運輸密度和時間對單環(huán)刺螠保活運輸品質(zhì)的影響

范宏博， 胡丁月， 徐 莉， 孫 浩， 劉 峰， 劉春娥， 張小栓

（1.中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670； 2.中國農(nóng)業(yè)大學工學院，北京 100083）

0 引言

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus），俗稱海腸，是一種經(jīng)濟類海洋無脊椎動物，分布于黃海、渤海泥沙岸潮間帶及潮下帶，其富含必需氨基酸、不飽和脂肪酸和微量元素，具有較高的經(jīng)濟價值[1-3]。

近年來，隨著單環(huán)刺螠養(yǎng)殖產(chǎn)量的提升，勢必對其遠距離運輸技術(shù)提出更高要求。鮮活的水產(chǎn)品更易受到消費者的青睞，然而在運輸過程中，水產(chǎn)品極易受環(huán)境影響出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，進而導致水產(chǎn)動物品質(zhì)降低甚至死亡。環(huán)境影響因素包括運輸溫度、運輸密度、氧氣含量和水質(zhì)等。其中適宜的運輸密度既可以保證運輸質(zhì)量又可以降低運輸成本，高密度運輸雖然可以提高運載量，但在運輸過程中由于個體擁擠碰撞會造成機體損傷，此外動物呼吸產(chǎn)生的大量CO2積累，也容易引起水產(chǎn)生物應(yīng)激反應(yīng)，影響其生理狀況和免疫防御功能[4-6]。TANG S 等[7]監(jiān)測了鮭魚運輸過程中的CO2濃度，闡述了高密度運輸引起CO2積累造成魚的高碳酸血癥。熊梅等[8]通過檢測血清皮質(zhì)醇水平、肌肉質(zhì)構(gòu)特性等指標，研究密度脅迫對草魚的影響，發(fā)現(xiàn)密度脅迫對草魚肌肉質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響。殷述亭等[9]通過觀察大菱鲆在密度脅迫下免疫效果和應(yīng)激指標的變化規(guī)律，提出5 kg/m3為最佳密度。

目前對單環(huán)刺螠?；钸\輸?shù)难芯恐饕性谶\輸時的水質(zhì)條件、溫度及?；顒┑倪\用等方面，而對于運輸密度對單環(huán)刺螠的生理應(yīng)激反應(yīng)的影響研究目前未見報道[10-12]。本研究分析了不同運輸密度和不同時間條件下，單環(huán)刺螠生理應(yīng)激差異及相關(guān)的生理指標變化，以期為緩解低溫?；钸\輸中單環(huán)刺螠的應(yīng)激反應(yīng)、提高產(chǎn)品運輸品質(zhì)等相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

單環(huán)刺螠，平均體長（18.2±1.5）cm，平均體質(zhì)量（100±20）g，購自煙臺九田水產(chǎn)市場；酸、葡萄糖、皮質(zhì)醇、超氧化物歧化酶試劑盒，南京建成生物工程研究所；海水晶，浙江藍海星鹽制品有限公司；三氯乙酸、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、乙二胺四乙酸二鈉、硫代巴比妥酸，天津致遠化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

LS10T 型鹽度計，衡水正旭電子科技有限公司；TGL-16A 型冷凍離心機，北京普析通用儀器有限責任公司；Synergy H1 型多功能酶標儀，BioTek Instruments,Inc；UV7 型紫外可見光分光光度計，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 暫養(yǎng)

將單環(huán)刺螠置于透明塑料箱（84.5 cm×53 cm×51 cm）中暫養(yǎng)24 h。暫養(yǎng)條件：海水鹽度3%、pH 值8、水溫15 °C 左右、避光及持續(xù)充氣，所用海水由海水晶和充分曝氣的自來水配制成的人工海水。

1.2.2 試驗分組

設(shè)置12、24、36、48 和60 h 5 個時間梯度，0 h 為對照組；每一個時間梯度下設(shè)置低密度組、中密度組和高密度組3 個密度組。具體操作：把內(nèi)徑為17.5 cm×7.8 cm×10.5 cm 的聚苯乙烯泡沫箱分為低密度組、中密度組和高密度組，其中低密度組為1 層，中密度組為2 層，高低密度為3 層，每層放置4～6 只單環(huán)刺螠，用硬紙板隔開。根據(jù)泡沫箱內(nèi)徑及單環(huán)刺螠質(zhì)量計算各組密度估計值：低密度組0.5 kg/L、中密度組1.0 kg/L、高密度組1.5 kg/L，每個密度組設(shè)置3 組平行試驗，所有密度組置于4 °C 冰箱中，每2 h 搖晃箱體模擬運輸環(huán)境。

1.2.3 解剖取樣

在相應(yīng)的時間點，將單環(huán)刺螠從泡沫箱中取出，從單環(huán)刺螠背側(cè)肛門端用解剖剪呈直線剪向吻端，將流出的體腔液收集至離心管中，在12 000 r/min 條件下冷凍離心5 min，取上清液即血清，儲存于-80 °C 冰箱，待測。

