響應面法優(yōu)化超聲輔助提取藍莓多糖工藝研究

韋明杰, 叢 健

(云南華測檢測認證有限公司，云南 昆明 650000)

藍莓（Blueberry）為被子植物門（Magno?liophyta），雙子葉植物綱（Magnoliopsida），杜鵑花目（Ericales），杜鵑花科（Ericaceae），越橘屬（Vaccinium）越橘亞屬V. （Vac?cinium）。原生于北美洲與東亞，現(xiàn)階段人工培育藍莓，果實較大，水分較多，但花青素含量相對偏低。藍莓是一種具有較強抗氧化性的水果［1］，對衰老、癌癥和心臟疾病能發(fā)揮其抗氧化作用；此外，藍莓具有緩解視疲勞、改善視力的功效，并能在一定程度上延緩腦神經(jīng)衰老，從而增強人體記憶力［2］。研究表明，藍莓多糖具有強抗氧化性、抗疲勞性、抑制有害菌生長等多種生物活性的功效［3］，因而被應用于各種營養(yǎng)保健飲品中。目前國內(nèi)已有很多學者將藍莓多糖提取作為重點研究課題，研究方法多以浸提法為基礎(chǔ)，也有將纖維素酶法和超聲波輔助法從提取花色苷后的藍莓殘渣中提取多糖［4］的報道，但超聲輔助提取藍莓多糖的報道較少。為藍莓多糖在食品加工中的應用提供參考，以經(jīng)高濃度乙醇脫脂的藍莓為原料，通過響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取藍莓多糖的工藝，選定最優(yōu)的提取條件組合，以保障提取完全的同時，有效節(jié)約資源與成本。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮藍莓果：于昆明永輝超市海樂世界店購買，采購后至實驗室進行清洗、搗碎。

試劑：葡萄糖（AR，500 g/瓶）、苯酚（AR，500 mL/瓶）、無水乙醇（AR，500 mL/瓶，≥99.7%）、水楊酸，購于凱諾商貿(mào)有限公司，天津大茂化學試劑廠生產(chǎn)；硫酸（AR，500 mL/瓶，95%～98%），購于凱諾商貿(mào)有限公司，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)；硫酸亞鐵：購于天津科密歐試劑有限公司；DPPH（2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基），購于安徽酷爾生物工程有限公司。

儀器：KQ-600VDE 超聲清洗機，昆山舒美超聲儀器有限公司；UV-2600 紫外分光光度計，日本島津公司Shimadzu；MS105DU電子天平，瑞士梅特勒公司；N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社北京代表處EYELA；TD5ZLD5-2B 臺式離心機，北京京立離心機有限公司；冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藍莓多糖的提取 取新鮮藍莓搗碎，用無水乙醇脫脂，將脫脂后的藍莓渣烘干研粉備用。稱取25 g 脫脂藍莓，放置在加有純水的超聲清洗機中，利用超聲波震蕩輔助提取，反復提取3次。合并3 次的提取液，并濃縮到100 mL ，隨后使用95%乙醇調(diào)整至混合液含醇量約80%，4 ℃條件下醇沉，取出后離心，取沉淀物用少量純水進一步溶解，將溶解物離心過濾，得上清液，濃縮并二次醇沉，醇沉后用冷凍干燥機進行冷凍干燥，最后得到藍莓粗多糖。

1.2.2 藍莓多糖含量檢測 將葡萄糖濃度（C）和檢測吸光度（A）分別作為X/Y 坐標，引入標準曲線方程（A＝10.167C＋0.001 2，R2＝0.999 8）。將上述1.2.1 所得的多糖配制成固定濃度（1.0 mg/mL），依據(jù)文獻［3］的方法進行檢測。將測出的吸光度值A(chǔ)帶入回歸方程，求多糖含量，以計算多糖提取率［5］。計算公式：

1.2.3 單因素試驗

1）料液比。固定提取條件為超聲功率60 W 、提取溫度60 ℃、提取時間85 min，分析在液料比為1∶5（g/mL，下同）、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 下藍莓多糖提取率的變化。

2） 提取溫度。 固定料液比1∶25（g/mL）、超聲功率65 W 、提取時間90 min，分析在提取溫度為55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃時藍莓多糖提取率的變化。

3）提取時間。固定料液比1∶25、超聲功率60 W、提取溫度85 ℃時，分析提取時間為70 min、75 min、80 min、85 min、90 min 時藍莓多糖提取率的變化。

4） 提取功率。 固定料液比1∶25（g/mL）、提取時間85 min、提取溫度60 ℃，分析提取功率為55 W、60 W、65 W、70 W、75W時藍莓多糖提取率的變化。

1.2.4 響應面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上做響應面優(yōu)化設(shè)計，固定料液比1∶25（g/mL），以提取溫度（A）、提取時間（B）、超聲功率（C）為變量因子，設(shè)置3 個水平，進行響應面試驗，其因素水平表見表1。

表1 超聲輔助提取藍莓多糖的響應面試驗因素及水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Origin 2018 對試驗數(shù)據(jù)進行處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對藍莓多糖提取率的影響

