基于OPG/RANKL/RANK信號通路探究“引血下行法”調(diào)控激素性股骨頭壞死骨代謝表達的影響

區(qū)志堅 李希文 邱華耀 黃思聰 林爍 李逸群

1佛山市第二人民醫(yī)院骨科（廣東佛山 528000）；2佛山市南海區(qū)第七人民醫(yī)院中醫(yī)科（廣東佛山 528231）

激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecro?sis of the femoral head，SONFH）是指應(yīng)用糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC，以下簡稱激素）導(dǎo)致股骨頭組織破環(huán)、骨結(jié)構(gòu)塌陷和髖關(guān)節(jié)功能障礙的骨科疾病，其中最主要的病理改變是骨髓造血功能衰竭、組織脂肪化和成骨細胞凋亡［1-3］。隨著臨床過度使用激素類藥物，SONFH 成為一種高發(fā)疾病［4］，其疼痛程度和高致殘率對患者的生活質(zhì)量影響極大。

目前對于SONFH 的發(fā)病原理尚未達成統(tǒng)一認識，涉及骨細胞凋亡、血管內(nèi)凝血、脂代謝紊亂、髓內(nèi)壓增高、骨質(zhì)疏松現(xiàn)象、基因調(diào)控等假設(shè)和學說［5］。在多種發(fā)病原理中，共同的病理環(huán)節(jié)是骨細胞活性異常。破骨細胞（osteoclast，OC）起骨吸收作用，成骨細胞（osteoblast，OB）則起骨積累作用，生理條件下OC 與OB 的活性維持動態(tài)平衡，從而維持正常的骨代謝和骨量。研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，大劑量或長時間的激素對OB/OC 平衡產(chǎn)生影響，OC活性增強導(dǎo)致骨量損失，OB 活性減退導(dǎo)致骨分化受阻，并在長期應(yīng)力作用下，骨小梁壞死斷裂，股骨頭血供不良，形成骨壞死和骨塌陷的結(jié)果。研究［8-9］顯示，OPG/RANKL/RANK 信號通路對體內(nèi)OB/OC 的平衡具有重要的調(diào)節(jié)作用。骨保護蛋白（osteoprotegerin，OPG）是一種由OB 和骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM?SCs）分泌的糖蛋白，參與骨代謝。NF-κB 配體激活因子（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）由OB 分泌，可特異性結(jié)合位于OC 表面的NF-κB 受體激活因子（receptor activator of NF-κB，RANK），激活OC 的活性，促進細胞成熟、分化，正向調(diào)控OC活動；OPG 可被誘導(dǎo)與RANKL 競爭結(jié)合RANK，降低OC 活性，抑制OC 的分化，負向調(diào)控OC 的功能［10］。OPG 和RANKL 競爭與RANK 結(jié)合可起到雙向調(diào)控OC 的作用，影響OC 的功能，進而調(diào)控骨吸收/骨重建過程［11］。

本課題選用的“引血下行法”代表方是廣東省名老中醫(yī)李逸群教授的經(jīng)驗方——引血下行方，對SONFH 患者“腎之陰陽俱虛、氣滯血瘀困阻”的病機尤為合適。中藥藥理研究發(fā)現(xiàn)［12］，牛膝等具有補腎、引血、活血功效之物能增強人體免疫，減輕GC 的毒副作用，上調(diào)機體內(nèi)分泌水平，抑制OC 骨吸收活性，促進OB 骨重建；還可抑制血小板過度凝集，平調(diào)脂代謝紊亂，降低股骨頭內(nèi)脂肪栓塞的幾率，促進成骨分化的進程，從而防治SONFH。

本研究團隊首創(chuàng)選用廣東省名老中醫(yī)李逸群教授的經(jīng)驗方“引血下行方”作為“引血下行法”代表方，基于“引血下行、活血行氣、溫腎滋陰”的主要治法，從傳統(tǒng)醫(yī)學角度出發(fā)，選擇梯度濃度分組對比，結(jié)合現(xiàn)代SONFH 的發(fā)病機制和可能信息通路進行初步探索，以期研究出可能作用機制。

