0.03）（圖4），表明隨著pH 的下降，土壤中蒽的降解效率增加，這很好的吻合了我們的研究結(jié)果。

土壤微生物是有機(jī)物污染土壤修復(fù)的主要因素，在環(huán)境中的PAHs 污染修復(fù)方法主要以微生物降解為主（Jacques et al.，2008；Moscoso et al.，2012）。如圖3b 所示，樣品SE 處理土壤和SE_cast（蚯蚓糞）中的微生物群落結(jié)構(gòu)相近，說明SE 處理中的微生物均為蚯蚓通過排泄定植的腸道微生物，并且其中含有伯克氏菌科、氣單胞菌科和鞘脂單胞菌科等PAHs 降解菌（宋興良等，2010；于瑤瑤等，2015；黃興如等，2016；閆雙堆等，2021），說明蚯蚓能夠通過蚓糞將其腸道中功能微生物定植到土壤當(dāng)中。而OE 處理和OS 處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相近，與OE_cast（蚯蚓糞）具有差異，說明OE 處理中，蚯蚓影響了土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)。其中OE_cast中的微生物豐度相對較高，主要是因?yàn)轵球炯S中富含氮、磷、鉀、微量營養(yǎng)素和酶等（Yadav et al.，2011），促進(jìn)了微生物的生長（Pramanik et al.，2010)，并且蚯蚓糞還會影響土壤微生物的相互作用（Singh et al.，2020；Zhao et al.，2020），進(jìn)而影響到微生物群落結(jié)構(gòu)。在本實(shí)驗(yàn)中，相比OS 處理，OE 處理中的土壤微生物的豐度增加，其中伯克氏菌科、氣單胞菌科等降解菌的豐度分別提高了238%、730%。這主要是因?yàn)轵球靖纳屏送寥拉h(huán)境（袁向華等，2017），以及蚓糞定植的微生物與土著微生物相互作用（Lin et al.，2018），促使土壤中部分微生物的生長繁殖，從而影響土壤微生物群落結(jié)果。并且有研究表明，添加蚯蚓影響了土壤中污染物降解微生物的豐度（潘聲旺，2009），從而促進(jìn)有機(jī)污染物的降解（Lin et al.，2021）。在本試驗(yàn)中，土壤蒽的殘留濃度與伯克氏菌科、氣單胞菌科、鞘脂單胞菌科和黃桿菌呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.02、P=0.03、P=0.02 和、P=0.01），表明隨著伯克氏菌科、氣單胞菌科、鞘脂單胞菌科和黃桿菌豐度的增加，土壤中蒽的降解效率增加，這與我們的研究結(jié)果相符。

4 結(jié)論

1）蚯蚓可以顯著強(qiáng)化濱海鹽堿農(nóng)田土壤中蒽的降解，其中包括強(qiáng)化非生物降解和微生物降解。強(qiáng)化降解效果主要源于土著微生物豐度的提升和蚯蚓腸道微生物的釋放等微生物降解作用。

2）蚯蚓可強(qiáng)化土壤原有降解微生物伯克氏菌科和鞘脂單胞菌科等微生物的豐度，加速土壤蒽的生物降解。蚯蚓通過蚓糞釋放腸道降解菌假單胞菌科、伯克氏菌科和氣單胞菌科，并可定植降解菌假單胞菌科、伯克氏菌科和鞘脂單胞菌科到土壤中，進(jìn)而可加速土壤蒽的生物降解。

3）蚯蚓通過降低土壤pH 值，促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)分解為腐殖質(zhì)等改變環(huán)境因子的作用，間接加速了濱海鹽堿地土壤中蒽的非生物降解。