1.3 檢測方法

葡萄糖、乳酸、皮質(zhì)醇含量及超氧化物歧化酶活力均參考南京建成生物工程研究所試劑盒說明進行測定；丙二醛含量參考GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》；持水力參照王碩等[13]的方法，解剖后取1 g 左右體壁，稱質(zhì)量，用定性濾紙包好，5 000 r/min 冷凍離心10 min 后再次稱質(zhì)量，并按照以下公式計算持水力。

式中m1——所取單環(huán)刺螠體壁離心前質(zhì)量，g

m2——所取單環(huán)刺螠體壁離心后質(zhì)量，g

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個密度組取3 個平行，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”（Mean ± SD）表示，采用Excel2019 進行數(shù)據(jù)處理與作圖，以運輸密度和運輸時間為自變量采用SPSS 21.0軟件進行雙因素方差分析（Two-way ANOVA），Duncan 法比較差異顯著性，顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 運輸密度和時間對單環(huán)刺螠行為的影響

在運輸密度和時間的脅迫影響下，單環(huán)刺螠表現(xiàn)出多種特殊行為變化。脅迫12 h，3 個密度組單環(huán)刺螠體表均呈現(xiàn)粉紅色，并且能夠緩慢蠕動；36 h，3 個密度組單環(huán)刺螠應(yīng)激增強，表現(xiàn)為身體皺縮，個別個體出現(xiàn)分節(jié)現(xiàn)象；60 h 后，單環(huán)刺螠體壁肌肉強烈收縮，體壁較硬，體表顏色變深。低密度組為深紅色，而中密度組和高密度組為不同程度的黑褐色，如圖1 所示。

圖1 運輸密度和時間對單環(huán)刺螠行為的影響Fig.1 Effect of transportation density and time on behavior of Urechis unicinctus

2.2 運輸密度和時間對單環(huán)刺螠生理的影響

2.2.1 持水力

由圖2 可知，初始單環(huán)刺螠持水力89%，隨時間的延長，持水力整體呈下降趨勢，60 h 高密度組持水力最低，為65%。所有時間段，中密度組和高密度組持水力均顯著低于對照組（P<0.05），而低密度組從24 h 開始顯著低于對照組（P<0.05）。不同密度對單環(huán)刺螠的持水力影響也較大，除24 h 外，其余時間點的高密度組受脅迫更為強烈，持水力均顯著低于低密度組和中密度組（P<0.05）。

圖2 運輸密度和時間對單環(huán)刺螠持水力的影響Fig.2 Effect of transportation density and time on water holding capacity of Urechis unicinctus

持水力能直接反映肌肉抑制水分流失的能力，不僅影響肌肉色澤，還與肌原纖維蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和變性程度有關(guān)[14-15]。試驗中在運輸密度和時間的雙重脅迫作用下，單環(huán)刺螠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，體壁肌肉強烈收縮變硬，肌肉內(nèi)的肌原纖維相關(guān)氫鍵、化學鍵和離子鍵斷裂，蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)崩解，疏水基團暴露，肌原纖維蛋白的溶解性下降，蛋白與水分子的相互作用減弱，最終造成水分流失，持水力下降[16-17]。

2.2.2 抗氧化能力

由圖3a 可知，超氧化物歧化酶可有效清除生物有機體內(nèi)的超氧陰離子（O-2）等成分，防御氧自由基對有機體造成損傷[18]。模擬運輸12 h，3 個密度組與對照組相比超氧化物歧化酶活力均未發(fā)生顯著變化。36 h 后各密度組均顯著高于對照組（P<0.05），除了48 h 低密度組與中密度組顯著低于高密度組，36 和60 h 時間下各密度組之間沒有顯著差異（P>0.05），這說明長時間的運輸，時間脅迫對超氧化物歧化酶活力的影響遠超過密度脅迫。

圖3 運輸密度和時間對單環(huán)刺螠抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of transportation density and time on concentrations of superoxide dismutase and malondialdehyde of Urechis unicinctus

丙二醛是生物膜中多不飽和脂肪酸在活性氧自由基攻擊下而引發(fā)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，被廣泛用于氧化應(yīng)激中自由基產(chǎn)生和生物膜氧化損傷程度的評價指標[19-20]。由如圖3b 可知，隨脅迫時間的延長，丙二醛含量呈上升趨勢，48 ～60 h，低密度組、中密度組和高密度組均顯著高于對照組（P<0.05）。0～36 h，3 個密度組之間無顯著差異（P<0.05），說明運輸時間較短時，密度脅迫對丙二醛含量的影響較小。

超氧化物歧化酶和丙二醛在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，可用作單環(huán)刺螠氧化應(yīng)激水平的量化指標[21-22]。AHMAD I 等[23]指出，高密度養(yǎng)殖引起的應(yīng)激反應(yīng)可以增強細胞內(nèi)活性氧的生成。對團頭魴的養(yǎng)殖試驗發(fā)現(xiàn)，隨著飼養(yǎng)密度的增加，丙二醛含量顯著增加[24]。水產(chǎn)動物在應(yīng)對密度和時間脅迫時，機體產(chǎn)生一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，誘發(fā)超氧化物歧化酶活性增強，清除過量的自由基，以降低脅迫對機體的氧化損傷。隨脅迫時間的延長，超氧化物歧化酶活性被顯著抑制，自由基過多引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加劇，誘導丙二醛含量升高。因此，運輸時間較短時，運輸密度和時間脅迫對單環(huán)刺螠的抗氧化能力影響較小，丙二醛含量變化不顯著[25]。