綜上所述，本研究擬通過觀察引血下行方對SONFH 大鼠的OPG/RANKL/RANK 信號通路的影響，驗證引血下行方治療SONFH 的有效性，探析引血下行方的作用機制及生物靶點，闡釋中醫(yī)“引血下行法”防治SONFH 的療效及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心的雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量為（180 ± 10）g（許可證編號：SCXK（粵）：2018-0002）。本研究在廣東藥科大學中心動物實驗室完成（合格證號：44007200101434）。本課題研究已通過廣東藥科大學實驗動物倫理委員會認證（編號：gdpwlac?spf2017620）。

1.2 藥品、試劑與儀器 引血下行方組成：牛膝25 g，補骨脂20 g，山萸20 g，代赭石15 g，黃芪15 g，生龍骨10 g，生牡蠣10 g，赤芍15 g，桃仁15 g，當歸15 g，丹參 15 g，熟地15 g，龜板10 g。中藥材購自佛山市第二人民醫(yī)院中藥房。原藥材經(jīng)兩次水提后濃縮，制成含生藥濃度1.0 g/mL 的標準制劑，于4 ℃冰箱密封備用。

主要試劑和儀器：脂多糖（Sigma，批號L2880）；甲基潑尼松龍（麥克林公司，批號30013，以下簡稱甲強龍）；無水乙醇（天津市大茂試劑廠，批號SJ-C1-13-01DM-01）；二甲苯（天津市大茂試劑廠，批號SJ-B1-04-01DM）；大鼠OPG Elisa 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號MM-0115R1）；大鼠RANKL Elisa 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號MM-0504R1）；Anti-Osteoprotegerin 抗體（Abcam，批號Ab73400）；Anti-RANKL 抗體（Abcam，批號Ab239607）；重組Anti-TRAF6 抗體（Abcam，批號Ab40675-100）；DAB 顯色試劑盒（康為世紀，批號CW2069S）；抗體稀釋液（Asbio，批號20211118）；石蠟切片機（德國Leica，型號RM2255）；石蠟包埋機（德國Leica，型號EG1160）；病理組織漂烘儀（Histo-line laboratory，型號TEC-2500）；BQ 顯微鏡（Olympus，型號BX51）；實驗室專用超純水機（廣州宇飛儀器有限公司，型號20121720）等。

1.3 實驗前準備 隨機分組：采用隨機數(shù)字表法對SD 大鼠分組，從表中抽選任意數(shù)字起始，沿某一方向依循獲得每只大鼠的隨機數(shù)字，該數(shù)字除以2 求余數(shù)，整除為對照組（C 組），余數(shù)1 為造模組，得C 組10 只，造模組40 只（O 組、H 組、M 組、L 組各10 只）。

1.4 造模 SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進行造模。造模組于大鼠腹腔內(nèi)注射脂多糖（LPS，20 μg/kg），共注射兩次，每次間隔24 h。LPS 注射執(zhí)行24 h后，臀肌注射甲強龍（SM，40 mg/kg），共注射3 次，每次間隔24 h。第2 ～ 6 周，SM 用量減為20 mg/kg，每周一次，共注射5 周；C 組予等劑量、同頻次的生理鹽水注射。每次注射后臀肌肌注8 萬IU 青霉素，過程懸吊飲水。6 周后，兩組各隨機抽取2 只SD 大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟取血處死，并取股骨頭，光鏡下觀測組織形態(tài)學，判斷造模是否成功，證實造模成功后，光鏡下取照。

1.5 SD 大鼠SONFH 模型的鑒定

1.5.1 大體形態(tài)鑒定 造模過程中觀察大鼠一般情況；取股骨頭觀察其關(guān)節(jié)面形態(tài)、軟骨色澤及質(zhì)地、骨面硬度及韌度。

1.5.2 股骨頭標本固定與脫鈣 股骨頭標本置于4%多聚甲醛中，固定2 d，微波輔助快速脫鈣（輻照15 s/h，共輻照8 次/d，溫度維持在41 ～ 43 ℃），當大頭針刺入股骨頭無明顯阻力時說明脫鈣完全，將標本按需分切。

1.5.3 股骨頭標本包埋與制片 快速脫鈣后的標本，予乙醇梯度脫水化、二甲苯透明化處理。常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4 μm，烘片、脫蠟、脫水并染色。參照試劑盒說明書進行HE 染色，中性樹脂封片，光鏡下觀測切片組織形態(tài)。