從圖1可知，不同料液比、提取溫度、提取時間及超聲功率下，藍莓多糖提取率的變化。

圖1 不同料液比、提取溫度、提取時間及提取功率下的藍莓多糖提取率

2.1.1 料液比 料液比從1∶5（g/mL）增加至1∶25（g/mL），藍莓多糖提取率明顯提升，并在料液比為1∶25達到峰值，為9.47% ；料液比從1∶25 增加至1∶40（g/mL），隨料液比增大，藍莓多糖的提取率不再有顯著變化?？紤]到試劑的損耗和提取工作時長，最優(yōu)選取料液比1∶25（g/mL）進行提取操作。在后續(xù)的單因素試驗時統(tǒng)一選取料液比1∶25（g/mL）進行試驗。

2.1.2 提取溫度 藍莓多糖的提取率隨提取溫度的升高呈上升趨勢，當提取溫度為60 ℃時，提取率達到最大值，為10.15% 。繼續(xù)升高提取溫度至65 ℃時，藍莓多糖的提取率反而略有下降，但總體趨于平穩(wěn)，考慮能耗和升溫時長等因素，提取溫度以60 ℃為宜。

2.1.3 提取時間 提取時間75～85 min時，藍莓多糖的提取率明顯提升，并在提取85 min 時達到最大值，為10.46%。但在提取時間超過85 min時，多糖提取率不再提升，長時間提取會造成時間浪費，于工藝優(yōu)化不利。因此，最佳提取時間選擇85 min。

2.1.4 超聲功率 超聲功率由55 W上升至75 W，藍莓多糖的提取率隨超聲功率增大而呈上升趨勢，在提取功率60 W 時達最大值，為10.52% 。但超聲功率超過60 W，藍莓多糖的提取率會下降，當功率超過70 W 后，提取率降低明顯。因此藍莓多糖提取的最適宜超聲功率為60 W。

2.2 響應面試驗優(yōu)化藍莓多糖的提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性分析 從表2可知不同處理的藍莓多糖提取率。對表2數(shù)據(jù)進行擬合分析得線性回歸方程模型為：

表2 響應面試驗各處理參數(shù)及其藍莓多糖提取率

Y＝10.58+0.20A+0.095B+0.13C－0.040AB+0.17AC－0.025BC－0.25A2－0.14B2－0.53C2

從表3 可知，回歸模型F＝37.86，模型P＜0.000 1，回歸方程極顯著，失擬項F＝0.873 3（F＞0.05）不顯著，判定該回歸方程是可信的，具備預測試驗真實性的能力。模型擬合度為97.99%，可信度超過90%，綜上數(shù)據(jù)可知，該模型用于預估藍莓多糖提取率具有可行性。單因素溫度的P＜0.01，極為顯著；F值排序FA＝46.43＞FC＝20.11＞FB＝10.74，因此，各因素對藍莓提取率的影響依次為A＞C＞B。

表3 響應面回歸方程方差及顯著性分析

2.2.2 不同因素的交互作用 由圖2 可看出，提取時間與提取溫度交互作用時，在提取功率60 W 不變時，藍莓多糖提取率在提取溫度升高的條件下隨之增大，在提取溫度60 ℃、提取時間85 min，響應面圖出現(xiàn)一個最高點，即藍莓多糖提取率達到最大值，這與單因素試驗結(jié)果一致。在提取時間85 min 不變的條件下，藍莓多糖提取率隨提取溫度和提取功率增大而提高，在功率達60 W 時，提取溫度在60 ℃等高線上出現(xiàn)極值點，即藍莓多糖提取率的最大值。60 ℃提取溫度基礎(chǔ)上繼續(xù)升高提取溫度，藍莓多糖提取率略顯下降，但同一條件下增大提取功率，藍莓多糖提取率卻呈明顯下降趨勢。當提取溫度恒定為60 ℃，提取功率與提取時間的交互作用下，隨著提取時間的延長，藍莓多糖提取率增高，但當提取時間達85 min 后，藍莓多糖提取率無顯著的變化，和單因素試驗結(jié)果相符，表明提取時間80 min 后延長提取，對藍莓多糖提取率提升影響不明顯，同響應面方差分析結(jié)果一致。但藍莓多糖提取率會隨著提取超聲功率增大而提高，當超聲功率達60 W 時，出現(xiàn)峰值，隨后增大超聲功率，藍莓多糖提取率反而明顯降低。通過以上分析可知，在料液比1∶25（g/mL）的條件下，提取溫度、時間、功率中某兩個單因素不改變，提取溫度對藍莓多糖提取率的影響是最大的，其次是提取功率，而提取時間達到一定時間后，對藍莓多糖提取率影響甚微，方差分析結(jié)果也驗證了這一結(jié)論，進而證明所建模型的可靠性。

圖2 不同因素交互作用的響應面

2.2.3 最佳提取條件的確定 驗證響應面回歸方程，求一次偏導。聯(lián)立方程，可解出理論最優(yōu)參數(shù)，結(jié)合試驗情況，將參數(shù)調(diào)整為整值，得到藍莓多糖優(yōu)化提取工藝參數(shù)為提取溫度60 ℃、超聲功率60 W、提取時間85 min。經(jīng)過3次平行試驗，藍莓多糖平均提取率為10.61%，將該理論參數(shù)代入模型，計算出提取率理論值為10.58%。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應面試驗對超聲輔助提取藍莓多糖的工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明，超聲輔助提取藍莓多糖的最佳工藝為料液比1∶25（g/mL），提取溫度60 ℃、超聲功率60 W、提取時間85 min。該工藝條件下，藍莓多糖的平均提取率實際值為10.61%，與響應面模型計算出的提取率理論值為10.58%進行對比，相差較小，表明建立的回歸模型可靠，適用于藍莓多糖的優(yōu)化提取。