2.2.3 葡萄糖和乳酸含量

由圖4a 可知，隨脅迫時間的延長，3 個密度組單環(huán)刺螠的乳酸含量整體呈遞增趨勢，60 h 時高密度組達到最大值。24～60 h，3 個密度組單環(huán)刺螠的乳酸含量均顯著高于對照組（P<0.05），并且高密度組呈現(xiàn)脅迫時間越長，乳酸含量越高的趨勢，除24 h 外，其余時間點的高密度組均顯著高于低密度組 （P<0.05）。

圖4 運輸密度和時間對單環(huán)刺螠葡萄糖和乳酸含量的影響Fig.4 Effect of transportation density and time on concentrations of lactic acid and glucose of Urechis unicinctus

由圖4b 可知，除12 和24 h 低密度組，其余各時間點各密度組的葡萄糖含量均顯著高于對照組（P<0.05）。運輸密度脅迫對葡萄糖含量的影響也較大，12～60 h，高密度組葡萄糖含量均顯著高于低密度組和中密度組（P<0.05）。

田興[26]研究發(fā)現(xiàn)，運輸造成斑點叉尾鮰和黃顙魚血糖濃度顯著升高。SCHRECK C B 等[27]也發(fā)現(xiàn)，運輸脅迫會導致大麻哈魚組織中乳酸含量的升高，與本試驗結(jié)果一致。在運輸過程中，低氧條件限制了機體的有氧代謝水平，機體被動進行無氧代謝，加速乳酸的產(chǎn)生和積累。同時，水產(chǎn)動物面臨脅迫，體內(nèi)葡萄糖被大量分解供能，一定程度上促進了肌糖原大量分解，糖異生過程加速，動物體內(nèi)的葡萄糖含量升高，這一動態(tài)平衡解釋了試驗中葡萄糖含量的波動變化趨勢[28-30]。

2.2.4皮質(zhì)醇含量

由圖5 可知，皮質(zhì)醇含量隨著脅迫時間的延長整體呈現(xiàn)上升趨勢。前面檢測的很多指標在12 h 時與對照組相比，并沒有發(fā)生顯著變化，然而皮質(zhì)醇含量在所有時間點，低密度組、中密度組和高密度組的皮質(zhì)醇含量均顯著高于對照組（P<0.05）； 60 h，高密度組的皮質(zhì)醇含量最高，并且顯著高于低密度組和中密度組（P<0.05）。

皮質(zhì)醇作為一種重要應(yīng)激激素，可以有效地反映水產(chǎn)動物的應(yīng)激程度[31]。很多研究表明，脅迫會導致血漿皮質(zhì)醇含量的上升[32-35]。KLUG J J 等[36]發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖條件會引起虹鱒幼魚血液中皮質(zhì)醇濃度上升。在脅迫狀態(tài)下，一方面，作為一種應(yīng)激激素，皮質(zhì)醇的分泌量會隨著應(yīng)激強度的增大而增加；另一方面，皮質(zhì)醇含量增加，在一定程度上可以刺激糖的合成和糖原分解，引起血糖濃度升高，產(chǎn)生大量能量來滿足自身的能量需求，這與本實驗各組葡萄糖含量隨時間延長而升高是一致的[37-38]。

3 結(jié)束語

無水?；钸\輸?shù)拿芏群蜁r間不僅會影響單環(huán)刺螠的品質(zhì)和口感，還會影響其免疫力、酶活力及代謝能力。運輸時間過長，運輸密度過大，會引起單環(huán)刺螠持續(xù)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導致單環(huán)刺螠體壁過度收縮，口感下降。同時，長時間脅迫引起的應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)刺激機體產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，促使單環(huán)刺螠的特異性和非特異性免疫能力下降，增加對病原的敏感程度，機體抗氧化能力減弱，甚至導致死亡。因此，在單環(huán)刺螠的?；钸\輸過程中，應(yīng)根據(jù)實際情況選擇合適的運輸方式，較佳的無水?；钸\輸條件：運輸時間<24 h、中密度運輸<1.0 kg/L，以減緩生理應(yīng)激，提高單環(huán)刺螠運輸質(zhì)量。

圖5 運輸密度和時間對單環(huán)刺螠皮質(zhì)醇含量的影響Fig.5 Effect of transportation density and time on concentration of cortisol of Urechis unicinctus

［1］劉峰，孫濤，紀元，等.單環(huán)刺螠生物學及生態(tài)學研究進展[J].海洋科學，2017，41（10）：125-131.LIU Feng，SUN Tao，JI Yuan，et al.Advances in studies on the biology and ecology ofUrechis unicinctus[J].Marine Sciences，2017，41（10）：125-131.