1.6 藥物干預(yù) 參考大鼠和人體表面積的用藥量換算率，計算出用于大鼠灌胃的引血下行方的低劑量治療組（L 組）、中劑量治療組（M 組）、高劑量治療組（H 組）的含生藥濃度分別為2.5、5、10 g/kg。引血下行方標準液含生藥濃度為1.0 g/mL，則L組、M 組、H 組的灌胃劑量分別為2.5、5、10 mL/kg。灌胃：早晚各1 次/天，共4 周；C 組和O 組則予5 g/kg的生理鹽水灌胃，1 次/d。

1.7 組織樣本取材及形態(tài)學觀察

1.7.1 血液樣本 灌胃4 周后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹腔動脈采血5 ～ 6 mL，置入肝素抗凝管，離心15 min（3 500 r/min），取上清液，置入-20 ℃冰箱中保存。

1.7.2 股骨頭樣本 取SD 大鼠仰臥位，脫毛處理后常規(guī)消毒鋪巾，沿股骨頭大結(jié)節(jié)處作一1.5 cm切口，自外下向內(nèi)上斜切，逐層暴露，小心剝離股骨頭周圍的韌帶軟組織，股骨頸處用咬骨鉗離斷處理，把兩側(cè)股骨頭完整取出，自冠狀面劈成兩半，放入4%多聚甲醛中固定。按1.5.2 所示快速脫鈣，2 d 后使用大頭針刺入股骨頭中心無明顯阻力時，將其切成1.5 cm × 1.5 cm × 0.5 cm 的組織小塊，包埋，切片及制片，光鏡下進行組織形態(tài)學觀察。

1.8 股骨頭組織OPG、TRAF?6、RANKL 相關(guān)因子檢測

1.8.1 血清學指標檢測 按各檢測試劑盒說明書，分別檢測血清指標如TRAP5b、RANKL、CTX 等相關(guān)指標。

1.8.2 骨組織形態(tài)學檢測 股骨頭組織包埋、切片、制片步驟同前，HE 染色后將切片置于光鏡下鏡檢，采用BQ 圖象分析系統(tǒng)采集圖像，對組織形態(tài)進一步分析。

1.8.3 免疫組化染色及圖像分析 行其中的股骨頭組織分別進行包埋、切片、梯度脫水后，置入沸騰的新鮮配制檸檬酸抗原修護液［pH 為（6.0 ± 0.1）］，原位放置，待其逐漸冷卻后，對其使用雙蒸餾法，漂洗組織3 次，加入按比例稀釋的免疫組化抗體（OPG、RANKL 和TRAF-6）后，將其置于4 ℃冰箱中過夜，用PBS 緩沖液洗滌組織3 次，濾紙吸干殘留的PBS。室溫下將各組織切片產(chǎn)物置于DAB 顯色試劑盒中顯色10 min 后，使用蒸餾水洗滌，使用蘇木素復(fù)染3 min，再使用蒸餾水洗滌。將上述股骨頭組織標本放置于密室陰干后，用中性樹脂進行封片處理。PBS 緩沖液替代一抗，以此作陰性對照，若股骨頭組織標本中出現(xiàn)棕色染色則代表為陽性表達。顯微鏡下對各組切片的染色結(jié)果分別進行觀察，每張切片隨機選取5 個不重疊的等大視野范圍進行觀察，使用BQ 圖象系統(tǒng)采集圖像，使用半定量分析對其染色強度進行分析，同時記錄數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad prism 7 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，并作多重比較。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 股骨頭組織的病理形態(tài)學改變 C 組：軟骨厚度較均勻，軟骨細胞同源，數(shù)量正常，骨小梁結(jié)構(gòu)連續(xù)性好，未見明顯斷裂，罕見的空骨陷窩，骨松質(zhì)內(nèi)造血組織豐富（圖1A1）；脂肪組織含量正常（圖1A2）。O 組：同源的軟骨細胞及細胞基質(zhì)大量減少，甚至消失，可見大量云片狀的壞死細胞，不連續(xù)甚至撕裂的潮線，骨小梁結(jié)構(gòu)破壞、缺失，骨質(zhì)分解為云片狀的黑色壞死組織（圖1B1）；脂肪組織增生明顯（圖1B2）。L 組：同源的軟骨細胞及細胞基質(zhì)大量減少，破骨性吸收陷窩較多，骨髓組織較少，已分解的碎裂的黑色壞死組織，骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏斷裂，部分分解為片狀組織（圖1C1）；松質(zhì)骨內(nèi)眾多脂肪細胞填充（圖1C2）。M 組：同源軟骨細胞及細胞基質(zhì)部分減少，軟骨內(nèi)骨髓腔形成，破骨性吸收，骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏或斷裂，造血組織減少，少量分解的骨性黑色壞死物（圖1D1）；松質(zhì)骨內(nèi)較多脂肪細胞堆積（圖1D2）。H 組：軟骨細胞排列混亂，軟骨基質(zhì)不均勻，致密結(jié)締組織增生滿布，軟骨層內(nèi)靜脈竇或血管充血擴張，部分已機化或栓塞，腔內(nèi)炎性細胞集中，部分機化血管周圍可見新生類骨質(zhì)，骨小梁結(jié)構(gòu)基本連續(xù)（圖1E1）；骨髓腔內(nèi)存在少量脂肪細胞（圖1E2）。

圖1 骨形態(tài)圖（4×10 倍）和脂肪細胞形態(tài)（10×10 倍）Fig.1 Bone morphology （4×10） and morphology of adipocytes （10×10）

通過本研究對比發(fā)現(xiàn)，引血下行方具有促進成骨組織新生的作用，改善骨小梁連續(xù)性，而高劑量療效最為顯著。

2.2 光鏡下股骨頭的組織形態(tài) 脂肪細胞數(shù)量方面，C 組、M 組、H 組顯著低于O 組（P< 0.05），L 組與O 組對比差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）；脂肪細胞密度方面，C 組及各劑量治療組均顯著低于O 組（P< 0.05）；骨髓腔面積方面，C 組骨髓腔面積小于O 組（P< 0.05），各劑量治療組與O 組差異均無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）。見表1。

表1 各組光鏡下股骨頭的組織形態(tài)Tab.1 Histomorphology of femoral head under light microscopy in each group ±s

表1 各組光鏡下股骨頭的組織形態(tài)Tab.1 Histomorphology of femoral head under light microscopy in each group ±s

注：C組、L組、M組、H組分別與O組進行t檢驗。a：t = 31.04，P = 0.000 1；b：t = 1.31，P = 0.21；c：t = 4.18，P = 0.001；d：t = 7.34，P = 0.000 1；e：t = 66.95，P = 0.000 1；f：t = 5.26，P = 0.000 1；g：t = 9.80，P = 0.000 1；h：t = 15.16，P = 0.000 1；i：t = 2.39，P = 0.03；j：t = 0.85，P = 0.41；k：t = 0.20，P = 0.84；l：t = 0.45，P = 0.66

H組（n = 10）217.44 ± 7.75d 148.02 ± 4.56h 1.47 ± 0.01l脂肪細胞數(shù)量脂肪細胞密度（mm2）骨髓腔面積（mm2）C組（n = 10）33.11 ± 6.01a 25.22 ± 3.04e 1.31 ± 0.10i O組（n = 8）272.75 ± 22.35 187.71 ± 6.55 1.45 ± 0.14 L組（n = 10）260.10 ± 18.78b 173.14 ± 5.22f 1.50 ± 0.11j M組（n = 10）235.56 ± 15.42c 160.96 ± 5.05g 1.46 ± 0.06k

2.3 股骨頭組織的OPG、RANKL表達水平 C組、L 組、M 組、H 組的OPG、RANKL 的表達水平及OPG/RANKL 比值均低于O 組，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），見表2。

表2 各組股骨頭組織的OPG、RANKL 表達水平Tab.2 OPG and RANKL expression levels in femoral head tissues of each group±s

表2 各組股骨頭組織的OPG、RANKL 表達水平Tab.2 OPG and RANKL expression levels in femoral head tissues of each group±s

注：C組、L組、M組、H組分別與O組進行t檢驗。a：t = 8.66，P = 0.000 1；b：t = 7.91，P = 0.000 1；c：t = 8.46，P = 0.000 1；d：t = 11.05，P = 0.000 1；e：t = 7.31，P = 0.000 1；f：t = 3.30，P = 0.005；g：t = 7.74，P = 0.000 1；h：t = 8.59，P = 0.000 1；i：t = 12.10，P = 0.000 1；j：t = 8.00，P = 0.000 1；k：t =12.50，P = 0.000 1；l：t = 16.74，P = 0.000 1

H組（n = 10）836.67 ± 24.58d 291.97 ± 11.05h 2.87 ± 0.11l OPG（ng/L）RANKL（pmol/L）OPG/RANKL C組（n = 10）847.44 ± 44.09a 288.47 ± 16.98e 2.94 ± 0.20i O組（n = 8）683.06 ± 30.68 343.67 ± 12.94 1.99 ± 0.10 L組（n = 10）802.00 ± 29.43b 320.97 ± 14.53f 2.50 ± 0.15j M組（n = 10）852.82 ± 47.72c 294.49 ± 12.48g 2.90 ± 0.18k

2.4 股骨頭組織的TRAF?6 表達水平 TRAF-6 在C 組、L 組、M 組、H 組的表達水平均顯著低于O 組（P< 0.01），見表3。

表3 各組股骨頭組織的TRAF-6 表達水平Tab.3 TRAF-6 expression levels in femoral head tissues of each group±s

表3 各組股骨頭組織的TRAF-6 表達水平Tab.3 TRAF-6 expression levels in femoral head tissues of each group±s

注：C組、L組、M組、H組分別與O組進行t檢驗比較，a：t = 19.72，P = 0.000 1；b：t = 3.19，P = 0.007；c：t = 13.25，P = 0.000 1；d：t = 8.53，P = 0.000 1

TRAF-6（U/L）H組7.86 ± 0.38d C組6.56 ± 0.31a O組9.17 ± 0.21 L組8.67 ± 0.39b M組7.53 ± 0.28c

3 討論

3.1 “引血下行法”組方要義和分析 長期使用GC 的SONFH 患者不僅存在髖部持續(xù)痛，靜息痛，甚者無力，活動受限，難以站立，髖部周圍皮膚出現(xiàn)局部瘀斑或紅斑等股骨頭壞死等股骨頭壞死標志性癥狀及體征，還可出現(xiàn)臉頰部丘疹、紅斑、干燥、萎縮、脫屑、酒渣鼻、痤瘡、色素沉著、紫癜、舌淡白苔膩、脈浮大兼數(shù)，甚至散而無根等“虛陽浮越”之象。中醫(yī)認為，GC 頗具“溫燥浮越”之藥性，而臨床上使用GC 的病種數(shù)不勝數(shù)，長期使用后的患者往往會出現(xiàn)髖部持續(xù)疼痛，腹股溝區(qū)域靜息痛，站立無力，行走不能，往往發(fā)現(xiàn)SONFH 時已病程較長，病情較重。中醫(yī)認為，過用GC 傷陰在所難免，致使腎陰虧空，甚有陰虛火旺，浮越上犯，出現(xiàn)精神萎靡、怕冷畏寒、倦怠疲勞、腰膝酸軟、雙顴潮熱紅斑、頸部虛熱、受涼不能抗、受熱不能忍等腎陰陽兩虛、虛陽浮越之虛實夾雜證。腎陽虛者，五臟六腑失于溫煦，上中下三焦氣血困凝不通，瘀滯經(jīng)脈血絡(luò)，困阻失疏；腎氣虛者，膀胱氣化無源，全身之血液運行困阻，無不停留成瘀；腎陰虛者，藏內(nèi)之陰血虧空，經(jīng)脈血絡(luò)榮養(yǎng)無源，陰血難行而聚為生瘀，腎氣陰陽虧損均能致使血瘀困阻，隔絕浮越之陽與下沉之陰交互，加重腎陰陽兩虛，使得虛陽更難沉降，陰陽失于轉(zhuǎn)化。故SONFH 發(fā)病，乃以正虛為本，先天不足為其發(fā)病之內(nèi)因，邪實則為標，又外遇寒、熱、濕邪侵襲，經(jīng)脈血絡(luò)疏通困難，血瘀乃成，阻礙疏行，濡養(yǎng)失責，陰不斂陽，虛陽浮越，陽虛無以溫旭，氣化失司，陰液耗傷，陰陽失調(diào)，日漸病損，故成此病。因此SONFH 的主要病機為腎虛血瘀。故治療SONFH 需注重補腎以濡養(yǎng)根本，配合化瘀行血之品疏行滯瘀，使得標實得祛，本虛得補，方可大病得除。

本課題選用的“引血下行法”代表方是廣東省名老中醫(yī)李逸群教授的經(jīng)驗方——引血下行方：牛膝25 g，補骨脂20 g，山萸肉20 g，代赭石15 g，黃芪15 g，生龍骨10 g，生牡蠣10 g，赤芍15 g，桃仁15 g，當歸15 g，丹參15 g，熟地15 g，龜板10 g。該方作為”引血下行法”的代表方之一，尤其重視“活血、引血、養(yǎng)腎”之治法，方中牛膝聯(lián)用代赭石可引血下行、益腎養(yǎng)骨，持浮越之虛陽下行于腎，陰陽順調(diào)，治本之功著，乃君藥；桃仁、赤芍、丹參等活血化瘀、驅(qū)邪通骨，化解血脈經(jīng)絡(luò)之瘀留，梳行困阻之氣滯，治標之功顯，屬臣藥；當歸配伍熟地可滋腎陰養(yǎng)血，海深則養(yǎng)龍，陰足則潛陽，滋陰且固陽，龜板、龍骨、牡蠣聯(lián)用滋腎陰潛腎陽而強骨，加強引血下行之力，為佐藥；山萸肉、補骨脂、黃芪等益氣助陽、溫腎壯骨，陽足則陰留，溫煦得當，陰生不斷，亦為佐藥。上述諸藥合用，扶正與驅(qū)邪并用，相得益彰，共奏“引血下行、活血化瘀、溫腎滋陰”之功，對SONFH 患者“腎之陰陽俱虛、氣滯血瘀困阻”之病機，尤為合適。

3.2 引血下行方修復(fù)股骨頭壞死組織及調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK 信號通路的機制探討 HE 染色后，通過光鏡下觀測其股骨頭組織，H 組股骨頭的軟骨層可見新生較大量的類骨質(zhì)組織，骨小梁連續(xù)性結(jié)構(gòu)存在；M 組存在于軟骨層的類骨質(zhì)結(jié)締組織新生部分相對較少，可見少量壞死骨質(zhì)溶解成的黑褐色壞死物質(zhì)。L 組軟骨層則可見較大量的破骨性陷窩，骨小梁連續(xù)性差，甚至呈片狀壞死。通過研究發(fā)現(xiàn)，引血下行方具有促進成骨組織新生的作用，改善骨小梁連續(xù)性，而高劑量療效最為顯著。研究［13］發(fā)現(xiàn)，引血下行類藥物能新生側(cè)支循環(huán)，提高周圍血管通透性，從而改善局部血液微循環(huán)，同時降低脂肪細胞的表達，減緩組織脂肪化的進程，從而促進成骨進程。研究［14］提示，牛膝甾酮作為牛膝的主要有效成分，可有效地激發(fā)大鼠SONFH 骨髓間充質(zhì)干細胞（bone manrrow mesenchymal stemcells，BMSCs）的自噬、成骨分化的進程，這可能與miR-98-5p、CKIP-1 的表達下調(diào)有關(guān)。類似于牛膝、補骨脂、山萸肉等引血、補腎之藥品，可有效下調(diào)OC 的活性，加強OB 的表達，并改善局部血管微循環(huán)，促進軟骨組織增生形成成骨，這可能與OPG/RANKL/RANK 信號通路的雙相調(diào)節(jié)有關(guān)［15-16］。

OPG 和RANKL 來源于BMSCs 和OB，RANK 來源于OC 胞膜上。研究［17］發(fā)現(xiàn)，RANK 競爭性地被OPG/RANKL 結(jié)合，因此OPG/RANKL/RANK 信號通路對OB、OC 活性調(diào)節(jié)以及成熟分化過程具有調(diào)控作用。研究［18-19］表明，BMSCs 可促進OC 的生成，而OC 誘導(dǎo)因子聚集到一定濃度時可使反向抑制OC 的表達活性，通過OPG/RANKL/RANK 信號通路對BMSCs 進行雙向調(diào)節(jié)，協(xié)調(diào)OC 和OB 活性從而達到促骨形成的作用。而本研究數(shù)據(jù)表明，引血下行方能上調(diào)OPG 活性，與RANKL 競爭性結(jié)合，具有明顯的促成骨作用，其中高劑量的引血下行方療效更優(yōu)。

3.3 本研究的局限性及解決方法 本研究亦存在一定局限性，受限于研究資金，所納入研究的本方的中藥種類較少，納入研究的動物數(shù)量尚待增加，研究的信息通路尚可增加，“引血下行方”的梯度濃度可進一步細分研究。今后可加大研究資金投入，進一步加大納入研究的動物數(shù)量，同時增加研究的中藥種類，尤其是引血活血補腎類中藥，引進中藥有效成分萃取和效應(yīng)濃度測定技術(shù)，細化效應(yīng)濃度，推陳出新，明細化有效成分和濃度，后期可進一步研發(fā)出引血下行方的效應(yīng)試劑，如經(jīng)過四期實驗，有望在未來為SONFH 患者提供完善的保髖保守治療的方案，亦可進一步細化研究”引血下行法”治療SONFH 的作用機制，有望闡明”引血下行法”對SONFH 作用的主要信息通路，可大量節(jié)約此類研究的實驗資源，同時提供實驗研究的可信且穩(wěn)定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.4 引血下行方治療機制分析 引血下行方中牛膝具有引血下行、益腎養(yǎng)骨之作用，常用于治療SONFH?，F(xiàn)代藥理學分析牛膝中多種有效成分參與了骨的代謝過程，其中牛膝甾酮可有效抑制OB的增殖活性，上調(diào)堿性磷酸酶活性，促進礦化結(jié)節(jié)形成，上調(diào)OPG 等標志產(chǎn)物的表達，競爭性結(jié)合RANKL來上調(diào)成骨分化相關(guān)基因表達，誘導(dǎo)自噬體形成，誘導(dǎo)OB 往促骨組織的分化［20-22］。研究［23］發(fā)現(xiàn)，補骨脂具有健骨強腎溫陽之功，其主要成分補骨脂素有出色的抗氧化作用，能下調(diào)OC活性，抵抗OC 分離后陷窩數(shù)目的擴張和增加［24］。RANKL 對OB 促骨形成表達有抑制作用，同時會激活OC，而OPG 通過競爭性結(jié)合RANKL 來下調(diào)其活性，進而抑制OC 表達。作為補骨脂的主要有效成分，補骨脂異黃酮可有效抵抗RANKL-NF-KB 通路的介導(dǎo)激活進程，從而控制OC 分化進程，影響OC/OG 分化趨勢，從而減緩骨質(zhì)疏松癥狀［25］。研究［26-28］表明，作為當歸的主要有效成分，當歸多糖可有效抑制OC/OG 凋亡，介導(dǎo)成骨分化能力恢復(fù)，激活OCN、Osterix、BMP 等成骨因子，下調(diào)PPARγ 等成脂因子表達，從而誘導(dǎo)OC/OG往成骨進程分化，促進成骨。

本研究中，引血下行方各劑量治療組的OPG含量明顯高于O 組，RANK/RANKL 表達顯著低于O 組，各劑量治療組TRAF-6 表達顯著低于O 組，表明引血下行方可能通過影響OPG/RANKL/RANK信號通路下調(diào)OC 生成與表達，激活OB 成骨分化進程，改善股骨頭成骨環(huán)境，從而改善SONFH 癥狀，降低SONFH的發(fā)生率。

綜上所述，引血下行方可調(diào)控OC 的活性和OB 的成骨分化進程，改善股骨頭周圍血管凝血環(huán)境，誘導(dǎo)骨小梁促成，從而防治SONFH；其防治SONFH 的可能作用機制存在多靶點效應(yīng)或多樣化效應(yīng)，可能通過OPG/RANKL/RANK 信號通路介導(dǎo)作用，將研究引血活血補腎類中藥對SONFH 修復(fù)作用機制及OC/OB 調(diào)控機制提供方向和參考。

【Author contributions】OU Zhijian is responsible for constructing the research ideas，designing experimental plans，and writing the pa?per.LI Xiwen is responsible for constructing the research ideas，imple?menting the experimental plan，and writing the paper.QIU Huayao，HUANG Sicong and LIN Shuo were responsible for the execution of the experimental plan and writing of the paper for this study.LI Yiqun is responsible for the construction of the research ideas and the design of the experimental plan.All authors read and approved the final manuscript as submitted.